本發(fā)明涉及在至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下，檢測樣品中靶核酸序列的方法，其中使用包含熒光團、猝滅劑和與所述靶核酸序列互補的區(qū)域的寡核苷酸探針用于檢測。所述寡核苷酸探針的序列包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。本發(fā)明還涉及適用于該方法的寡核苷酸探針、組合物和試劑盒，及其用于診斷病原體感染的用途。

背景技術(shù)：

已使用包含熒光團/猝滅劑對的DNA探針來進行靶核酸序列的檢測。這類探針在與靶核酸結(jié)合時表現(xiàn)出猝滅活性的改變，使得能夠定量檢測靶標。探針可用于實時監(jiān)測DNA擴增，并且通過在用于待檢測靶標的各探針上使用不同的熒光團/猝滅劑對，可在同一反應中檢測不同的靶標，因此允許多重化。之前的用于檢測DNA擴增的探針系統(tǒng)的實例包括在結(jié)合靶標時表現(xiàn)出構(gòu)象改變的雜交探針(US7241596)、分子信標(US5925517)、Taqman化學(US6214979)和內(nèi)切核酸酶可切割的探針(US7435561和US20050214809)。依賴于上游引物、下游引物和鏈侵入系統(tǒng)的等溫DNA擴增方法記載于WO 2009/150467中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在某種程度上基于對在檢測試驗中與使用DNA探針相關(guān)的問題的認識，在所述檢測試驗中存在能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下，DNA探針不能提供特異的、依賴模板的信號，并且實際上甚至在不存在模板的情況下產(chǎn)生信號。這一問題引導本發(fā)明人去研究在能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的背景下可提供可靠的依賴模板的DNA擴增檢測的解決方案。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與相應的完全DNA探針相比，在標記有熒光團和猝滅劑的寡核苷酸探針的序列中摻入RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或肽核酸(PNA)核苷酸可抵抗能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白對熒光信號的破壞。

本發(fā)明提供了在至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下檢測樣品中靶核酸序列的方法，包括使所述樣品與至少一種包含熒光團、猝滅劑和與所述靶核酸序列互補的區(qū)域的寡核苷酸探針接觸，其中所述寡核苷酸探針的序列包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。

本發(fā)明還提供了包含熒光團、猝滅劑和與靶核酸序列互補的區(qū)域的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針的序列包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。本發(fā)明還提供了組合物和試劑盒，其均包括本發(fā)明的寡核苷酸探針，以及包含與所述靶核酸序列互補的區(qū)域的鏈侵入寡核苷酸和/或至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白。本發(fā)明還提供了在受試者中診斷疾病的方法，包括在來自受試者的樣品中實施本發(fā)明的檢測核酸序列的方法以檢測與所述疾病相關(guān)的靶核酸序列。

附圖說明

圖1示出了(A)重組酶、(B)單鏈DNA結(jié)合蛋白(gp32)、(C)基于鏈侵入的擴增的試劑混合物、(D)大腸桿菌(E.coli)重組酶RecA和(E)單鏈DNA結(jié)合蛋白ET-SSB對來自包含熒光團和猝滅劑的探針的信號的影響。(A)和(B)的X軸：從左至右——各測試探針的四種條件(僅探針；探針與互補模板；探針與蛋白；探針與蛋白和互補模板)。(C)的X軸：從左至右——各測試探針的兩種條件(探針和試劑組合物；探針、試劑組合物和互補模板)。(D)和(E)的X軸：從左至右——各測試探針的兩種條件(僅探針；探針與蛋白)。測試探針為DNA 16(SEQ ID NO：1)、DNA 21(SEQ ID NO：2)、2’-O-甲基RNA 16(SEQ ID NO：5)、2’-O-甲基RNA 21(SEQ ID NO：6)、2’-氟RNA 16(SEQ ID NO：7)、2’-氟RNA 21(SEQ ID NO：8)、LNA 12(SEQ ID NO：9)、PNA 14(SEQ ID NO：10)、RNA 16(SEQ ID NO：3)和RNA 21(SEQ ID NO：4)。各圖的Y軸：熒光(任意單位)。

圖2示出了通過基于鏈侵入的擴增的靶DNA擴增。A)引物、探針、鏈侵入/中間體寡核苷酸(IO)和靶DNA的構(gòu)象。B)通過使用SYBR Green實時監(jiān)測被檢測的擴增。C)使用2’-氟RNA探針SB-2FLUORO(SEQ ID NO：17)實時監(jiān)測被檢測的擴增。D)使用LNA探針(SB-LNA SEQ ID NO：18)實時監(jiān)測被檢測的擴增。E)使用天然DNA探針(SB-DNA SEQ ID NO：16)實時監(jiān)測被檢測的擴增。在B)至E)中，NTC＝無模板對照，示出模板的稀釋度。反應平行進行兩次。X軸：時間(分鐘)。各圖的Y軸：熒光(任意單位)。

圖3示出了使用包含2’-氟RNA堿基的探針實時監(jiān)測擴增，所述包含2’-氟RNA堿基的探針標記有允許檢測多個DNA靶標的不同的熒光團和猝滅劑。(A)通過使用用于艱難梭茵(Clostridium difficile)靶序列的Cy5和Iowa Black標記的探針(SC-2FLURO，SEQ ID NO：25)和用于人工靶序列的ROX和BHQ2標記的探針(SB2-FLURO，SEQ ID NO：17)擴增和檢測兩種DNA靶標。X軸：時間(分鐘)。各圖的Y軸：熒光(任意單位)。(B)使用Sybr Green I擴增后對靶標的熔解分析。X軸：溫度(攝氏度)。Y軸：-(d(熒光)/d(溫度)，任意單位)。(C)使用2’-氟RNA探針擴增后對靶標的熔解分析。X軸和Y軸如圖3(B)。

圖4示出了通過添加切割探針的RNase H2引起的2’-氟RNA探針的信號增強。(A)在存在或不存在RNase H2試劑混合物的情況下，用互補DNA孵育雙標記探針。X軸：從左至右——各測試探針的四種條件(探針與試劑混合物；探針與互補模板和試劑混合物；探針與試劑混合物和RNase H2；探針與互補模板、試劑混合物和RNase H2)。測試探針為LNA 12(SEQ ID NO：9)、PNA 14(SEQ ID NO：10)、SB-2’-O-甲基RNA 16(SEQ ID NO：32)、SB-DNA 16(SEQ ID NO：1)和SB-2’-氟RNA 16(SEQ ID NO：17)。各圖的Y軸：熒光(任意單位)。(B)使用2’-氟RNA探針SC-2FLURO(SEQ ID NO：24)在存在或不存在RNase H2的情況下艱難梭茵靶序列擴增的實時監(jiān)測。X軸：時間(分鐘)。Y軸：熒光(任意單位)。

