一種用于包被核酸引物的緩沖液及包被核酸引物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于包被核酸引物的緩沖液，按質(zhì)量體積濃度包括，5.3～5.6g/L的磷酸氫二鈉、2.5～3.0g/L的磷酸二氫鈉、0.5～0.8g/L的氯化鈉、25～32g/L的多聚賴氨酸、0.03～0.09g/L的防腐劑和水。采用本發(fā)明的包被緩沖液，能夠有效的減少核酸引物包被的整體時間，又能夠減少復雜的工藝步驟，一步法工藝大大降低的成本效益，而且本發(fā)明的包被緩沖液，大大降低了原料成本，使最終產(chǎn)品的價格更低廉。
【專利說明】
-種用于包被核酸引物的緩沖液及包被核酸引物的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種用于包被核酸引物的緩沖液及包被核酸 引物的制備方法。
【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學的飛速發(fā)展W及生物物理技術的大量應用，利用核酸雜交來進行 腫瘤或癌的診斷、病毒、細菌等感染、W及各種基因疾病的檢測領域中?，F(xiàn)有技術中將核酸 引物包被在微孔板上，如聚苯乙締塑料板，進行腫瘤或癌的診斷、病毒、細菌等感染、W及各 種基因疾病的檢測。
[0003] 核酸引物，又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成 反應時，作為每個多核巧酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核巧酸鏈。包被(Coating), 是將某種化學基團的分子通過化學偶聯(lián)方式均勻涂布在目標材料表面，結合到固相載體表 面的過程。如蛋白質(zhì)與聚苯乙締固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構 上的疏水基因與固相載體表面的疏水基因間的作用。運種物理吸附是非特異性的，受蛋白 質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋 白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。
[0004] 由于近些年生物學發(fā)展迅速，W及生物物理技術的大量應用，對包被核酸引物的 需求量也在快速提高，同時，對包被核酸引物的價格也日趨降低。然而，現(xiàn)有工藝技術耗時 太長，平均耗時在4~5天左右，并且工藝技術太過于復雜，反復洗板步驟，平均工藝下來每 塊板需要洗板15次左右，而且現(xiàn)有的工藝技術材料消耗成本太高，包被所用的試劑成本太 高，需要進口，并且價格昂貴。
[0005] 因此，如何找到一種包被核酸引物的制備方法，能夠減少核酸引物包被的整體時 間，降低時間成本，又能夠減少復雜的工藝步驟，已成為行業(yè)內(nèi)具有前瞻意識的生產(chǎn)廠家亟 待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種用于包被核酸引物的緩沖液及 包被核酸引物的制備方法，本發(fā)明提供的核酸引物的包被方法，能夠有效的減少核酸引物 包被的整體時間，又能夠減少復雜的工藝步驟。
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于包被核酸引物的緩沖液，按質(zhì)量體積濃度包括：
[000引
[0009] 優(yōu)選的，所述緩沖液還包括16~18g/L的硫酸鋼。
[0010] 優(yōu)選的，所述緩沖液還包括2-琉基乙醇；
[0011] 所述2-琉基乙醇的質(zhì)量體積濃度為0.35~0.46g/L。
[0012] 優(yōu)選的，所述防腐劑為疊氮鋼和/或ProClin300。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種包被核酸引物的制備方法，包括W下步驟：
[0014] A)將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液；
[0015] 將憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、多聚賴氨酸、氯化鋼、防腐劑和水混合后，得到緩沖 液；
[0016] B)將上述步驟得到的混合液和緩沖液再次混合后，得到包被混合液；
