核酸信號(hào)放大序列及放大方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸信號(hào)放大序列及核酸信號(hào)放大方法。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列包括一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所述前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告探針序列互補(bǔ)。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列可以通過(guò)前導(dǎo)序列將目的靶標(biāo)捕獲雜交，再經(jīng)過(guò)若干倍數(shù)的重復(fù)序列結(jié)合相應(yīng)的報(bào)告探針即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而檢測(cè)到目的靶標(biāo)的核酸信號(hào)。相對(duì)于PCR技術(shù)需要酶來(lái)維系雜交體系，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)不增加檢測(cè)物濃度的前提下實(shí)現(xiàn)核酸物質(zhì)的檢測(cè)，且穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，成本低，檢測(cè)流程短。
【專利說(shuō)明】
核酸信號(hào)放大序列及放大方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸信號(hào)放大序列及核酸信號(hào)放大方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的 DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，其能將微量的DNA大幅增 加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的 毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。
[0003] PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互 補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模 板DNA經(jīng)加熱至93 °C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使 之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性）：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 °C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③ 引物的延伸:DNA模板一引物結(jié)合物在72 °C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò)程就可獲得更多的"半保留復(fù)制 鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘，2~3小時(shí)就能 將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
[0004] 但是，PCR技術(shù)的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，存在嚴(yán)重的氣溶膠污染缺陷，雖然后續(xù)的 閉管熒光PCR解決了交叉污染的問題，但是仍沒能解決PCR技術(shù)的天生缺陷問題。其次PCR成 本較高，PCR反應(yīng)需要建設(shè)較高的空氣凈化級(jí)別的專用實(shí)驗(yàn)室，對(duì)實(shí)驗(yàn)要分區(qū)管理，管理成 本大大增加;而且反應(yīng)時(shí)間流程太長(zhǎng)導(dǎo)致每次檢測(cè)的時(shí)間成本增加。此外，PCR反應(yīng)中Taq酶 或者聚合酶還容易受到樣本中的物質(zhì)影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷提供一種核酸信號(hào)放大序列及 其制備方法，以及利用該序列進(jìn)行核酸信號(hào)放大的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0007] -種核酸信號(hào)放大序列，包括一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所 述前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告探針序列互補(bǔ)。
[0008]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中，所述前導(dǎo)序列的Tm值為55 。(:_62°C ;所述重復(fù)序列的Tm值小于55°C。
[0009]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列5'端還包括硫 代三磷酸腺苷保護(hù)的限制性內(nèi)切酶I酶切位點(diǎn)酶切后的片段，所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位 點(diǎn)酶切后為粘性末端。
[0010] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述核酸信號(hào)放 大序列3'端還包括限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)酶切后的片段;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切 位點(diǎn)酶切后為平整末端。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中，所述限制性內(nèi)切酶I為EcoR I、BamH I、HindII、HindIII;所述限制性內(nèi)切酶II為EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、 HPa I、Sma I〇
