一種檢測大豆疫霉菌的lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒及其專用引物。本發(fā)明所提供的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的專用引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3組成,核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。實驗證明,本發(fā)明提供的一種檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒及其專用引物能特異性的檢測大豆疫霉菌,與其他菌無交叉反應,對大豆疫霉菌的基因組DNA的最小檢測限為1.44pg。
【專利說明】
一種檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒及其專用引物
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域,具體涉及一種檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒及其專用 引物。
【背景技術】
[0002]大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)屬于藻菌界,卵菌 門,霜霉目,腐霉科,疫霉屬。大?疫霉囷吾歡生活在潮濕涼爽的環(huán)境中,多數(shù)大?疫霉囷株 的菌絲生長最適溫度為25~28°C,最高為32~35°C,最低為5°C,其無性繁殖產(chǎn)生游動孢子 的最適溫度為20°C,最低溫度為5°C,在潮濕有水膜存在時,孢子囊產(chǎn)生大量的游動孢子,游 動孢子游動一段時間后休眠形成休止孢,遇到合適寄主組織,休止孢萌發(fā)產(chǎn)生芽管侵入寄 主表皮。
[0003] 大豆疫霉菌可以在大豆的各個生育期為害。在大豆出苗前可以引起種子腐爛、出 苗前腐爛,出苗后可以引起植株枯萎。一般苗期感病植株表現(xiàn)為出苗差、近地表莖部出現(xiàn)水 浸狀病斑、葉片變黃萎蔫,嚴重時植株猝倒死亡。成株期植株受侵染后下部葉片變黃,隨后 上部葉片逐漸變黃并很快萎蔫;近地表莖部病斑褐色,并可向上擴展,莖皮層及髓變褐;根 腐爛,根系發(fā)育不良;未死亡病株的莢數(shù)明顯減少,空莢、癟莢較多,籽粒皺縮。由于在潮濕 條件下,根部侵染的病菌可以產(chǎn)生大量游動孢子,孢子隨雨水飛濺,為害莖部和葉片,甚至 出現(xiàn)病莢,其癥狀為綠色豆莢基部出現(xiàn)水浸狀斑,病斑逐漸變褐并從莢柄蔓延至莢尖,最后 整個豆莢呈黃褐色干枯,種子失水干癟。為此,開展大豆疫霉菌的實驗室診斷研究具有重要 意義。目前用于大豆疫霉菌診斷的實驗室方法很多,如大豆霉疫菌的分離鑒定和PCR技術的 檢測方法,但是其非常耗時且依賴昂貴的檢測設備,很難在農(nóng)業(yè)上推廣應用。為此,急需建 立一種敏感、準確、快速、簡便的大豆疫霉菌實驗室診斷方法。雖然基于也已建立,但PCR需 要昂貴的儀器,而且操作繁瑣。
[0004] 近年來開發(fā)的環(huán)介導等溫擴增(loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一種新的核酸擴增技術,該技術依賴于能夠識別靶序列上4個特異區(qū)域的引物和1 個具有鏈置換特性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在等溫條件下高效擴增祀基因,靈 敏度和特異性高,該方法已廣泛應用于病毒、類病毒、細菌、真菌及轉(zhuǎn)基因的檢測,而迄今尚 未應用該技術檢測大豆疫霉菌的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決技術問題是如何檢測大豆疫霉菌(Phytophthora so jae Kaufmann et Gerdemann)〇
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種成套引物,由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3 組成,它們均為單鏈DNA分子,核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和 序列5。其中,序列表的序列1由44個核苷酸組成,序列表的序列2由44個核苷酸組成,序列表 的序列3由24個核苷酸組成,序列表的序列4由22個核苷酸組成,序列表的序列5由21個核苷 酸組成。所述成套引物可以對大豆疫霉菌的基因組DNA進行特異性的環(huán)介導等溫擴增。
[0007] 所述成套引物中,所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引 物B3的摩爾比可為8:8:4:1:1。
[0008] 所述成套引物中,各引物的量如下:1·6μπιο1所述引物FIP、1.6ymol所述引物BIP、 0·8μπιο1所述引物LF、0.2ymol所述引物F3、0.2ymol所述引物B3。
