轉(zhuǎn)基因植物中cry1Ie基因的LAMP檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)方法，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中crylle基因的引物組、試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2014年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積高達(dá)1.815億公頃，比1996年商業(yè)化初期增長(zhǎng)了100余倍。目前商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性狀為抗蟲(chóng)和抗除草劑。來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的抗蟲(chóng)基因是目前在轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用最廣的抗蟲(chóng)基因，包括(^71厶13、(^71?、(^7116、(^71(]、(^734厶13、(^735八13、vip3A等，其中crylle基因是我國(guó)自主研發(fā)的一種高效抗蟲(chóng)基因，已廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因玉米、大豆的新品種研究中。針對(duì)crylle基因開(kāi)展快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法研究，是轉(zhuǎn)基因生物安全管理相關(guān)法律法規(guī)順利實(shí)施的技術(shù)支撐和保障。
[0003]轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)主要分為兩大類:一類以外源DNA為檢測(cè)對(duì)象，如PCR、基因芯片等，另一類以外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象，如ELISA、免疫試紙條等。在上述方法中，目前PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，但基于PCR的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(約3?4 h)，難以達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)目的，因此，在實(shí)際工作中需要一種更加便捷、準(zhǔn)確、且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)新技術(shù)。
[0004]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社在2000年開(kāi)發(fā)的一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點(diǎn)是:①恒溫?cái)U(kuò)增:整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件(60?65°C)進(jìn)行，不需要特殊儀器設(shè)備;②快速尚效:整個(gè)擴(kuò)增和廣物檢測(cè)可在1 h內(nèi)完成;③尚特異性:針對(duì)革E1標(biāo)序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條檢測(cè)引物，擴(kuò)增特異性高;④高靈敏度:檢測(cè)極限可低至10個(gè)拷貝或更低;⑤鑒定簡(jiǎn)便:可通過(guò)肉眼或濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)的沉淀變化，或在反應(yīng)管中加入染色劑后通過(guò)肉眼觀察顏色變化等方法，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行便捷的檢測(cè)。
[0005]LAMP方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中cry 11 e基因的檢測(cè)方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開(kāi)一種轉(zhuǎn)基因植物中crylle基因的LAMP檢測(cè)引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開(kāi)一種轉(zhuǎn)基因植物中crylle基因的LAMP檢測(cè)試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開(kāi)一種基于上述引物組和試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中cry 11 e基因的LAMP檢測(cè)方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
根據(jù)cry lie基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)cry lie基因的LAMP檢測(cè)引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1?5;確定LAMP檢測(cè)方法的技術(shù)參數(shù)，并對(duì)檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
[0010]轉(zhuǎn)基因植物中cry 11e基因的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP和環(huán)引物L(fēng)F，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物F3:CCTGCGCATGAGCGAG(SEQ ID N0:1)；
外引物B3:GGTCGATCAGCTCCTCCA(SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物FIP:AGGATCTTGCCGGCGATGCCACGAGAGCATCGACCCCT(SEQ ID N0:3)；
內(nèi)引物BIP:GCCTGTACAGCTTCATCCTGGGCGTGCTCCATGAAGATCTCC(SEQ ID N0:4)；
環(huán)引物L(fēng)F:CCGGTCTGGATGGTGCT(SEQ ID NO:5)。
[0011 ]轉(zhuǎn)基因植物中cry 1 Ie基因的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測(cè)引物溶液:由上述5條引物配制的檢測(cè)引物溶液，外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP和環(huán)引物L(fēng)F的濃度依次為4?6 ymol/L、4?6 ymol/L、32?48 ymol/L、32?48 μmol/L和4?6 ymol/L;
(2)具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶:濃度為7?9 U/yL；
(3)10X反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCKpH 8.8,100 mmol/L KC1，100 mmol/L(NH4)2S04，40?100 mmol/L MgS〇4，6?14 mol/L甜菜喊；
(4)dNTPs溶液，由濃度分別為10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(5)顯色劑:1000XSYBRGREEN I熒光染料。
[0012]優(yōu)選的，所述的檢測(cè)引物溶液中含有5ymol/L外引物F3、5 ymol/L外引物B3、40 μmol/L內(nèi)引物FIP、40 ymol/L內(nèi)引物BIP、5 ymol/L環(huán)引物L(fēng)F。
[0013]優(yōu)選的，所述的Bst DNA聚合酶的濃度為8 U/yL。
[0014]優(yōu)選的，所述的10X反應(yīng)緩沖液中MgS(k、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0015]利用以上所述的試劑盒檢測(cè)crylle基因的方法，包括如下步驟:
(1)提取待測(cè)樣品的基因組DNA；
(2)配制待測(cè)樣品的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系:在200yL PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2-5 yL、檢測(cè)引物溶液1 yL、Bst DNA聚合酶1 yL、10 X反應(yīng)緩沖液2.5 yL、dNTPs溶液2~5 yL，用滅菌去離子水或超純水補(bǔ)齊至總體積為25 yL；
(3)在反應(yīng)管蓋上加1yL的顯色劑，蓋到反應(yīng)管上；
(4)運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):將反應(yīng)管放置在恒溫水浴鍋中，65°C孵育60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:顛倒反應(yīng)管，使管蓋上的顯色劑與反應(yīng)溶液充分混合，若反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，若顯現(xiàn)橙色則為陰性。
[0016]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的crylle基因的LAMP檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是實(shí)施例2中進(jìn)行特異性檢測(cè)的結(jié)果圖，卜8依次為轉(zhuǎn)crylie基因玉米IE09S034、轉(zhuǎn)(^710基因水稻11(3-19、轉(zhuǎn)(^71?基因玉米1(]1507、轉(zhuǎn)(^734六13和(^735六13基因玉米59122、轉(zhuǎn)vip3A基因MIR162、轉(zhuǎn)dmo基因大豆M0N87708、轉(zhuǎn)aadl基因玉米DAS40278-9和非轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0020]按下列配方制備crylle基因的LAMP檢測(cè)試劑盒，每個(gè)試劑盒的規(guī)格為100次反應(yīng):
(1)檢測(cè)引物溶液:合成外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP和環(huán)引物L(fēng)F，將引物干粉用超純水分別配成濃度為100 wnol/L的母液，然后分別取5 yL外引物F3、5 yL外引物B3、40 yL內(nèi)引物FIP、40 yL內(nèi)引物BIP、5 yL環(huán)引物L(fēng)F、5 yL滅菌去離子水，放入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，充分混勻，配成100 yL的cryl Ie基因的LAMP檢測(cè)引物溶液，其中引物序列分別為:
外引物F3:CCTGCGCATGAGCGAG(SEQ ID N0:1)；
外引物B3:GGTCGATCAGCTCCTCCA(SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物FIP:AGGATCTTGCCGGCGATGCCACGAGAGCATCGACCCCT(SEQ ID N0:3)；
內(nèi)引物BIP:GCCTGTACAGCTTCATCCTGGGCGTGCTCCATGA