[0017] C)將上述步驟得到的包被混合液放入包被板后進行包被，得到包被后的核酸引 物。
[0018] 優(yōu)選的，所述混合液中，所述核酸引物的濃度為3~化g/mL。
[0019] 優(yōu)選的，所述包被混合液中，所述核酸引物的濃度為1.5~2.化g/mL。
[0020] 優(yōu)選的，所述包被的時間為18~25h;所述包被的溫度為0~37°C ;
[0021 ]所述包被板為多孔微孔聚苯乙締板。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟A)具體為：
[0023] 將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液；
[0024] 將憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼與水攬拌混合，再加入多聚賴氨酸，再加入硫酸鋼、氯 化鋼和防腐劑后，得到緩沖液。
[00巧]優(yōu)選的，所述包被后還包括處理步驟：
[0026] 用PBS緩沖液清洗所述包被板，洗涂1~3遍后干燥；
[0027] 所述干燥的時間為4~化;所述干燥的濕度為10 %~35 %畑。
[0028] 本發(fā)明提供了一種用于包被核酸引物的緩沖液，按質(zhì)量體積濃度包括，5.3~ 5.6g/L的憐酸氨二鋼、2.5~3. Og/L的憐酸二氨鋼、0.5~0.8g/L的氯化鋼、25~32g/L的多 聚賴氨酸、0.03~0.09g/L的防腐劑和水。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有效的減少核酸引物包 被的整體時間，將現(xiàn)有的核酸引物包被工藝，從平均耗時在4~5天，提升到平均耗時在1天 左右，大大提高了生產(chǎn)的通量;而且能夠減少復雜的工藝步驟，現(xiàn)有工藝需要反復洗板，平 均整個工藝每塊包被板需要洗板15次左右，而本發(fā)明的平均洗板步驟需要6次左右，大大降 低了工藝復雜性，更適合作為標準工藝推廣;此外，現(xiàn)有的包被緩沖液價格昂貴，而本發(fā)明 的包被緩沖液，大大降低了原料成本，使最終產(chǎn)品的價格更低廉。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實施例1中驗證實驗信噪比數(shù)據(jù)圖。
【具體實施方式】
[0030] 為了進一步了解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行描述，但 是應當理解，運些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點而不是對本發(fā)明專利要求的 限制。
[0031] 本發(fā)明所有原料，對其來源沒有特別限制，在市場上購買的或按照本領域技術人 員熟知的常規(guī)方法制備的即可。
[0032] 本發(fā)明所有原料，對其純度沒有特別限制，本發(fā)明優(yōu)選采用分析純。
[0033] 本發(fā)明所有原料，其牌號和簡稱均屬于本領域常規(guī)牌號和簡稱，每個牌號和簡稱 在其相關用途的領域內(nèi)均是清楚明確的，本領域技術人員根據(jù)牌號、簡稱W及相應的用途， 能夠從市售中購買得到或常規(guī)方法制備得到。
[0034] 太貨巧梅化下一釉巧干甸獻核瞞引物的緩沖漏.按席音化巧濃底甸巧；
[0035]
[0036]
[0037] 本發(fā)明所述憐酸氨二鋼的加入量優(yōu)選為5.3~5.6g/L，更優(yōu)選為5.35~5.55g/L， 最優(yōu)選為5.4~5.5g/l;本發(fā)明對所述憐酸氨二鋼沒有特別限制，W本領域技術人員熟知的 憐酸氨二鋼即可。本發(fā)明所述憐酸二氨鋼的加入量優(yōu)選為2.5~3.Og/L，更優(yōu)選為2.6~ 2.9g/L，最優(yōu)選為2.7~2.8g/M本發(fā)明對所述憐酸二氨鋼沒有特別限制，W本領域技術人 員熟知的憐酸二氨鋼即可。本發(fā)明所述氯化鋼的加入量優(yōu)選為0.5~0.8g/L，更優(yōu)選為0.55 ~0.75g/L，最優(yōu)選為0.6~0.7g/l;本發(fā)明對所述氯化鋼沒有特別限制，W本領域技術人員 熟知的氯化鋼即可。本發(fā)明所述多聚賴氨酸的加入量優(yōu)選為25~32g/L，更優(yōu)選為26~31g/ L，更優(yōu)選為27~30g/L，最優(yōu)選為28~29g/l;本發(fā)明對所述多聚賴氨酸沒有特別限制，W本 領域技術人員熟知的多聚賴氨酸即可。本發(fā)明所述多防腐劑的加入量優(yōu)選為0.03~0.09g/ L，更優(yōu)選為0.04~0.08g/L，最優(yōu)選為0.05~0.07g/l;本發(fā)明對所述防腐劑沒有特別限制， W本領域技術人員熟知的防腐劑即可，本發(fā)明優(yōu)選為疊氮鋼和/或ProClin300。