[0009] 所述摩爾比是總摩爾數(shù)之比,所述總摩爾數(shù)是引物中各種單鏈DNA摩爾數(shù)之和。
[0010] 所述成套引物的用途為如下a)或b)或c)或d):a)制備用于檢測或輔助檢測大豆疫 霉菌的試劑盒;b)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有大豆疫霉菌;c)制備用于鑒定或輔 助鑒定大豆疫霉菌的試劑盒;d)鑒定或輔助鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌。
[0011] 本發(fā)明還保護所述成套引物的應用,為如下a)或b)或c)或d):a)制備用于檢測或 輔助檢測大豆疫霉菌的試劑盒;b)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有大豆疫霉菌;c)制 備用于鑒定或輔助鑒定大豆疫霉菌的試劑盒;d)鑒定或輔助鑒定待測菌是否為候選的大豆 疫霉菌。
[0012] 本發(fā)明還保護含有所述成套引物的試劑盒。所述試劑盒的用途為如下e)或f):e) 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌;f)鑒定或輔助鑒定待測菌是 否為候選的大豆疫霉菌。
[0013] 所述試劑盒還可包括Bst DNA聚合酶和/或甜菜堿。
[0014]所述試劑盒還可包括熒光顯色劑。
[0015]所述熒光顯色劑具體可為鈣黃綠素熒光染料。
[0016]所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 所述試劑盒的制備方法可為如下(Ι)、(Π )或(ΙΠ ):
[0018] (I)所述成套引物中各條引物分別單獨包裝;
[0019] (Π )所述成套引物中各條引物按照所述摩爾比混合在一起;
[0020] (ΙΠ )所述成套引物中各條引物按照所述量混合在一起。
[0021]本發(fā)明還保護所述試劑盒的應用,為如下e)或f):e)檢測或輔助檢測待測樣品中 是否含有或疑似含有大豆疫霉菌;f)鑒定或輔助鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品是否含有大豆疫霉菌的方法,包括如下步驟:
[0023] 提取待測樣品的總DNA,以所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增,然后進行如下評 判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述總DNA的環(huán)介導等溫擴增,則待測樣品中含有或疑似 含有大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所述總DNA的環(huán)介導等溫擴增,則所述待測 樣品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0024] 所述"檢測待測樣品是否含有大豆疫霉菌的方法"具體可為方法一,包括如下步 驟:提取待測樣品的總DNA,以所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增,如果濁度曲線呈現(xiàn)為典 型的"S型"、則待測樣品中含有或疑似含有大豆疫霉菌,如果濁度曲線呈現(xiàn)為水平直線、則 所述待測樣品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0025] 所述"檢測待測樣品是否含有大豆疫霉菌的方法"具體可為方法二,包括如下步 驟:提取待測樣品的總DNA,以所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增(反應體系中含有鈣黃綠 素熒光染料),得到待測樣品反應液,目測待測樣品反應液的顏色變化,如果待測樣品反應 液為綠色、則待測樣品中含有或疑似含有大豆疫霉菌,如果待測樣品反應液為橙色、則所述 待測樣品中不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0026] 本發(fā)明還保護一種鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌的方法,包括如下步驟:
[0027] 提取待測菌的基因組DNA,以所述成套引物進行轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增,然后進行如 下評判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述基因組DNA的轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增,則待測菌為 候選的大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所述基因組DNA的轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增, 則所述待測菌為候選的非大豆疫霉菌。