圖5示出了用于使用系列稀釋的10⁵至10個拷貝的鼠傷寒沙門氏茵(Salmonella typhimurium)基因組DNA檢測鼠傷寒沙門氏茵的基于鏈侵入的擴增試驗的靈敏度。使用2’-氟RNA探針實時監(jiān)測擴增。使用的探針為SM-2FLURO(SEQ ID NO：30)。X軸：時間(分鐘)。Y軸：熒光(任意單位)。NTC＝無模板對照，示出了模板的稀釋度。

圖6示出了(A)在不存在RNase H2的情況下和(B)在存在RNase H2的情況下2’-氟RNA探針既未擴增也未檢測到不依賴于引物的靶標。示出了各跡線的反應條件。在存在或不存在同源反向引物(SEQ ID NO：12)或假引物SPU(SEQ ID NO：33)的情況下進行反應。通過檢測來自探針SB-2FLURO(SEQ ID NO：17)或SYBR Green的ROX熒光團實時監(jiān)測擴增。X軸：時間(分鐘)。Y軸：熒光(任意單位)。

圖7示出了使用雙功能2’-氟RNA引物/探針和天然DNA引物，通過基于鏈侵入的擴增的靶DNA擴增。(A)正向引物、反向探針引物、鏈侵入/中間體寡核苷酸(IO)和靶DNA的構(gòu)象。B)使用SYBR Green實時監(jiān)測被檢測的人工模板的擴增。所使用的引物為DNA引物SB-R20(SEQ ID NO：12)、2’-氟RNA引物SBFLURO1-RNA(SEQID NO：13)和2’-氟RNA/DNA引物SBFLURO2-RNA(SEQ IDNO：14)。C)使用標記有內(nèi)部熒光團(FAM)和5’猝滅劑的SB-R20(SEQ ID NO：12)或2’-氟RNA探針-引物(SB-2FLURO 2，SEQ ID NO：19)實時監(jiān)測被檢測的人工模板的擴增。使用SYBR Green檢測使用DNA引物(SEQ ID NO：12)的擴增；經(jīng)由FAM通道(未添加SYBR Green)檢測使用2’-氟RNA探針引物(SEQ ID NO：19)的擴增。NTC＝無模板對照，示出了模板的稀釋度。X軸：時間(分鐘)。各圖的Y軸：熒光(任意單位)。

圖8示出了在不存在互補模板的情況下，重組酶UvsX和單鏈結(jié)合蛋白T4-gp32對具有DNA和RNA堿基(DNA/RNA或DNA/2’-氟RNA或DNA/2’-O-甲基RNA)的雙標記嵌合探針的信號的影響。A)UvsX的影響。B)T4-gp32的影響。C)使用其他系列探針的額外的UvsX測定。D)使用其他系列探針的額外的T4gp32測定。所測試的探針為DNA 21(SEQ ID NO：2)、DNA 16+RNA5(SEQ ID NO：35)、DNA 10+RNA 11(SEQ ID NO：36)、DNA5+RNA16(SEQ ID NO：37)、RNA21(SEQ ID NO：4)、DNA16+2-氟RNA5(SEQ ID NO：38)、DNA10+2-氟RNA11(SEQ ID NO：39)、DNA 5+2-氟RNA 16(SEQ ID NO：40)、2-氟RNA21(SEQ ID NO：8)、DNA16+2-O-甲基RNA5(SEQ ID NO：41)、DNA10+2-O-甲基RNA11(SEQ ID NO：42)、DNA5+2-O-甲基RNA16(SEQ ID NO：43)、2-O-甲基RNA21(SEQ ID NO：6)、DNA20+RNA1(SEQ ID NO：45)、DNA19+RNA2(SEQ ID NO：46)、DNA18+RNA3(SEQ ID NO：47)、DNA17+RNA4(SEQ ID NO：48)。Y軸：熒光增加的倍數(shù)(存在UvsX或T4-gp32的情況下的熒光除以不存在UvsX或T4-gp32的情況下的熒光)，任意單位。

序列描述

SEQ ID NO：1是DNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是DNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是2’-O-甲基RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是2’-O-甲基RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是LNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是PNA探針的序列。

SEQ ID NO：11是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是2’-氟RNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是混合的DNA/2’-氟RNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是DNA鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是DNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是LNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19是混合的DNA/2’-氟RNA探針/引物的序列。

SEQ ID NO：20人工DNA靶核酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是DNA鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26來自艱難梭菌(C.difficile)ATCC BAA 1382的靶DNA核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29是DNA鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是2’-氟RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是來自鼠傷寒沙門氏茵(S.typhimurium)ATCC 14028的靶DNA核苷酸序列。

SEQ ID NO：32是2’-O-甲基RNA探針的核苷酸序列。

SEQ ID NO：33是DNA引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是SEQ ID NO 1至8的探針的互補靶DNA核苷酸序列。

SEQ ID NO：35至43表示嵌合的DNA/RNA、DNA/2’-氟RNA和DNA/2’-O-甲基RNA探針的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO：44是SEQ ID NO 9和10的探針的互補靶DNA核苷酸序列。

SEQ ID NO：45至48表示嵌合的DNA/RNA探針的核苷酸序列。

具體實施方式

應理解，所公開的方法的不同應用可根據(jù)本領(lǐng)域中的特定需要進行調(diào)整。還應理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述本發(fā)明的具體實施方案的目的，并且不意欲進行限制。此外，除非上下文中另有明確說明，本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”包括復數(shù)指代對象。因此，例如，提及“一個寡核苷酸”包括兩個或更多個這樣的寡核苷酸，等等。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請，無論在上文或在下文，都以引用的形式全文納入本文。

靶核酸序列的檢測方法

樣品

可使用任何樣品來檢測靶核酸序列，只要可從所述樣品獲得或衍生出核酸。所述樣品可以是例如環(huán)境樣品、參照樣品或臨床樣品。當本發(fā)明的方法用于通過檢測靶核酸序列診斷疾病時，所述樣品通常為臨床樣品，例如從疑似患有或患有所述疾病的患者中獲得的樣品。臨床樣品的適合類型隨著存在于或疑似存在于受試者中的疾病或感染的特定類型而變化。所述樣品可以是唾液、痰、血液、血漿、血清、尿或糞便樣品。所述樣品可以是細胞或組織樣品。在優(yōu)選的實施方案中，所述樣品取自動物受試者，例如哺乳動物受試者。所述樣品通常取自人類受試者，但是本發(fā)明通常也適用于家養(yǎng)動物、牲畜、鳥類和魚。例如，本發(fā)明可應用于獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)環(huán)境。在本發(fā)明檢測艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏茵感染的實施方案中，所述樣品優(yōu)選為糞便樣品。所述糞便樣品可取自患有胃腸道感染的受試者。所述感染可存在于患有腹瀉的患者中。