[0012] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，所述核酸信號(hào)放大序列中所述重復(fù)序列的倍數(shù)為5 倍-20倍。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法，具體包括以下步驟：
[0014] A、根據(jù)目的靶標(biāo)設(shè)計(jì)核酸信號(hào)前導(dǎo)序列和若干倍數(shù)的重復(fù)序列，并分別在前導(dǎo)序 列5'端加上限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)，在若干倍數(shù)的重復(fù)序列3'端加上限制性內(nèi)切酶II 的酶切位點(diǎn);所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的前導(dǎo)序列相連，酶切后 為粘性末端;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的重復(fù)序列相連，酶切 后為平整末端；
[0015] B、合成序列插入載體后進(jìn)行克隆復(fù)制；
[0016] C、限制性內(nèi)切酶I和限制性內(nèi)切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對(duì)限制性酶切末端 進(jìn)行保護(hù)；
[0017] D、核酸外切酶ΙΠ 酶切獲得核酸信號(hào)放大序列。
[0018] 其中，所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法中，所述載體為pGEM-3ZF( + )載體。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種核酸信號(hào)放大的方法，將含有目的靶標(biāo)的樣品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信號(hào)放大序列雜交，之后加入報(bào)告探針雜交后加入化學(xué)發(fā)光底物讀 取結(jié)果。
[0020] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大的方法還包括以核酸信 號(hào)放大序列中的重復(fù)序列為前導(dǎo)序列進(jìn)行次級(jí)信號(hào)放大的步驟。
[0021] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種核酸信號(hào)放大序列及其制備方法，以及 利用該序列進(jìn)行核酸信號(hào)放大的方法。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列包括一個(gè)前導(dǎo)序列和 一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所述前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告 探針序列互補(bǔ)。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列可以通過(guò)前導(dǎo)序列將目的靶標(biāo)捕獲雜交，再 經(jīng)過(guò)若干倍數(shù)的重復(fù)序列結(jié)合相應(yīng)的報(bào)告探針即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而檢測(cè)到目的靶標(biāo)的 核酸信號(hào)。相對(duì)于PCR技術(shù)需要酶來(lái)維系雜交體系，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)不增加檢測(cè)物濃度的前 提下實(shí)現(xiàn)核酸物質(zhì)的檢測(cè)，且穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，成本低，檢測(cè)流程短。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0023] 圖1示核酸信號(hào)放大序列結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024] 圖2示核酸外切酶ΙΠ 酶切獲得核酸信號(hào)放大序列的示意圖；
[0025] 圖 3 示pGEM-3ZF( + )載體圖譜；
[0026] 圖4示初級(jí)信號(hào)放大加次級(jí)信號(hào)放大構(gòu)象圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0029] -種核酸信號(hào)放大序列，包括一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所 述前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告探針序列互補(bǔ)。
[0030] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列為針對(duì)目的靶標(biāo)設(shè)計(jì)并合成的一種非自然存在的 基因序列，該基因序列是由一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成。其結(jié)構(gòu)如圖1所 不。
[0031] Tm值是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)在熱變性過(guò)程中紫外吸收值達(dá)到最大 值的1/2時(shí)的溫度。
[0032] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列可以與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)形成雙 螺旋結(jié)構(gòu)。所述若干重復(fù)序列可以與報(bào)告探針序列互補(bǔ)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
[0033]為了保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列的Tm值保證 在60°C左右。在一些實(shí)施方案中，所述前導(dǎo)序列的Tm值為55°C-62°C。
[0034] 同樣的，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述核酸信號(hào)放大序列中所述重復(fù)序列 的Tm值小于55°C，以確保重復(fù)序列的特異性雜交。
[0035] 如，在一些實(shí)施例中所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列具體為 ACGITTTAGAGAGAGATATGAT，所述重復(fù)序列為 TCCCGGGAGGCGAGCA。