[0028] 所述"鑒定待測菌是否為大豆疫霉菌的方法"具體可為方法三,包括如下步驟:提 取待測樣品的基因組DNA,以所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增,如果濁度曲線呈現(xiàn)為典型 的"S型"、則待測菌為候選的大豆疫霉菌,如果濁度曲線呈現(xiàn)為水平直線、則所述待測菌為 候選的非大豆疫霉菌。
[0029] 所述"鑒定待測菌是否為大豆疫霉菌的方法"具體可為方法四,包括如下步驟:提 取待測樣品的基因組DNA,以所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增(反應體系中含有鈣黃綠素 熒光染料),得到待測樣品反應液,目測待測樣品反應液的顏色變化,如果待測樣品反應液 為綠色、則待測菌為候選的大豆疫霉菌,如果待測樣品反應液為橙色、則所述待測菌為候選 的非大豆疫霉菌。
[0030] 所述鈣黃綠素熒光染料可為向31.12mg鈣黃綠素(sigma公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為 B2346)和197.9mg氯化錳(sigma公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為G5468)中加入10mL超純水得到的 染料。
[0031 ]所述環(huán)介導等溫擴增可在60-67 °C條件下進行。
[0032]所述環(huán)介導等溫擴增具體可在65°C條件下進行。
[0033]所述待測樣品可為微生物樣品。
[0034]所述待測囷可為大?疫霉囷或辣椒疫霉。
[0035]實驗證明,本發(fā)明提供的一種檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒及其專用引物能特異 性的檢測大豆疫霉菌,而且與其他菌無交叉反應,如辣椒疫霉。本發(fā)明提供一種檢測大豆疫 霉菌的LAMP試劑盒及其專用引物對大豆疫霉菌的基因組DNA的最小檢測限為1.44pg,比普 通PCR檢測方法的靈敏度高10倍。
【附圖說明】
[0036] 圖1為檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的最佳反應條件的篩選。
[0037] 圖2為檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的靈敏度。
[0038] 圖3為檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的靈敏度。
[0039] 圖4為普通PCR檢測大豆疫霉菌的靈敏度。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述,給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041 ]下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實施例中大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)記載 在如下文獻中:宋志剛,郭成亮,趙曙郭等.大豆疫霉菌的分離與鑒定[J].菌物研究,2008., 公眾可從中華人民共和國東港出入境檢驗檢疫局(即
【申請人】處)獲得上述材料。
[0044]鈣黃綠素熒光染料為向31.12mg鈣黃綠素(sigma公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為B2346) 和197.9mg氯化錳(sigma公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為G5468)中加入10mL超純水得到的染料。 [0045] Tris · HCl(pH8.8)為上海生科生物科技有限公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為ZC12458; Bst DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為D4579;甜菜堿為sigma公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號 為B3813;MgS〇4為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為TV25671;dNTP為天根生 化科技(北京)有限公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為SF357898; KC1為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn) 品,產(chǎn)品目錄號為TV24673 ; (NH4)2S04為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為 TV17360; 0 · 1 % Tween20為FLUKA公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為Y245C1。
[0046]實施例1、檢測大豆疫霉菌的LAMP成套引物的制備