所述樣品包含核酸，其可以是DNA或RNA。如果核酸以允許進行本發(fā)明的檢測的適合形式存在于樣品中，則可直接使用所述樣品。但是，通常，核酸衍生自、獲自或提取自所述樣品。處理含核酸的樣品、提取核酸和/或純化核酸以用于檢測方法的方法是本領(lǐng)域中公知的?？煞蛛x總核酸，或單獨地分離DNA或RNA。

通常，以適當?shù)姆绞教幚順悠罚允沟靡员阌谂c寡核苷酸探針和單鏈DNA結(jié)合蛋白和任選的其他核酸組分接觸的形式提供核酸。如果所述核酸是DNA，則所述DNA通常以雙鏈形式提供。如果所述核酸是RNA，則通常使用逆轉(zhuǎn)錄酶或具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶將其轉(zhuǎn)換為cDNA。RNA可用于細菌檢測，因為細菌細胞中存在著非常大量的核糖體，其有效地增加了靶序列的濃度。除了核糖體RNA(rRNA)外，其他形式的RNA，例如轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、小干擾RNA(siRNA)、小核核糖核酸(snRNA)、microRNAs(miRNA)也可用于原核生物和真核生物檢測。

靶核酸序列

可檢測任何來源的任何靶核酸序列。所述靶核酸序列可以是人、哺乳動物、細菌或病毒的靶核酸序列。所述靶核酸序列可以是基因的區(qū)域或染色體的區(qū)域。優(yōu)選地，所述靶核酸序列對待檢測的基因型或生物體(例如病原體)是特異性的。所述靶核酸序列可以是特定物種的基因組所特有的。因此，用于檢測特定物種的靶核酸序列通常區(qū)別于相關(guān)物種中的任何同源核酸序列。通常，所述靶核酸序列包含與相關(guān)物種中的同源核酸序列的若干錯配。所述靶核酸序列可以是細菌的特定菌株或病毒的特定血清型、分離株或進化枝(clade)所特有的序列。所述靶核酸序列對艱難梭茵的產(chǎn)毒菌株或鼠傷寒沙門氏茵的菌株是特異性的。

待檢測的靶核酸序列可以是任何大小并具有任何序列。所述靶核酸序列包含與寡核苷酸探針互補的區(qū)域。通常，所述靶核酸序列在擴增的同時被探針檢測，因此其還包含與引物互補的區(qū)域。在等溫條件下通過基于鏈侵入的擴增來擴增靶核酸序列(或擴增子)時，該靶核酸序列通常具有足夠的長度以提供對靶基因型或生物體的特異檢測，并且使上游和下游引物與鏈侵入寡核苷酸以適合的方式雜交。優(yōu)選地，如從所述上游引物的5’結(jié)合位點到所述下游引物的5’結(jié)合位點所測量的，在等溫條件下用于基于鏈侵入的DNA擴增的擴增子的長度為至少45個核苷酸，更優(yōu)選長度為至少50、至少55或至少60個核苷酸。

用于檢測產(chǎn)毒艱難梭茵的適合的靶核酸序列的實例為SEQ ID NO 26。用于檢測鼠傷寒沙門氏茵的適合的靶序列的實例為SEQ ID NO 31。

通過提供兩種或更多種各自對不同的靶核酸序列具有特異性的寡核苷酸探針，可在本發(fā)明的方法中檢測多于一種靶核酸序列。通常，用不同的熒光團/猝滅劑對標記與不同靶核酸序列結(jié)合的寡核苷酸探針，因此允許多重化?？蓹z測至少2、3、4、5、10或更多種不同的靶序列?？蓹z測來自同一生物體的多于一種靶核酸序列?；蛘?，可檢測對至少2、3、4、5、10或更多種不同的基因型、生物體或病原體具有特異性的靶核酸序列。

寡核苷酸探針

所述寡核苷酸探針包含與靶核酸序列互補的區(qū)域、熒光團和猝滅劑。所述寡核苷酸探針的序列包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。換言之，存在于所述寡核苷酸探針中的至少20％的核苷酸是RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。所述寡核苷酸可包括RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸的混合物，例如RNA核苷酸和經(jīng)修飾的RNA核苷酸的混合物。或者，所述寡核苷酸探針的序列可包含DNA核苷酸和至少20％的RNA核苷酸，DNA核苷酸和至少20％的經(jīng)修飾的RNA核苷酸，或DNA核苷酸和至少20％的PNA核苷酸。

更優(yōu)選地，所述寡核苷酸探針的序列包含至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。

當所述寡核苷酸探針的長度為12至25或15至25個核苷酸時，所述寡核苷酸通常包含至少5個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸，更優(yōu)選至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。長度最多達20個核苷酸(例如長度為10至20或12至20個核苷酸)的寡核苷酸探針通常包含至少4個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸，更優(yōu)選至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。長度為20至25個核苷酸的寡核苷酸探針可包含至少12個、至少15個或至少18個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。長度為8至12個核苷酸的寡核苷酸探針可包含至少3個、至少4個或至少6個RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。所述寡核苷酸探針的序列包含足夠的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸以在存在能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白、不存在互補模板序列的情況下阻止來自探針的熒光信號。

在特別優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸探針的核苷酸序列僅由核糖核苷酸(其可以是天然核糖核苷酸或經(jīng)修飾的核糖核苷酸)組成或僅由PNA核苷酸組成。所述探針的核苷酸序列可僅由天然核糖核苷酸組成、僅由經(jīng)修飾的核糖核苷酸組成或由天然和經(jīng)修飾的核糖核苷酸的混合物組成。所述寡核苷酸探針可具有RNA核苷酸和PNA核苷酸的混合主鏈或經(jīng)修飾的RNA核苷酸和PNA核苷酸的混合主鏈。優(yōu)選的經(jīng)修飾的核糖核苷酸包括2’-氟核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸和LNA(鎖核酸)核苷酸，及其組合。上述任何百分含量或最小數(shù)目的經(jīng)修飾的RNA核苷酸可尤其適用于探針中的2’-氟核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或LNA核苷酸的比例?；蛘?，所述探針可僅由2’-氟核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或LNA核苷酸組成。其他適合的經(jīng)修飾的核糖核苷酸包括2’-O-甲氧基-乙基和其他2’-取代。