[0036] 如，在一些實(shí)施例中所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列具體為 TCCCTGAATGCCTAACGAT，所述重復(fù)序列為 AGGTCTTTACCACCAATATTCTITT。
[0037]在一些實(shí)施方案中，所述核酸信號(hào)放大序列中所述前導(dǎo)序列5'端還包括硫代三磷 酸腺苷保護(hù)的限制性內(nèi)切酶I酶切位點(diǎn)酶切后的片段，所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)酶切 后為粘性末端。即所述前導(dǎo)序列5'端連接有限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)，而該酶切位點(diǎn)經(jīng)酶 切后形成粘性末端，隨后粘性末端經(jīng)硫代三磷酸腺苷進(jìn)行保護(hù)后補(bǔ)齊為平末端，獲得包括 硫代三磷酸腺苷保護(hù)的限制性內(nèi)切酶頂每切位點(diǎn)酶切后的片段。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列3'端還包括限制性內(nèi)切酶II的 酶切位點(diǎn)酶切后的片段;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)酶切后為平整末端。
[0039] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述核酸信號(hào)放大序列中，所述限制性內(nèi)切酶I可以為 任意一種酶切后形成粘性末端的任何一種酶，如為EcoR 13&111!11、把11(111、把11(1111等。在一 些實(shí)施方案中，所述限制性內(nèi)切酶I為Hindll。
[0040] 所述限制性內(nèi)切酶II可以為任意一種酶切后形成平整末端的任何一種酶，如為 EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、HPa I、Sma I等。在一些實(shí)施方案中，所述限制性內(nèi) 切酶Π 為EcoR V。
[0041] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列中所述重復(fù)序列的倍數(shù)為5倍-20倍。在一些實(shí)施例 中，所述重復(fù)序列為20倍。在另一些實(shí)施例中，所述重復(fù)序列為10倍。
[0042]本發(fā)明還提供了上述核酸信號(hào)放大序列的制備方法，具體包括以下步驟：
[0043] A、根據(jù)目的靶標(biāo)設(shè)計(jì)核酸信號(hào)前導(dǎo)序列和若干倍數(shù)的重復(fù)序列，并分別在前導(dǎo)序 列5'端加上限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)，在若干倍數(shù)的重復(fù)序列3'端加上限制性內(nèi)切酶II 的酶切位點(diǎn);所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的前導(dǎo)序列相連，酶切后 為粘性末端;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的重復(fù)序列相連，酶切 后為平整末端；
[0044] B、合成序列插入載體后進(jìn)行克隆復(fù)制；
[0045] C、限制性內(nèi)切酶I和限制性內(nèi)切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對(duì)限制性酶切末端 進(jìn)行保護(hù)；
[0046] D、核酸外切酶IΠ 酶切獲得核酸信號(hào)放大序列。
[0047] 本發(fā)明所述制備方法是通過(guò)硫代三磷酸腺苷對(duì)酶切后的片段進(jìn)行保護(hù)，利用核酸 外切酶III不能切割含有硫代三磷酸腺苷序列的特點(diǎn)，將未被硫代三磷酸腺苷保護(hù)的片段 切割成單鏈探針。
[0048]核酸外切酶III具有外切酶活性，該酶作用于雙鏈DNA，從3MH末端方向逐 步切去單核苷酸。每次酶與底物結(jié)合催化，只有幾個(gè)核苷酸被除掉，從而在DNA分子群內(nèi)產(chǎn) 生漸進(jìn)缺失。盡管可以作用于雙鏈DNA的切刻產(chǎn)生單鏈缺口，但該酶最適底物是平齊末端或 3'凹陷末端DNA。由于對(duì)單鏈DNA無(wú)活性，因此該酶無(wú)法切割3'突出末端。且核酸外切酶III 的3' 外切酶活性對(duì)底物的切割程度隨3'突出末端的長(zhǎng)度而變化，四堿基或更長(zhǎng)的突出 末端完全不能被切割。
[0049]由于核酸外切酶III不能作用于粘性末端，本發(fā)明所述制備方法在需要保護(hù)的那 條鏈前段聚合上若干個(gè)硫代三磷酸腺苷后，核酸外切酶III只能切割未保護(hù)的那條鏈，而保 留硫代三磷酸腺苷保護(hù)的那條鏈，從而制備出單鏈特異性探針，即核酸信號(hào)放大序列。具體 如圖2所示。
[0050] 其中，所述硫代三磷酸腺苷有α-dAtp、a-dTtp、a-dGtp和α-dCtp四種，結(jié)構(gòu)式分別 如下：
[0052]本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法中，所述載體為pGEM_3ZF(_)載體。序列 插入載體后，命名為pGEM-3ZF( + )-Amplifier。圖譜如圖3所示。
[0053]本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法中，步驟C具體為使用限制性內(nèi)切酶I單 酶切載體序列產(chǎn)生5 '粘性末端，使用Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷對(duì)5 '粘性末端 進(jìn)行補(bǔ)平操作;再用限制性內(nèi)切酶II將目的條帶從載體上切除下來(lái)。
[0054] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法中，步驟D具體為使用核酸外切酶III對(duì) 硫代保護(hù)的雙鏈進(jìn)行單鏈消化，確保5 '硫代保護(hù)的序列能夠轉(zhuǎn)換成單鏈探針結(jié)構(gòu)。
[0055] 本發(fā)明還提供了一種核酸信號(hào)放大的方法，將含有目的靶標(biāo)的樣品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信號(hào)放大序列雜交，之后加入報(bào)告探針雜交后加入化學(xué)發(fā)光底物讀 取結(jié)果。