[0047] 本實施例的檢測大豆疫霉菌的LAMP成套引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3 和引物B3組成,各條引物均為單鏈DNA分子,它們的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序 列2、序列3、序列4和序列5所示。
[0048]引物序列如下:
[0049] 弓丨物FIP:5 '-gtccgccaccgatgattcgacgattaatcaaccatcactcaccg-3 ';
[0050] 弓丨物BIP:5 '-ccaacgtgggttcggattggaccttcttgggtactgtgtaccag-3 ';
[0051 ]引物LF:5 ' -gatgtaggatgattggatgaacac-3 ' ;
[0052] 引物F3:5 ' -gcagcgtcctatcacctagtgc-3 ' ;
[0053] 引物B3:5 ' -acggcgtattgagggttgctg-3 '。
[0054] 制備引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3。
[0055] 實施例2、利用檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒檢測待測樣品
[0056] -、檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的制備
[0057]制備檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒,包括試劑盒C或試劑盒D:
[0058] 試劑盒C為將反應試劑C、空白對照和陽性對照組裝在一起得到的產(chǎn)品;
[0059] 試劑盒D為將反應試劑D、空白對照和陽性對照組裝在一起得到的產(chǎn)品。
[0060] 其中,所述反應試劑C,包括20mM Tris · HCl(pH8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2S〇4, 0.1%Tween20,0.8M甜菜堿,8mM MgS〇4,1.4mM dNTP(每種),8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和 引物BIP各1.6ymol、引物LF 0.8ymol、引物F3和引物B3各0.2ymol,用去離子水補至23yL。
[0061] 所述反應試劑D,包括20mM Tris · HCl(pH8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2S〇4,0.1% Tween20,0.8M甜菜堿,8mM MgS〇4,1.4mM dNTP(每種),8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物 BIP各1.6μπιο1、引物LF 0.8μπιο1、引物F3和引物B3各0.2μπιο1、鈣黃綠素熒光染料lyL,用去 離子水補至24yL。
[0062] 所述陽性對照為大豆疫霉菌的基因組DNA,使用時加入2yL。
[0063] 所述空白對照為滅菌超純水,使用時加入2yL。
[0064]二、利用步驟一制備的試劑盒C確立LAMP擴增最佳反應條件 [0065] 1、提取大豆疫霉菌的基因組DNA,基因組DNA的濃度為7 2ng/yL。
[0066] 2、LAMP
[0067] 具體的檢測方法如下:
[0068] 向試管中加入23yL反應試劑C和2yL步驟1提取的大豆疫霉菌的基因組DNA得到反 應液,然后將反應液于60°C反應60分鐘。以反應時間為橫坐標,濁度儀測量的濁度為縱坐 標,得到濁度曲線。
[0069] 按照上述方法,將60°C替換為61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C或67°C,其它步驟 均不變,得到相應的濁度曲線。
[0070] 結果表明(圖1),所有的濁度曲線均呈現(xiàn)典型的"S型"??梢?,LAMP擴增反應條件可 為60°C~67°C、反應eOmiruLAMP擴增最佳反應條件具體可為65°C、反應60min。
[0071 ]三、利用步驟一制備的試劑盒D檢測待測樣品
[0072] 1、提取大豆疫霉菌的基因組DNA,大豆疫霉菌的基因組DNA的濃度為72ng/yL。
[0073] 2、LAMP
[0074] 具體的檢測方法如下:
[0075] (1)向試管中加入24yL反應試劑D加入2yL大豆疫霉菌的基因組DNA得到反應液,然 后將反應液于65°C反應60min。反應結束后,觀察反應液的顏色變化。
[0076]按照上述方法,將大豆疫霉菌的基因組DNA替換為滅菌超純水,其它步驟均不變。 反應結束后,觀察反應液的顏色變化。
[0077] (2)結果觀察和判定:如果反應液的目測顏色為綠色、則含有或疑似含有大豆疫霉 菌;如果反應液的目測顏色為橙色、則不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0078] 實驗結果表明:加入大豆疫霉菌的基因組DNA的試管進行LAMP后,反應液目測顏色 為綠色;而加入滅菌超純水的試管進行LAMP后,反應液目測顏色為橙色。結果表明,本發(fā)明 提供的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒可準確的檢測大豆疫霉菌。