在一些實施方案中，如果所述寡核苷酸探針包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸，它還可包含脫氧核糖核苷酸，其可以是天然脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸。當所述寡核苷酸探針的長度為25個或更少核苷酸時，其通常包含少于20個、更優(yōu)選少于18個、少于15個、少于12個或少于10個脫氧核糖核苷酸。所述寡核苷酸探針可包含1至5、1至8、1至10或1至15個脫氧核糖核苷酸。當所述寡核苷酸探針包含脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸時，這些脫氧核糖核苷酸可存在于核糖核苷酸或經(jīng)修飾的核糖核苷酸序列的5’和/或3’端。所述寡核苷酸探針可在其5’和/或3’端例如包含1、2、3、4或5個脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸?；蛘?，所述脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸可散布在核糖核苷酸序列中。

所述寡核苷酸探針的長度通常為約8至約25個核苷酸。所述探針的長度通常為至少8個核苷酸，或長度少于30個核苷酸，更優(yōu)選長度少于25個核苷酸。所述探針的長度可以為至少10個、至少12個或至少15個核苷酸。所述探針的長度可以為約10至約20、約12至約25、約15至約25、或約12至約22個核苷酸。所述探針的長度根據(jù)在所使用的條件下與靶序列的區(qū)域特異性或選擇性雜交的需求進行選擇，并且可根據(jù)用于擴增靶序列的引物的長度進行選擇，如以下所討論的。

特異性或選擇性雜交是指當特定核苷酸序列存在于樣品(例如包括總的細胞和外源DNA或RNA的復合生物混合物)中的核酸中時，在給定條件下寡核苷酸(例如探針或引物)僅與該核苷酸序列結(jié)合。適合的雜交條件是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，Sambrook、Fritsche和Maniatis，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)，其以引用的方式全文納入本文。以下實施例中也提供了適合的雜交條件。如技術(shù)人員所已知的，適合的雜交條件可隨著探針長度及其堿基組成而改變。雜交通常在與擴增溫度相同的溫度下進行，因此也依賴用于擴增的酶(包括依賴擴增方法而可適用的聚合酶和重組酶)的活性譜。

所述探針的核苷酸序列可部分或完全與靶核酸序列的區(qū)域互補。長度少于25個核苷酸的寡核苷酸探針通常包含長度為至少10個、至少15個或至少20個核苷酸的區(qū)域，其與所述靶核酸序列的區(qū)域互補。所述寡核苷酸探針還可在所述互補區(qū)域的5’或3’端包含長度為1、2、3、4、5、8或10個核苷酸的側(cè)翼區(qū)，所述側(cè)翼區(qū)不與所述靶核酸序列互補。所述寡核苷酸探針可在所述互補序列側(cè)翼的5’和3’端包含共1、2、3、4或5、8或10個核苷酸，這些核苷酸不與所述靶核酸序列互補。所述側(cè)翼區(qū)可以是自身互補的，產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

所述寡核苷酸探針和所述靶核酸序列之間可存在錯配，然而仍然允許特異性檢測所述靶核酸序列，特別是當使用對所述靶序列具有特異性的上游和下游引物擴增所述靶核酸序列時。探針的結(jié)合與特異性擴增一起將特異性地檢測所述靶序列。在所述寡核苷酸探針的互補區(qū)域和所述靶核酸序列的相應區(qū)域之間可存在1、2、3、4或5個錯配。在所述探針序列中的任何錯配優(yōu)選間隔至少4個、至少5個、至少8個或至少10個核苷酸。

優(yōu)選地，所述探針與所述靶核酸序列的區(qū)域完全互補。

所述寡核苷酸探針可具有二級結(jié)構(gòu)區(qū)，該二級結(jié)構(gòu)區(qū)的構(gòu)象在與所述靶核酸序列結(jié)合時發(fā)生改變。因此，所述寡核苷酸探針可包含通過探針的5’和3’端的自身互補區(qū)域形成的發(fā)夾莖(stem)和包含靶序列的互補區(qū)的環(huán)形區(qū)域。在這樣的實施方案中，熒光團和猝滅劑通常位于探針的5’和3’端，在莖區(qū)域彼此緊密鄰近，使得在不存在靶核酸序列時熒光被猝滅。所述寡核苷酸探針可以是分子信標探針。在其他實施方案中，所述寡核苷酸探針不具有任何二級結(jié)構(gòu)區(qū)或不是分子信標探針。

所述寡核苷酸探針可同時具有探針和引物功能。因此，所述寡核苷酸探針可以能夠引發(fā)其靶核酸序列的擴增。作為引物的寡核苷酸探針可僅由RNA、經(jīng)修飾的RNA或PNA組成?；蛘?，作為引物的寡核苷酸探針可包含1至5、1至8、1至10或1至15個脫氧核糖核苷酸。作為引物的寡核苷酸探針在其3’端可包含至少1個脫氧核糖核苷酸，更優(yōu)選在其3’端可包含至少兩個或至少3個脫氧核糖核苷酸。所述寡核苷酸探針可以是針對其靶核酸序列的上游或下游引物。具有引物功能的寡核苷酸探針具有游離的3’端并且在探針序列的內(nèi)部位置處包含熒光團和猝滅劑之一或兩者。具有引物功能的寡核苷酸探針可在5’端具有熒光團并且在內(nèi)部位置處具有猝滅劑，或在3’端具有猝滅劑并且在內(nèi)部位置處具有熒光團。本發(fā)明的寡核苷酸探針作為引物的用途在下文中有更詳細的描述。

可用任何熒光團和任何猝滅劑標記所述寡核苷酸探針。選擇熒光團和猝滅劑，以使猝滅劑的吸收光譜與熒光團的發(fā)射光譜重疊。還將進一步選擇熒光團和猝滅劑并將其在所述探針中定位，使得在與靶模板雜交時，由于猝滅效應降低，所述熒光團產(chǎn)生的信號增加。

所述猝滅劑可以是非熒光的，例如非熒光生色團。所述猝滅劑可以是暗猝滅劑?；蛘?，所述猝滅劑可發(fā)出具有不同于熒光團的發(fā)射光譜的熒光，使得當特異性地監(jiān)測熒光團或猝滅劑的熒光時，任一信號的改變可報告與靶模板的雜交。熒光團和猝滅劑優(yōu)選定位于所述探針的5’和3’末端，特別是在不需要依賴聚合酶的探針的延伸的實施方案中。所述熒光團可位于探針的5’末端，并且所述猝滅劑位于探針的3’末端。或者，所述猝滅劑可位于探針的5’末端，并且所述熒光團位于探針的3’末端。所述熒光團和/或猝滅劑也可位于探針的內(nèi)部位置，例如距離探針的5’或3’末端10個或更少核苷酸處。例如，在長度少于25個核苷酸的探針中，熒光團或猝滅劑可位于距離探針的5’或3’末端1至3、1至5、1至8或1至10個核苷酸處。優(yōu)選地，熒光團和猝滅劑中僅有一個位于內(nèi)部位置，所述對中的另一個成員位于5’或3’末端。