[0038] 本發(fā)明為提高緩沖液在包被核酸引物過程中的使用效果，優(yōu)選還包括硫酸鋼，所 述硫酸鋼的加入量優(yōu)選為16~18g/L，更優(yōu)選為16.2~17.8g/L，最優(yōu)選為16.5~17.5g/l; 優(yōu)選還包括2-琉基乙醇，所述2-琉基乙醇的加入量優(yōu)選為0.35~0.46g/L，更優(yōu)選為0.37~ 0.43g/L，最優(yōu)選為 0.39 ~0.41g/L。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種包被核酸引物的制備方法，包括W下步驟：
[0040] A)將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液；
[0041] 將憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、多聚賴氨酸、氯化鋼、防腐劑和水混合后，得到緩沖 液；
[0042] B)將上述步驟得到的混合液和緩沖液再次混合后，得到包被混合液；
[0043] C)將上述步驟得到的包被混合液放入包被板后進行包被，得到包被后的核酸引 物。
[0044] 本發(fā)明所述制備方法中，所述原料的具體優(yōu)選方案，W及加入份數(shù)的優(yōu)選數(shù)值與 前述緩沖液中組分的具體優(yōu)選方案，W及加入份數(shù)的優(yōu)選數(shù)值均一致，在此不再一一寶述。
[0045] 本發(fā)明首先將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液;將憐酸氨二鋼、憐酸二氨 鋼、多聚賴氨酸、氯化鋼、防腐劑和水混合后，得到緩沖液。本發(fā)明對所述核酸引物沒有特別 限制，W本領域技術人員熟知的核酸引物即可;本發(fā)明對所述TE緩沖溶液沒有特別限制，W 本領域技術人員熟知的TE緩沖溶液即可，即由Tris和抓TA配置而成的，其pH值本領域技術 人員可W根據(jù)實際生產(chǎn)情況、產(chǎn)品要求W及質(zhì)量要求進行選擇和調(diào)整，本發(fā)明所述TE緩沖 溶液的抑值優(yōu)選為7.0~8.0，更優(yōu)選為8.0。本發(fā)明對所述混合液中，核酸引物的濃度沒有 特別限制，本領域技術人員可W根據(jù)實際生產(chǎn)情況、產(chǎn)品要求W及質(zhì)量要求進行選擇和調(diào) 整，本發(fā)明所述核酸引物的濃度優(yōu)選為3~化g/mL，更優(yōu)選為3.3~4.化g/mL，更優(yōu)選為3.6 ~4.4]ig/mL，最優(yōu)選為3.9~4. Ijig/mL。
[0046] 本發(fā)明將憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、多聚賴氨酸、氯化鋼、防腐劑和水混合后，得到 緩沖液，本發(fā)明為提高緩沖液的混合效果和使用效果，優(yōu)選將憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼與水 攬拌混合，再加入多聚賴氨酸，再加入硫酸鋼、氯化鋼和防腐劑后，得到緩沖液，更具體的優(yōu) 選為先加入憐酸氨二鋼和憐酸二氨鋼溶液，后加入多聚賴氨酸，待溶液澄清后再加入易溶 解的防腐劑、硫酸鋼和氯化鋼試劑，最后避光常溫磁力攬拌2~3小時后，得到緩沖液。
[0047] 本發(fā)明然后將上述步驟得到的混合液和緩沖液再次混合后，得到包被混合液。本 發(fā)明對所述包被混合液中，核酸引物的濃度沒有特別限制，本領域技術人員可W根據(jù)實際 生產(chǎn)情況、產(chǎn)品要求W及質(zhì)量要求進行選擇和調(diào)整，本發(fā)明所述包被混合液中核酸引物的 濃度優(yōu)選為1.5~2.扣g/血，更優(yōu)選為1.6~2.化g/mL，更優(yōu)選為1.7~2.化g/mL，最優(yōu)選為 1.9~2.lyg/mL。