[0079]實施例3、實施例2制備的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的特異性
[0080]以實施例2制備的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒C進行特異性實驗,實驗重復三 次,每次重復的步驟如下:
[0081 ] 1、分別提取大豆疫霉菌的基因組DNA和辣椒疫霉的基因組DNA,大豆疫霉菌的基因 組DNA和辣椒疫霉的基因組DNA的濃度均為50ng/yL。
[0082] 2、向試管中加入23yL反應試劑C和2yL步驟1提取的大豆疫霉菌的基因組DNA或辣 椒疫霉的基因組DNA得到反應液,然后將反應液于65°C反應60分鐘。以反應時間為橫坐標, 濁度儀測量的濁度為縱坐標,得到濁度曲線。
[0083]實驗結果表明,加入大豆疫霉菌基因組DNA的試管進行LAMP得到典型的"S型"擴增 曲線,加入辣椒疫霉基因組DNA的試管進行LAMP不能得到典型的"S型"擴增曲線。
[0084] 實施例4、實施例2制備的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒的靈敏度
[0085] -、以實施例2制備的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒C進行靈敏度實驗,實驗重復 三次,每次重復的步驟如下:
[0086] 1、提取大豆疫霉菌的基因組DNA,命名為DNA1,DNA1中DNA濃度為72ng/yL。
[0087] 2、吸取lmL DNA1加入盛有9ml無菌超純水中的試管中充分混勻,得到DNA2;以此類 推制成0嫩3、0嫩4、0嫩5、0嫩6和0嫩7。使用86〇1^1111^-800紫外分光光度計測定稀釋后各 個梯度的 DNA 濃度,分別為7 · 2ngAiL、720pg/yL、72pgAiL、7 · 2pg/yL、0 · 72pg/yL和 0 · 072pg/y L〇
[0088] 3、LAMP
[0089] (1)向試管中加入23yL反應試劑C和2yL步驟1制備的DNA1得到反應液,然后將反應 液于65 °C反應60min。以反應時間為橫坐標,濁度儀測量的濁度為縱坐標,得到濁度曲線。
[0090] 按照上述方法,將DNA1分別替換為步驟2制備的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和滅菌超純水,其它步驟均不變,得到相應的濁度曲線。
[0091] (2)結果觀察和判定:如果濁度曲線呈現(xiàn)典型的"S型"、則待測樣品中含有或疑似 含有大豆疫霉菌;如果濁度曲線呈現(xiàn)為水平直線、則所述待測樣品不含有或疑似不含有大 ?疫霉囷。
[0092] 實驗結果見圖2,向反應試劑C中加入DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5或DNA6進行LAMP 均得到典型的"S型"擴增曲線,而向反應試劑C中加入DNA7或滅菌超純水進行LAMP得到的擴 增曲線均為水平的直線。
[0093] 二、以實施例2制備的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒D進行靈敏度實驗,實驗重復 三次,每次重復的步驟如下:
[0094] 1、同步驟一中1。
[0095] 2、同步驟一中2。
[0096] 3、LAMP
[0097] 具體的檢測方法如下:
[0098] (1)向試管中加入24yL反應試劑D加入2yL DNA1得到反應液,然后將反應液于65°C 反應60min。反應結束后,觀察反應液的顏色變化。
[0099] 按照上述方法,將DNA 1分別替換為步驟2制備的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和滅菌超純水,其它步驟均不變。反應結束后,觀察反應液的顏色變化。
[0100] (2)結果觀察和判定:如果反應液的目測顏色為綠色、則含有或疑似含有大豆疫霉 菌;如果反應液的目測顏色為橙色、則不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。
[0101] 實驗結果見圖 3 (1 為DNA1,2為DNA2,3為DNA3,4為DNA4,5為DNA5,6為DNA6,7為 DNA7,8為滅菌超純水)。只有加入DNA7或滅菌超純水的試管進行LAMP后,反應液為橙色。
[0102] 結果表明,本發(fā)明提供的檢測大豆疫霉菌的LAMP試劑盒C和試劑盒D對大豆疫霉菌 基因組DNA的最小檢測限為1.44pg。
[0103] 三、普通PCR檢測大豆疫霉菌基因組DNA的靈敏度實驗
[0104] 實驗重復三次,每次重復的步驟如下:
[0105] 1、同步驟一中1。
[0106] 2、同步驟一中2。