所述熒光團和猝滅劑在探針序列中的位置通常間隔至少8個核苷酸，更優(yōu)選間隔至少10個或至少12個核苷酸，這取決于探針的長度。當探針長度為15至25個核苷酸時，所述熒光團和猝滅劑可間隔至少8個、至少10個、至少12個、至少15個或至少20個核苷酸。所述熒光團和猝滅劑可位于5’和3’末端，這是探針中可間隔的最大距離。選擇熒光團和猝滅劑之間的距離，使得當探針與靶核酸序列(處于開放或線性構(gòu)象)雜交時由猝滅劑導致的熒光團的猝滅減少，產(chǎn)生表示存在靶核酸序列的可檢測信號。熒光團和猝滅劑之間的適合的距離可通過經(jīng)驗來優(yōu)化。

所述熒光團可以是任何熒光部分，通常為熒光有機染料。所述猝滅劑可以是使熒光團的熒光猝滅的任何部分，通常為發(fā)色分子，例如有機染料。技術(shù)人員能夠根據(jù)公知常識來選擇適合寡核苷酸探針的熒光團-猝滅劑對。適合的配對論述于例如以下文獻中：Marras SE：Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes.In：Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes.Edited by Didenko V，vol.335：Humana Press；2006：3-16；和Didenko VV：DNA probes using fluorescence resonance energy transfer(FRET)：designs and applications.Biotechniques 2001，31(5)：1106-1116，1118，1120-1101。

適合的熒光團包括但不限于熒光素和熒光素衍生物，例如羧基熒光素(FAM，包括6-FAM、5-FAM、dT FAM)，VIC，六氯-6-羧基熒光素(HEX)和JOE，5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，香豆素和香豆素衍生物例如3-苯基-7-異氰酰基香豆素、熒光黃、NED、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5-羧基羅丹明、N-(對-2-苯并噁唑基)苯基)馬來酰亞胺，花青染料例如CY5，羅丹明染料，噸染料，萘胺，吖啶類，苯并噁二唑，芪類和芘類。適合的猝滅劑包括但不限于DABSYL、4′-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-馬來酰亞胺(DABMI)、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、黑洞猝滅劑1、黑洞猝滅劑2、暗猝滅劑1、暗猝滅劑2、Iowa Black RQ、Iowa Black FQ。

優(yōu)選的熒光團/猝滅劑配對包括：

-TAMRA和黑洞猝滅劑2；

-ROX和黑洞猝滅劑2；

-ROX和DABCYL；

-FAM(例如dT-FAM)和Iowa Black FQ；

-FAM(例如dT-FAM)和DABCYL；

-ROX和Iowa Black FQ；

-CY5和Iowa Black RQ。

熒光團和猝滅劑通常與探針共價連接。所述熒光團和猝滅劑可通過任何適合的接頭與探針序列中存在的一個或多個核苷酸連接。技術(shù)人員能夠根據(jù)公知常識來選擇任何適合的接頭。適合的接頭論述于例如AgrawalS(ed.)：Protocols for Oligonucleotides and Analogs：Synthesis andProperties：Humana Press；1993中。

本文提供的特定的寡核苷酸探針與產(chǎn)毒艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏茵中的核酸靶序列互補。所述探針的優(yōu)選實例為用于產(chǎn)毒艱難梭菌的SEQID NO 24和25，以及用于鼠傷寒沙門氏茵的SEQ ID NO：30。本發(fā)明還提供了SEQ ID NO 3至10、17至19、32、35至43和48的探針和探針-引物。

還提供了作為本發(fā)明一部分的SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30、32、35至43和48的變體。SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30、32、35至43和48的變體包括具有與原始探針的序列相應的核苷酸序列但是包含替代熒光團和/或猝滅劑的探針。以上變體可包含來自本文所述的熒光團和猝滅劑的任何適合的熒光團-猝滅劑對。

SEQ ID NO3至10、17至19、24、25、30、32、35至43和48的變體也可具有與原始探針的序列相應的核苷酸序列，其由不同模式的天然核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核糖核苷酸或PNA核苷酸組成。例如，SEQ ID NO 24、25和30的原始探針由2’-氟核糖核苷酸組成。其變體的核苷酸序列可包含天然核糖核苷酸或僅由天然核糖核苷酸組成。其其他變體可包含替換2’-氟核糖核苷酸的替代的經(jīng)修飾的核糖核苷酸，或天然和經(jīng)修飾的核糖核苷酸的混合物。優(yōu)選的替代的經(jīng)修飾的核糖核苷酸包括2’-O-甲基核糖核苷酸和LNA(鎖核酸)核苷酸。因此，例如，SEQ ID NO 24、25和30的變體可由2’-氟核糖核苷酸和1至8、1至5或1至3個天然核糖核苷酸組成，或由2’-氟核糖核苷酸和1至8、1至5或1至3個2’-O-甲基核糖核苷酸組成。SEQ ID NO 24、25和30的變體可包含至少20％的相應的LNA或PNA核苷酸，或僅由相應的LNA或PNA核苷酸組成。

變體探針也可以是嵌合探針，其包含1至10、1至5或1至3個脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸以替換SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30、32和35至43的序列中相應的核糖核苷酸或PNA核苷酸。本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：16的DNA探針的變體，其包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。

SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30、32、35至43和48的變體也可以是長度小于25個核苷酸的寡核苷酸，其包含與相應的原始探針序列的至少8個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。優(yōu)選地，所述變體包含與相應的原始探針序列的至少9個、至少10個、至少12個或至少14個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。以上變體可包含與原始探針序列(以及因此與靶序列)的相應區(qū)域具有1、2、3、4或5個錯配(置換)的區(qū)域，因此與其部分互補。因此，例如，所述變體可包含長度至少為12個核苷酸的區(qū)域，其與原始探針序列的至少12個核苷酸的相應區(qū)域具有1、2或3個錯配。任何錯配優(yōu)選間隔至少4個、至少5個或至少8個核苷酸。

SEQ ID NO 3至10、17至19、24、25、30和32的變體也可以是長度小于25個核苷酸的寡核苷酸，其與相應的原始探針序列具有至少70％的序列同一性，優(yōu)選至少75％、至少80％，更優(yōu)選至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