[0056]其中，所述核酸信號(hào)放大序列雜交的溫度為50°C~55°C，所述雜交時(shí)間為40~ 50min〇
[0057] 而所述核酸信號(hào)放大的方法中，與報(bào)告探針雜交的條件為51°C~53°C反應(yīng)30~ 40min〇
[0058] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大的方法中所述化學(xué)發(fā)光底物可以為任何一種可以識(shí)別 報(bào)告探針的化學(xué)發(fā)光底物。在一些實(shí)施方案中，所述化學(xué)發(fā)光底物為lumi-Phos Plus。
[0059] 本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大的方法中實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用化學(xué)發(fā)光分析儀讀取數(shù)據(jù)。
[0060] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大的方法還包括以核酸信號(hào)放大序列中的重復(fù) 序列為前導(dǎo)序列進(jìn)行次級(jí)信號(hào)放大的步驟。具體構(gòu)象如圖4所示。
[0061] 在初級(jí)信號(hào)放大的基礎(chǔ)上進(jìn)行次級(jí)信號(hào)放大可以形成倍數(shù)的累積放大，從而進(jìn)一 步提供檢測(cè)的靈敏度。如初級(jí)核酸信號(hào)放大重復(fù)序列為20倍，而次級(jí)信號(hào)放大再20倍的放 大，初級(jí)加次級(jí)信號(hào)放大累積可以達(dá)到400倍放大，大大提高了檢測(cè)靈敏度。
[0062] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種核酸信號(hào)放大序列及其制備方法，以及 利用該序列進(jìn)行核酸信號(hào)放大的方法。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列包括一個(gè)前導(dǎo)序列和 一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所述前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告 探針序列互補(bǔ)。本發(fā)明所述核酸信號(hào)放大序列可以通過(guò)前導(dǎo)序列將目的靶標(biāo)捕獲雜交，再 經(jīng)過(guò)若干倍數(shù)的重復(fù)序列結(jié)合相應(yīng)的報(bào)告探針即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而檢測(cè)到目的靶標(biāo)的 核酸信號(hào)。相對(duì)于PCR技術(shù)需要酶來(lái)維系雜交體系，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)不增加檢測(cè)物濃度的前 提下實(shí)現(xiàn)核酸物質(zhì)的檢測(cè)，且穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，成本低，檢測(cè)流程短。
[0063] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。如無(wú)特殊 說(shuō)明，本發(fā)明所使用的試劑及儀器均為本領(lǐng)域常用試劑及儀器。本發(fā)明所涉及的方法均為 本領(lǐng)域的通用方法。其中化學(xué)發(fā)光底物為lumi-Phos Plus，購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter Lumigen。
[0064] 實(shí)施例1、核酸信號(hào)放大序列的制備
[0065] 根據(jù)引物序列1設(shè)計(jì)前導(dǎo)序列，同時(shí)設(shè)計(jì)不同倍數(shù)的重復(fù)序列，并分別在前導(dǎo)序列 5'端加上Hindll的酶切位點(diǎn)，在重復(fù)序列3'端加上EcoR V的酶切位點(diǎn)，合成不同構(gòu)象序列 后插入pGEM-3ZF(_)載體后進(jìn)行克隆復(fù)制;Hindll單酶切載體序列產(chǎn)生5'粘性末端，使用 Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷對(duì)5'粘性末端進(jìn)行補(bǔ)平，再用EcoR V將目的條帶從 載體上切除下來(lái)，核酸外切酶ΙΠ 酶切成單鏈DNA探針。各序列如表1所示。
[0066] 表1各序列

[0068] 實(shí)施例2、初級(jí)信號(hào)放大
[0069] 1、將lOOpmol濃度的表1中的目的靶標(biāo)包被在微孔板上；
[0070] 2、按照實(shí)施例1的方法合成各序列并制備成單鏈探針，將合成序列1、合成序列2和 合成序列3制備的探針分別命名為預(yù)放大1、預(yù)放大2、預(yù)放大3;
[0071] 3、控制雜交溫度控制在5 0 °C~5 5 °C之間，每孔加入預(yù)放大1、2、3的濃度均為 lOOpmol/yL，雜交 40 ~50 分鐘；
[0072] 4、分別加入報(bào)告探針（AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-AP)，51°C ~53°C 反應(yīng) 30 ~ 40min；
[0073] 5、加入化學(xué)發(fā)光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0074] 其中布板設(shè)計(jì)如表2,對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果如表3。
[0075]表2布板設(shè)計(jì)
[0078]表3對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果
[0080]由表3結(jié)果可見，預(yù)放大1、2、3分別在背景發(fā)光值的基礎(chǔ)上大約放大了20倍、10倍、 5倍的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，與預(yù)期設(shè)計(jì)是一致的。
[0081] 實(shí)施例3、次級(jí)信號(hào)放大