[0048] 本發(fā)明最后將上述步驟得到的包被混合液放入包被板后進行包被，得到包被后的 核酸引物，即包被核酸引物。本發(fā)明所述包被的時間優(yōu)選為18~25h，更優(yōu)選為19~24h，最 優(yōu)選為20~23h;所述包被的溫度優(yōu)選為0~37°C，更優(yōu)選為5~30°C，更優(yōu)選為10~25°C，最 優(yōu)選為15~20°C。本發(fā)明對所述包被板沒有特別限制，W本領域技術人員熟知的用于包被 過程的包被板即可，本發(fā)明優(yōu)選為多孔微孔聚苯乙締板，更優(yōu)選為96孔微孔聚苯乙締塑料 板。本發(fā)明為保證包被效果，還優(yōu)選提前對包被板進行處理，本發(fā)明對所述處理步驟沒有特 別限制，本領域技術人員可W根據(jù)實際生產(chǎn)情況、產(chǎn)品要求W及質(zhì)量要求進行選擇和調(diào)整， 由于本發(fā)明所公開的緩沖液，本發(fā)明的處理步驟僅需使用IX的PBS溶液(pH 8.2)清洗96孔 聚苯乙締塑料板S遍即可，再離屯、1200rpm，2min左右，確保板內(nèi)無殘留液體，放置干燥箱箱 中待用即可。
[0049] 本發(fā)明對所述放入的方式?jīng)]有特別限制，本領域技術人員可W根據(jù)實際生產(chǎn)情 況、產(chǎn)品要求W及質(zhì)量要求進行選擇，本發(fā)明優(yōu)選為注入，更具體優(yōu)選為采用包被機或者校 準過的多通道移液器等分至每孔中。本發(fā)明對所述包被混合液的用量沒有特別限制，本發(fā) 明優(yōu)選為100~15化L。本發(fā)明所述包被過程更具體優(yōu)選為采用包被機或者校準過的多通道 移液器等分至每孔中，每孔加入包被混合液100~15化L，用錫錐紙或者保鮮膜密封板，并放 置在4度冰箱中過夜包被。
[0050] 本發(fā)明所述包被后優(yōu)選還包括處理步驟，所述處理步驟優(yōu)選為，采用PBS緩沖液清 洗所述包被板，洗涂1~3遍后干燥，更具體優(yōu)選為使用IX的PBS溶液(pH 8.2)清洗96孔聚苯 乙締塑料板3遍，離屯、1200巧m，2min左右，確保板內(nèi)無殘留液體，放置干燥箱中干燥4~9小 時;本發(fā)明所述干燥的濕度優(yōu)選為10 %~35 %畑，更優(yōu)選為15 %~30 % RH，最優(yōu)選為20 %~ 25% 畑。
[0051] 本發(fā)明提供了一種用于包被核酸引物的緩沖液和包被核酸引物的制備方法，即緩 沖液的應用方法。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有效的減少核酸引物包被的整體時間，又能夠減 少復雜的工藝步驟，一步法工藝大大降低的成本效益，而且本發(fā)明的包被緩沖液，大大降低 了原料成本，使最終產(chǎn)品的價格更低廉。實驗結果表明，本發(fā)明將現(xiàn)有的核酸引物包被工 藝，從平均耗時在4~5天，提升到平均耗時在1天左右，大大提高了生產(chǎn)的通量;而且現(xiàn)有工 藝需要反復洗板，平均整個工藝每塊包被板需要洗板15次左右，而本發(fā)明的平均洗板步驟 需要6次左右，大大降低了工藝復雜性，更適合作為標準工藝推廣;此外，而本發(fā)明的包被緩 沖液，大大降低了原料成本，使最終產(chǎn)品的價格更低廉。
[0052] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明提供的一種用于包被核酸引物 的緩沖液及包被核酸引物的制備方法進行說明，本發(fā)明的保護范圍不受W下實施例的限 制。
[0053] 實施例中所述材料均由市售購得，其牌號與廠家與說明書中所述的牌號與廠家相 一致。
[0化4] 實施例1
[0055]包被緩沖液在板式化學發(fā)光領域的應用；
[0化6] 步驟1:首先設計一種包被引物核酸序列（5'-NH2-GAGCGGATATATGCTTAGGAAT-3'）， 合成該序列并溶解在PH為8.0的TE緩沖溶液中，將引物稀釋至3ug/mL [0057]步驟2:配制包被緩沖液，按照下述濃度比例，5.6g/L的憐酸氨二鋼、2.8g/L的憐酸 二氨鋼、〇.6g/L的氯化鋼、17g/L的硫酸鋼、28g/L的多聚賴氨酸、0.06g/L的防腐劑和去離子 水，注意，先加憐酸鋼緩沖液，后加入多聚賴氨酸，待溶液澄清后加入易溶解的硫酸鋼和氯 化鋼試劑，避光常溫磁力攬拌2小時；