以上變體探針可包含與原始探針部分或完全互補的區(qū)域的5’和/或3’側(cè)翼區(qū)。所述5’和/或3’側(cè)翼區(qū)可包含與靶核酸序列不互補的序列，或與靶核苷酸序列中位于原始探針結(jié)合區(qū)的側(cè)翼的區(qū)域互補的序列。例如，在SEQ ID NO 24、25和30的變體中，5’側(cè)翼區(qū)可包含長度為1-10或1-5個核苷酸的序列，其與SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：31的相關(guān)靶核酸序列中的探針結(jié)合區(qū)5’端的1-10或1-5個核苷酸互補。

信號的檢測

可通過任何適合的檢測熒光的方法進行來自探針的信號的檢測。所述探針可用于檢測靶核酸序列，之前不用進行任何DNA擴增。更通常地，所述探針可用于在靶核酸序列擴增之后或擴增過程中檢測靶核酸序列。優(yōu)選地，在擴增所述靶核酸序列的同時實時監(jiān)測來自探針的信號。

可檢測來自針對單一靶序列的一個探針的單一信號?；蛘?，可使用檢測不同的靶序列的探針，其中在不同的熒光波長處的各信號提供多重檢測。可使用兩種或更多種(例如，3、4、5、6、8、10或更多種)不同的探針用于在單一反應中多重檢測若干不同的靶序列。

也可同時使用嵌入有擴增的DNA的染料以及寡核苷酸探針以檢測DNA擴增，所述染料例如SYBR綠和噻唑橙。

也可同時使用針對相同或替代靶序列的DNA寡核苷酸探針以及寡核苷酸探針。

本發(fā)明也提供了增強來自探針的信號的方法?？墒勾M行靶核酸序列檢測的樣品與RNase H酶(例如RNase H2)接觸。優(yōu)選的RNase H2酶是Thermococcus gammatolerans RNase H2。如由本發(fā)明人所表明的，RNase H酶能夠增強來自探針的信號。認為RNase H酶切割寡核苷酸探針與靶核酸序列雜交時形成的雙鏈體，從而使猝滅減少。

更通常地，可使樣品與任何能夠特異性地降解寡核苷酸探針/靶核酸序列雙鏈體的核酸酶接觸。

靶核酸序列的擴增

當本發(fā)明的方法包括靶核酸序列的擴增時，可使用任何適合的DNA擴增方法。通常，在等溫條件下進行DNA擴增。所述DNA擴增方法可包括基于鏈侵入的擴增、滾環(huán)擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)。優(yōu)選基于鏈侵入的擴增(SIBA)。以上擴增方法通常要求存在能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白，因此本發(fā)明的寡核苷酸探針便利地允許檢測所述方法中的擴增。

因此，本發(fā)明提供了在至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下檢測樣品中靶核酸序列的擴增的方法，包括在促進所述靶核酸序列擴增的條件下使所述樣品與本發(fā)明的寡核苷酸探針接觸。

所述條件通常包括存在一種或多種引物和DNA聚合酶。技術(shù)人員能夠根據(jù)待使用的DNA聚合酶的類型選擇適用于特定靶序列的引物。當所述DNA聚合酶是RCA酶(例如phi29)時，可使用擴增靶核酸序列的隨機引物或單一種類(species)的引物。更通常地，所述擴增條件包括存在針對靶核酸序列的上游引物和下游引物。

如以上所討論的，所述寡核苷酸探針可提供引物功能，因此擴增條件可包括存在作為下游引物的寡核苷酸探針和單獨的上游引物(以及任選的無其他下游引物)，或存在作為上游引物的寡核苷酸探針和單獨的下游引物(以及任選的無其他上游引物)。

當使用SIBA時，所述條件通常還包括存在鏈侵入寡核苷酸。SIBA擴增的優(yōu)選的引物和鏈侵入寡核苷酸的特征在下文中更詳細地描述。

用于擴增靶核酸序列的適合的條件還包括本領(lǐng)域已知的用于提供聚合酶活性的任何條件。所述條件通常包括存在全部四種dNTP——dATP、dTTP、dCTP和dGTP或其類似物，適合的緩沖劑/pH，以及酶性能或穩(wěn)定性所需的其他因素。所述條件可包括存在洗滌劑和穩(wěn)定劑。所使用的溫度通常是等溫，即在整個擴增過程中是恒定的。所使用的溫度通常取決于聚合酶和其他酶組分的性質(zhì)，也反映引物和鏈侵入寡核苷酸所需的雜交溫度。

所使用的聚合酶通常具有鏈置換活性。本文使用術(shù)語“鏈置換”來描述DNA聚合酶(任選地與輔助蛋白聯(lián)合)在DNA合成過程中在遇到雙鏈DNA區(qū)域時置換互補鏈的能力。適合的DNA聚合酶包括來自大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的polI及其功能性片段或變體，以及T4和T7DNA聚合酶及其功能性片段或變體。優(yōu)選的聚合酶為Bsu DNA聚合酶或其功能性片段或變體。

所述擴增條件包括存在能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白。所述能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白可以是在不存在互補模板的情況下引起標記有熒光團和猝滅劑的寡核苷酸探針的熒光信號改變并且能夠結(jié)合于單鏈DNA的任何蛋白。所述蛋白可以是任何單鏈結(jié)合蛋白(SSB)或任何能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白，并且也具有另一種功能活性。所述能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白可以是重組酶或重組酶輔助蛋白或輔因子。所述能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白可以是嗜溫的或嗜熱的。

所述擴增條件優(yōu)選包括存在重組酶。任何重組酶系統(tǒng)可用于本發(fā)明的方法中。所述重組酶系統(tǒng)可以是原核生物來源或真核生物來源的，并且可以是細菌、酵母、噬菌體或哺乳動物來源的。所述重組酶可以5’-3’方向或3’-5’方向聚合到單鏈寡核苷酸上。所述重組酶可獲自肌病毒科(myoviridae)噬菌體，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40，不動桿菌屬(Acinetobacter)噬茵體133，氣單胞茵屬(Aeromonas)噬茵體65，噬藍藻體(cyanophage)P-SSM2，噬藍藻體PSSM4，噬藍藻體S-PM2、Rbl4、Rb32，氣單胞茵屬噬茵體25，弧茵屬(Vibrio)噬茵體nt-1、phi-1、Rbl6、Rb43，噬茵體31，噬茵體44RR2.8t，Rb49，噬茵體Rb3或噬茵體LZ2。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用T4重組酶UvsX(登錄號：P04529)或其功能變體或片段。也可使用真核生物的Rad系統(tǒng)或大腸桿菌的recA-Reco系統(tǒng)或其他原核生物系統(tǒng)。所述重組酶可以是大腸桿菌RecA。