[0082] 在實(shí)施例2基礎(chǔ)上再設(shè)計(jì)一種核酸信號(hào)放大序列-合成序列4,其前導(dǎo)序列與實(shí)施 例2合成序列的重復(fù)序列互補(bǔ)，合成序列4的序列具體為:AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-20X-GATATCATTTCTTGATGGC)。
[0083] 方法：
[0084] 1、將lOOpmol濃度的的表1中的目的靶標(biāo)包被在微孔板上；
[0085] 2、按照實(shí)施例1的方法合成各序列并制備成單鏈探針，將合成序列1、合成序列2、 合成序列3和合成序列4制備的探針分別命名為預(yù)放大1、預(yù)放大2、預(yù)放大3和放大1;
[0086] 3、控制雜交溫度控制在5 0 °C~5 5 °C之間，每孔加入預(yù)放大1、2、3的濃度均為 lOOpmol/yL，雜交 40 ~50 分鐘；
[0087] 4、控制雜交溫度控制在50°C~55°C之間，每孔加入50pmolAiL的放大1，雜交40~ 50分鐘；
[0088] 5、加入報(bào)告探針(GCCATCAAGAAATGATATC-AP)，51°C ~53°C 反應(yīng) 30 ~40min。
[0089] 6、加入化學(xué)發(fā)光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0090] 其中布板設(shè)計(jì)如表4,對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果如表5。
[0091] 表4布板設(shè)計(jì)
[0094]表5對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果
[0096]由表5結(jié)果可見，預(yù)放大1、2、3與放大1分別在背景發(fā)光值的基礎(chǔ)上大約放大了330 倍、160倍、40倍的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值，與預(yù)期設(shè)計(jì)是一致的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸信號(hào)放大序列，包括一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)若干倍數(shù)的重復(fù)序列構(gòu)成，所述 前導(dǎo)序列與目的靶標(biāo)序列互補(bǔ)，所述重復(fù)序列與報(bào)告探針序列互補(bǔ)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號(hào)放大序列，所述前導(dǎo)序列的Tm值為55°C-62°C;所述 重復(fù)序列的Tm值小于55°C。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸信號(hào)放大序列，所述前導(dǎo)序列5'端還包括硫代三磷酸 腺苷保護(hù)的限制性內(nèi)切酶I酶切位點(diǎn)酶切后的片段，所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)酶切后 為粘性末端。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的核酸信號(hào)放大序列，所述核酸信號(hào)放大序列3'端 還包括限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)酶切后的片段;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)酶切后 為平整末端。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的核酸信號(hào)放大序列，所述限制性內(nèi)切酶I為EcoR I、BamH I、Hind II、HindIII;所述限制性內(nèi)切酶II為EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、 HalIII、HPa I、Sma I。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸信號(hào)放大序列，所述重復(fù)序列的倍數(shù)為5倍-20倍。7. 權(quán)利要求1所述核酸信號(hào)放大序列的制備方法，包括以下步驟： A、 根據(jù)目的靶標(biāo)設(shè)計(jì)核酸信號(hào)前導(dǎo)序列和若干倍數(shù)的重復(fù)序列，并分別在前導(dǎo)序列5' 端加上限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)，在若干倍數(shù)的重復(fù)序列3'端加上限制性內(nèi)切酶II的酶 切位點(diǎn);所述限制性內(nèi)切酶I的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的前導(dǎo)序列相連，酶切后為粘 性末端;所述限制性內(nèi)切酶II的酶切位點(diǎn)與核酸信號(hào)放大序列的重復(fù)序列相連，酶切后為 平整末端； B、 合成序列插入載體后進(jìn)行克隆復(fù)制； C、 限制性內(nèi)切酶I和限制性內(nèi)切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對(duì)限制性酶切末端進(jìn)行 保護(hù)； D、 核酸外切酶III酶切獲得核酸信號(hào)放大序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，所述載體為pGEM-3ZF (+)載體。9. 一種核酸信號(hào)放大的方法，將含有目的靶標(biāo)的樣品包被在微孔板上，然后加入權(quán)利 要求1-6任意一項(xiàng)所述核酸信號(hào)放大序列雜交，之后加入報(bào)告探針雜交后加入化學(xué)發(fā)光底 物讀取結(jié)果。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括以核酸信號(hào)放大序列中的重復(fù)序列為前導(dǎo)序列 進(jìn)行次級(jí)信號(hào)放大的步驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105886501SQ201610267807
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月26日
【發(fā)明人】張鷺鷺, 李先坤, 張愛國(guó)
【申請(qǐng)人】科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術(shù)有限公司