[0107] 3、以 2yL DNA1 為模板,以F : 5 '-GCGTATTGAGGGTTGCTG-3 ' 和B : 5 '-GCGTCCTATCACCTAGTGC-3 '為引物,進行PCR,得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0108] 按照上述方法,將DNA 1分別替換為步驟2制備的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7 和滅菌超純水,其它步驟均不變,獲得相應的PCR擴增產(chǎn)物。
[0109] 4、結果觀察和判定:如果PCR擴增產(chǎn)物含有203bp的DNA片段、則含有或疑似含有大 豆疫霉菌;如果PCR擴增產(chǎn)物不含有203bp的DNA片段、則不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。 所述203bp的DNA片段如序列表中序列6所示。
[0110] 實驗結果見圖4 (1 為DNA1,2為DNA2,3為DNA3,4為DNA4,5為DNA5,6為DNA6,7為 DNA7,8為滅菌超純水)。以0嫩1、0嫩2、0嫩3、0嫩4或0嫩5為模板獲得的?0財廣增產(chǎn)物中含有 203bp的DNA片段,以DNA6、DNA7或無菌超純水為模板獲得的PCR擴增產(chǎn)物中不含有203bp的 DNA片段??梢?,普通PCR對大豆疫霉菌基因組DNA的最小檢測限為14.4pg。
【主權項】
1. 一種成套引物,由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3組成,各條引物均為單 鏈DNA分子,核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。2. 如權利要求1所述成套引物,其特征在于:所述成套引物中,所述引物FIP、所述引物 BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引物B3的摩爾比為8:8:4:1:1。3. 如權利要求2所述成套引物,其特征在于:所述成套引物中,各引物的量如下:1.6μ mol所述引物FIP、1.6ymol所述引物ΒΙΡ、0.8μπιο1所述引物LF、0.2ymol所述引物F3、0.2ymol 所述引物B3。4. 權利要求1至3中任一所述成套引物的應用,為如下a)或b)或c)或d): a) 制備用于檢測或輔助檢測大豆疫霉菌的試劑盒; b) 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌; c) 制備用于鑒定或輔助鑒定大豆疫霉菌的試劑盒; d) 鑒定或輔助鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌。5. 含有權利要求1至3中任一所述成套引物的試劑盒。6. 權利要求5所述試劑盒的制備方法,為如下(I)、(Π )或(ΙΠ ): (I)所述成套引物中各條引物分別單獨包裝; (Π )所述成套引物中各條引物按照權利要求2所述比例混合在一起; (ΙΠ )所述成套引物中各條引物按照權利要求3所述量混合在一起。7. 權利要求5所述試劑盒的應用,為如下e)或f): e) 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌; f) 鑒定或輔助鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌。8. -種檢測待測樣品是否含有大豆疫霉菌的方法,包括如下步驟: 提取待測樣品的總DNA,以權利要求1至3中任一所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增,然 后進行如下評判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述總DNA的環(huán)介導等溫擴增,則待測樣品 中含有或疑似含有大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所述總DNA的環(huán)介導等溫擴 增,則所述待測樣品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。9. 如權利要求4或7所述的應用,或,權利要求8所述的方法,其特征在于:所述待測樣品 為微生物樣品。10. -種鑒定待測菌是否為候選的大豆疫霉菌的方法,包括如下步驟: 提取待測菌的基因組DNA,以權利要求1至3中任一所述成套引物進行環(huán)介導等溫擴增, 然后進行如下評判:如果所述成套引物可以實現(xiàn)對所述基因組DNA的環(huán)介導等溫擴增,則待 測菌為候選的大豆疫霉菌;如果所述成套引物不能實現(xiàn)對所述基因組DNA的環(huán)介導等溫擴 增,則所述待測菌為候選的非大豆疫霉菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886499SQ201610064023
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年1月29日
【發(fā)明人】于杰, 李輝, 李獻剛, 邢穎新, 李雪梅, 薛春生, 李奉京
【申請人】中華人民共和國東港出入境檢驗檢疫局, 北京藍譜生物技術開發(fā)有限公司