所述條件還可包括存在重組酶輔助蛋白，例如單鏈結(jié)合蛋白(例如，T4gp32，登錄號P03695)和重組酶載劑(loading agent)(例如，UvsY，登錄號NP_049799.2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述條件包括存在T4gp32、UvsX和UvsY蛋白。所述重組酶(例如UvsX)，以及(如果使用的話)重組酶載劑(例如UvsY)和單鏈DNA結(jié)合蛋白(例如gp32)，均可來自相同或不同的肌病毒科噬茵體來源的天然、雜合或突變蛋白。天然蛋白可以是蛋白的野生型或天然變體。

或者，能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白可以是用于在DNA擴增方法中提供單鏈結(jié)合活性的任何蛋白。所述擴增方法可以是PCR。所述能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白可以是極高熱穩(wěn)定性單鏈DNA結(jié)合蛋白(ET-SSB)，其可獲自新英格蘭Biolabs。

所述條件還可包括用于增強重組酶效率的其他因子，例如用于調(diào)控DNA相互作用的化合物，例如，脯氨酸、DMSO或已知增強重組酶加載到DNA上的擁擠試劑(crowding agent)(Lavery P.et al.J.Biol.Chem.1992，267，(13)，9307-9314)。

所述條件也可包括存在ATP再生系統(tǒng)。多種ATP再生系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括糖酵解酶。ATP再生系統(tǒng)的適合組分可包括磷酸肌酸、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖和蔗糖磷酸化酶中的一種或多種。所述條件可還包括存在ATP。

也可包括其他組分，例如鎂離子、DTT或其他還原劑、鹽類、BSA/PEG或其他擁擠試劑。

可以不同的濃度提供上述各種組分以進行DNA擴增。技術(shù)人員能夠在實踐中選擇所述各種組分的適合的工作濃度。當寡核苷酸探針與上游或下游引物的序列重疊時，通過使用更低濃度的探針或重疊區(qū)減小的探針(例如，從3’端比較，長度比反向引物更短的探針)可使在引物的結(jié)合和探針的結(jié)合之間觀察到的任何競爭最小化。

基于鏈侵入的擴增(SIBA)

用于擴增靶核酸序列的優(yōu)選方法SIBA的特征在下文中討論。本發(fā)明提供了在至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下檢測樣品中靶核酸序列的擴增的方法，包括在促進所述靶核酸序列擴增的條件下使所述樣品與至少一種本發(fā)明的寡核苷酸探針、至少一種上游引物、至少一種下游引物和至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸。如以上所討論的，所述寡核苷酸探針自身可作為上游引物或下游引物，或者提供單獨的上游和下游引物以及寡核苷酸探針。所述引物、所述探針和所述鏈侵入寡核苷酸均包含與所述靶核酸序列互補的區(qū)域。所述鏈侵入寡核苷酸使至少一部分靶核酸序列成為單鏈以允許結(jié)合各所述引物和所述探針。

針對SIBA的引物

根據(jù)目的靶核酸序列，以及考慮鏈侵入寡核苷酸的結(jié)合位點，選擇適合的上游和下游引物，所述鏈侵入寡核苷酸使至少一部分靶核酸序列成為單鏈以允許結(jié)合上游引物和下游引物。所述上游和下游引物包含與靶序列部分或完全互補的序列，以及任選的5’和/或3’側(cè)翼非互補序列?；蛘撸錾嫌魏拖掠我锟扇坑膳c靶序列部分或完全互補的序列組成。與所述靶序列互補的引物序列的長度足以提供與所述靶核酸序列的特異性雜交?；パa序列的長度通常為至少10個核苷酸，更優(yōu)選至少15、至少16或至少17個核苷酸。互補序列的長度可以為10-25、15-25、10-30或15-30個核苷酸。

應理解，以上序列長度是指部分或完全與靶核酸序列互補的引物的部分。在特定的位置可存在引物和靶序列之間的錯配，而仍允許靶序列的特異性擴增和檢測，特別是考慮到為實現(xiàn)擴增而組合使用上游和下游引物以及鏈侵入寡核苷酸的情況。在引物的互補區(qū)域和靶序列的對應區(qū)域之間可存在1、2、3、4或5個錯配。

通常上游和下游引物的總長度少于30個核苷酸，更優(yōu)選長度少于25個核苷酸，例如長度為15至25或15至23個核苷酸。當重組酶用于鏈侵入時，特別優(yōu)選使用長度少于30個核苷酸的引物。這樣的引物不能作為重組酶的底物。

所述上游(或正向)引物在靠近鏈侵入寡核苷酸的5’結(jié)合位點或與該鏈侵入寡核苷酸的5’結(jié)合位點重疊的位置結(jié)合于雙鏈體靶核酸序列中的一條鏈的5’區(qū)。所述下游(或反向)引物在靠近鏈侵入寡核苷酸的3’結(jié)合位點或與該鏈侵入寡核苷酸的3’結(jié)合位點重疊的位置結(jié)合于雙鏈體靶核酸序列中的相對鏈的5’區(qū)。所述上游和下游引物的5’結(jié)合位點在雙鏈體靶序列上通常間隔至少45個核苷酸，更優(yōu)選至少50個、至少55個或至少60個核苷酸。

所述上游和/或下游引物可具有與所述鏈侵入寡核苷酸序列的序列重疊區(qū)。所述序列重疊區(qū)的長度通常為1-8個核苷酸，長度可以是至少5個或至少6個核苷酸。所述下游引物也可具有與鏈侵入寡核苷酸序列重疊長度為1-8個核苷酸的序列區(qū)。或者，所述上游和/或下游引物和所述鏈侵入寡核苷酸之間可沒有序列重疊，引物轉(zhuǎn)而結(jié)合于靶序列中靠近鏈侵入寡核苷酸的結(jié)合位點的位置。

當引物結(jié)合于鏈侵入寡核苷酸附近時，鏈侵入寡核苷酸的相關(guān)結(jié)合位點和引物的5’端之間通常有25個核苷酸或更少，更優(yōu)選20個核苷酸或更少、15個核苷酸或更少，或10個核苷酸或更少。這確保所述引物能夠與通過鏈侵入寡核苷酸的結(jié)合而產(chǎn)生的單鏈區(qū)雜交。

優(yōu)選地，設(shè)計各引物以允許特異性檢測特定的靶核酸序列，例如存在于特定的靶標(例如特定的生物體或特定的病原體)中的特定的基因型或核酸序列。因此，各引物通常與僅存在于靶標中的互補序列特異性或選擇性地雜交。但是，各引物也可與其他序列(例如存在于其他物種中的序列)雜交，條件是當各引物與第二引物、鏈侵入寡核苷酸和寡核苷酸探針組合使用時獲得所述靶核酸序列的特異性檢測。