[005引步驟3:將溶解在TE緩沖液中的引物和配制好的包被緩沖液等比例混合，確保引物 終濃度在1.化g/mL
[0化9]步驟4:使用IX PBS pH 8.2溶液清洗空白的96孔聚苯乙締塑料板S遍，離屯、 120化pm，2min左右，確保板內(nèi)無殘留液體，放置干燥箱箱中待用；
[0060]步驟5:將步驟3中準備的試劑用包被機或者校準過的多通道移液器等分至每孔 中，每孔加入包被混合液10化L，用錫錐紙或者保鮮膜密封板，并放置在實驗室冰箱中4°C過 夜包被。
[0061 ] 步驟6:使用IX PBS PH 8.2溶液清洗96孔聚苯乙締塑料板S遍，離屯、1200巧m 2min左右，確保板內(nèi)無殘留液體，放置干燥箱中干燥5~6小時，得到包被后的核酸引物。
[0062] 步驟7:裝袋密封，加入2g干燥劑，轉(zhuǎn)至成品庫儲存。
[0063] 驗證步驟:設計核酸序列（5'-ATTCCTAAGCATATATCCGCTC-biotin-3'），該序列與上 述實施例1中包被的引物互補，合成該引物，將濃度稀釋至lOOpmol/化。
[0064] 步驟則尋引物稀釋成3個梯度，分別是100pmolAiL，10pmolAiL，lpmolAiL。分別加入 I(K)化到包被板孔內(nèi)。
[0065] 驗證實驗設計方案，參見表1。
[0066] 親 1
[0067]
[006引
[0069] 驗證實驗獲得數(shù)據(jù)，參見表2。
[0070] 表 2 「00711
[0072] 實驗信噪比數(shù)據(jù)參見圖1，圖1為本發(fā)明實施例1中驗證實驗信噪比數(shù)據(jù)圖，由圖1 可知，信號的梯度折式變化明顯，線性范圍良好。
[0073] 包被精密性CV統(tǒng)計，參見表3。
[0074] 表 3 「00751
[0076]由表3可知，包被緩沖液的精密性均在參考值范圍內(nèi)。
[0077]對本發(fā)明提供的緩沖液與現(xiàn)有緩沖液進行正常生產(chǎn)多批次平行實驗，實驗結果參 見表4。
[007引 表4
[0079]
[0<
[0081] 由表4可知，本發(fā)明在精密性、吸附率、線性范圍和高低值范圍均優(yōu)于現(xiàn)有常規(guī)工 藝。
[0082] 實施例2
[0083] 磁珠包被流程：
[0084] 1、將SOOmg氨基(PVA)磁珠加入至Ijl.SndEP管中，用IX pBS清洗3遍；加入0.1 M MES 處理3min;
[00化]2、將磁珠吸附，倒掉MES溶液，加入1ml本發(fā)明提供的包被緩沖液(按照下述濃度比 例，5.5g/L的憐酸氨二鋼、3. Og/L的憐酸二氨鋼、0.7g/L的氯化鋼、18g/L的硫酸鋼、30g/L的 多聚賴氨酸、〇.〇9g/L的防腐劑和去離子水），再加入引物IOOpmol，反應2~3小時；
[0086] 3、加入磁珠封閉劑(JSR，化t#65293)，結束反應，吸附磁珠，倒掉封閉劑；
[0087] 4、1XPBS清洗S遍，將磁珠溶入IX TE緩沖液中，4度待用。
[0088] 至此，完成捕獲磁珠的包被過程。
[0089] 設計一種捕獲探針序列如下，參見表5:
[0090] 表 5
[nnoi1 [
[0093] 設計一種報告探針序列：
[0094] 5 ' -ATGCTTTGACTCAGAGCTACATCGAAGCT-AP-3 '（在3 ' 端偶聯(lián)上一個堿性憐酸酶分子 標）
[0095] 將合成后的CE、LE、化按照1:4:2的比例混合，稀釋成1 OOf mo 1 /u 1作為反應引物，檢 測國家標準物質(zhì)中屯、的標準品（貨號GBW化)090142 )，濃度為4.4* 105 lU/ml。W該標準物質(zhì) 為檢測祀標，對引物混合物命名為"HCV化探針"。對技術的靈敏度和特異性進行驗證。
[0096] 將標準品稀釋成5個梯度，StdA、St地、StdC、St加 、St祀分別是4.4*105IU/ml、4.4* l〇4lU/ml、4.4*l〇3lU/ml、4.4*l〇2lU/ml、4.4*l〇ilU/ml。
[0097] 麗制捻細Il化累，
[009引
[0099 ] 總體系為10〇111 ,每孔加/\t述t不準品化1
[0100] 設計布板如表6所示：
[0101] 表6
[0102]
[i
[0104] 檢測方法：
[0105] 步驟1將上述混合體系的微孔板置入55度恒溫箱中雜交1.0~1.5小時之間，取出 微孔板恢復至室溫，配制好IX的洗脫液，準備進行洗板；
[0106] 步驟2將96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠 1分鐘左右，手托住板架甩出板內(nèi)液 體，再加入200ul的IX洗脫液，如此反復=遍；
[0107] 步驟3取下96孔微孔板磁力架，每孔加入初級放大分子溶液IOOul，置于55度恒溫 箱中放置40分鐘；
[0108] 步驟4將96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠 1分鐘左右，手托住板架甩出板內(nèi)液 體，再加入200ul的IX洗脫液，如此反復=遍；
[0109] 步驟5取下96孔微孔板磁力架，每孔加入標記探針溶液IOOul，置于50度恒溫箱中 放置40分鐘；
[0110] 步驟則尋96孔微孔磁力架置于板底，吸附磁珠1分鐘左右，手托住板架甩出板內(nèi)液 體，再加入200ul的IX洗脫液，如此反復=遍；
[0111] 步驟7取下96孔微孔板磁力架，每孔加入底物溶液IOOul，置于35度恒溫箱中放置 10分鐘；
[0112] 步驟則尋微孔板放入酶標儀或者化學發(fā)光儀中進行讀數(shù)判定。
[0113] RLU結果見表7:
[0114] 表7
[0115]
[
[
[
[
[0120] HCV-RNA第二代核酸標準品，運用QuantiMAT技術檢測有著良好的線性范圍，大約 檢出限在440個lU/ml;
[0121] 當拷貝數(shù)超過4.4*105IU/ml時，信號呈飽和狀態(tài)，說明已到達檢測上限值；
[0122] 據(jù)此可W推斷出QuantiMAT技術對HCVlb型別病毒的檢測范圍在440IU/ml~ 440000IU/ml 之間；
[0123] 其他型別的HCV病毒檢測限在范圍內(nèi)適用。
[0124] 實施例3
[0125] 使用本發(fā)明在磁珠上包被偶聯(lián)核酸：
[01%]本實施案例需要磁珠表面包被有一層聚乙締涂層，然后使用本發(fā)明中的包被緩沖 液進行包被偶聯(lián)；
[0127]磁珠的處理方法，用IX PBS清洗磁珠，重懸后吸附S次，棄掉IXPBS，更換包被緩沖 液，按照下述濃度比例，5.3g/L的憐酸氨二鋼、2.5g/L的憐酸二氨鋼、0.5g/L的氯化鋼、16g/ L的硫酸鋼、25g/L的多聚賴氨酸、0.03g/L的防腐劑和去離子水。
[012引加入20yg的包被引物(5'-N肥-GAGCGGATATATGCTTAGGAAT-3'），避光解育4小時；
[0129] 解育結束后加入封閉試劑(10%的bsa溶液），洗涂S次，溶入TE緩沖液中4度保存；
[0130] 驗證步驟:設計核酸序列（5'-ATTCCTAAGCATATATCCGCTC-biotin-3'），該序列與上 述實施例1中包被的引物互補，合成該引物，將濃度稀釋至lOOpmol/化。
[0131] 步驟則尋引物稀釋成3個梯度，分別是100pmolAiL，10pmolAiL，lpmolAiL。分別加入 I(K)化到包被板孔內(nèi)。
[0132] 驗證實驗設計方案，參見表9。
[。側(cè) 表9 「rno>i 1
[0141] 由表11可知，包被緩沖液的精密性均在參考值范圍內(nèi)。
[0142] 對本發(fā)明提供的緩沖液與現(xiàn)有緩沖液進行正常生產(chǎn)多批次平行實驗，實驗結果參 見表12。
[0143]表12
LOWS」由表12可知，本發(fā)明在精密性、吸附率、線性范圍和高低值范圍均優(yōu)于現(xiàn)有帯規(guī)工 乙。
[0146] 對比例1
[0147] 常規(guī)工藝
[0148] 預先需要對板子進行強酸、強堿的測洗，然后用多聚賴氨酸過夜處理，提高包被吸 附力（1天）；
[0149] IX PBS清洗3次，驚干后加入活化過的探針(探針活化試劑BS3,價格昂貴)過夜解 育（1天）；
[0150] IXPBS清洗3次，驚干后加入膜再生液(需要提前配制），過夜解育（1天）；
[0151] IXPBS清洗3次，驚干后加入封閉液（需要加入過量的BS3ThermoFisher，CAT# 21580，Y1463/50mg)過夜解育（1天）；
[0152] IXPBS清洗3次后在低于15畑％的濕度條件下進行干燥6小時，封裝待用。
[0153] 包被緩沖液采用（ThermoFisher，CAT#17250，Y1329/100ML)
[0154] 驗證實驗設計方案，參見表13。
[0155] 表13 r〇156l

[0166] W上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對 于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行 若干改進和修飾，運些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。
[0167] 對所公開的實施例的上述說明，使本領域?qū)I(yè)技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對運些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可W在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會被限制于本文所示的運些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一 致的最寬的范圍。
【主權項】
1. 一種用于包被核酸引物的緩沖液，其特征在于，按質(zhì)量體積濃度包括： 磷酸氫二鈉 5.3~5.6 g/'L; 磷酸二氬鈉 2.5~3.0 g/L·， 氯化鈉 0.5~0.8 g/L; 多聚賴氨酸 25~32 防腐劑 0.03~0.09 g/L; 水。2. 根據(jù)權利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液還包括16~18g/L的硫酸鈉。3. 根據(jù)權利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液還包括2-巰基乙醇； 所述2-巰基乙醇的質(zhì)量體積濃度為0.35~0.46g/L。4. 根據(jù)權利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述防腐劑為疊氮鈉和/或ProCl in300。5. -種包被核酸引物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A) 將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液； 將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、多聚賴氨酸、氯化鈉、防腐劑和水混合后，得到緩沖液； B) 將上述步驟得到的混合液和緩沖液再次混合后，得到包被混合液； C) 將上述步驟得到的包被混合液放入包被板后進行包被，得到包被后的核酸引物。6. 根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述混合液中，所述核酸引物的濃度 為3~5yg/mL。7. 根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述包被混合液中，所述核酸引物的 濃度為1.5~2.5yg/mL。8. 根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述包被的時間為18~25h;所述包被 的溫度為〇~37°C; 所述包被板為多孔微孔聚苯乙烯板。9. 根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A)具體為： 將核酸引物溶于TE緩沖溶液中，得到混合液； 將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉與水攪拌混合，再加入多聚賴氨酸，再加入硫酸鈉、氯化鈉 和防腐劑后，得到緩沖液。10. 根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述包被后還包括處理步驟： 用PBS緩沖液清洗所述包被板，洗滌1~3遍后干燥； 所述干燥的時間為4~9h;所述干燥的濕度為10 %~35 % RH。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861676SQ201610270227
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】張鷺鷺, 李先坤, 張愛國
【申請人】科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術有限公司