本文提供了用于擴增產(chǎn)毒艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏茵中的靶核苷酸序列的適合的上游和下游引物的具體實例。本發(fā)明提供了SEQ ID NO 21和22或其變體的引物用于擴增產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列(例如SEQ ID NO：26)，以及SEQ ID NO 27和28或其變體的引物用于擴增鼠傷寒沙門氏茵的靶核酸序列(例如SEQ ID NO：31)。

SEQ ID NO 21、22、27和28的變體可以是長度最多達30個核苷酸的寡核苷酸，其包含與SEQ ID NO：21、22、27和28的相應原始引物序列的至少10個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。優(yōu)選地，所述變體包含與SEQ ID NO：21、22、27和28的相應原始引物序列的至少11、12、13、14或15個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。當所述原始引物序列的長度大于16個核苷酸(例如長度最多達21個核苷酸(例如SEQ ID NO：21))時，所述變體可相應地包含與其16、17、18、19或20個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。

以上變體可包含與所述原始引物序列(以及因此與靶序列)的相應區(qū)域具有1、2、3、4或5個錯配(置換)的區(qū)域，因此與其部分互補。因此，例如，所述變體可包含長度為至少10個核苷酸的區(qū)域，所述區(qū)域與所述相應原始引物序列的至少10個連續(xù)核苷酸的相應區(qū)域具有1、2或3個錯配，例如1或2個錯配。所述變體可包含長度為至少13、14或15個核苷酸的區(qū)域，所述區(qū)域與所述相應原始引物序列中等效長度的相應區(qū)域具有1、2、3、4或5個錯配，例如1-3個錯配。所述變體引物序列中的任何錯配可間隔至少2個、至少4個、至少5個或至少10個核苷酸。

或者，所述變體可包含長度至少為10、11、12、13、14或15個核苷酸的區(qū)域，其與所述原始引物序列完全互補。

SEQ ID NO 21、22、27和28的變體也可以是長度最多達30個核苷酸的寡核苷酸，其與所述相應原始引物序列具有至少70％的序列同一性，優(yōu)選至少75％、至少80％，更優(yōu)選至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性。

此外，所述變體引物可包含部分或完全與所述原始引物序列互補的區(qū)域的5’和/或3’側(cè)翼核苷酸序列。所述5’和/或3’側(cè)翼序列可以是與靶核酸序列非互補的，或可與位于所述靶核酸序列中原始引物的結(jié)合區(qū)側(cè)翼的區(qū)域(例如所述靶核酸序列中原始引物的結(jié)合區(qū)的5’和/或3’端的5-10個核苷酸)序列互補。

用于SIBA的鏈侵入寡核苷酸

基于目的靶核酸序列，并且考慮上游和下游引物的結(jié)合位點以及鏈侵入寡核苷酸使靶核酸序列在相關(guān)區(qū)域成為單鏈以允許結(jié)合上游引物和下游引物的需要，選擇適合的鏈侵入寡核苷酸。

所述鏈侵入寡核苷酸包含與靶標互補的序列和任選的其他側(cè)翼非互補序列。與所述靶標互補的序列的長度可由技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定，并且其足以提供對所述靶核酸序列的有效鏈侵入，任選地在等溫條件下。所述互補序列可包含RNA-DNA互補堿基配對和經(jīng)修飾的核苷酸。通常，互補序列的長度為至少25或至少27個核苷酸，通常至少30個核苷酸，例如至少32個、至少33個或至少35個核苷酸，更優(yōu)選長度為至少36、37、38、39或40個核苷酸或更多?；パa序列的長度可以是30-50、32-50、35-50、40-50、35-48、35-46、38-45或40-45個核苷酸。

應理解，以上序列長度是指可部分或完全與靶核酸序列互補的鏈入侵寡核苷酸的一部分。在特定的位置可在鏈侵入寡核苷酸和靶序列之間存在錯配，而仍允許靶序列的特異性擴增和檢測，特別是考慮到為實現(xiàn)擴增而組合使用上游和下游引物以及鏈侵入寡核苷酸的情況。鏈侵入寡核苷酸的互補區(qū)域和靶序列的相應區(qū)域之間可存在1、2、3、4、5、6、7或8個錯配，這取決于互補序列的總長度。

所述鏈侵入寡核苷酸的互補序列與靶序列插入上游和下游引物的結(jié)合區(qū)之間(并且通常與上游和下游引物的一種或更多種重疊)的一部分雜交。所述鏈侵入寡核苷酸與上游和/或下游引物可具有長度為1-8個核苷酸的重疊區(qū)，例如長度為至少5個或至少6個核苷酸的區(qū)域。所述鏈侵入寡核苷酸的互補序列的5’部分通常在距離待熔解的雙鏈體靶核苷酸序列(擴增子)的5’邊界的25個核苷酸或更少核苷酸、更優(yōu)選20個核苷酸或更少核苷酸以內(nèi)結(jié)合。

所述鏈侵入寡核苷酸任選地還包含所述靶標的非互補序列區(qū)，所述非互補序列區(qū)位于互補序列區(qū)域側(cè)翼。所述鏈侵入寡核苷酸可包含非互補5’區(qū)，其可以具有任何核苷酸序列。所述5’非互補區(qū)的長度通常為至少3個核苷酸，更通常的長度為至少6個、至少8個、優(yōu)選至少10個、至少12個或至少14個核苷酸。所述5’非互補區(qū)可輔助重組酶的結(jié)合。所述鏈侵入寡核苷酸可包含長度通常為1-3個核苷酸的3’非互補區(qū)，其包含阻斷聚合酶延伸的核苷酸(例如invdT)。

當重組酶與寡核苷酸聯(lián)合使用時，所述鏈侵入寡核苷酸的長度通常為至少30個核苷酸。所述鏈侵入寡核苷酸的長度優(yōu)選為至少35個、至少40個或至少45個核苷酸，更優(yōu)選為至少50個，并且長度可以為至少55個核苷酸或更多。所述鏈侵入寡核苷酸的長度可以是40-70、45-70、45-70、50-70、55-70、45-65、50-65、50-60或55-65個核苷酸。

通常，所述鏈侵入寡核苷酸具有不可延伸的3’末端，使得其不能充當DNA擴增的底物，然后僅在特異性的上游和下游引物進一步結(jié)合時才擴增所述靶序列。這避免了非特異性擴增產(chǎn)物的形成。所述鏈侵入寡核苷酸在其3’區(qū)(例如在距離3’末端10-15或10-20個核苷酸內(nèi))可包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個經(jīng)修飾的核苷酸。所述鏈侵入寡核苷酸可包含對3’末端核苷酸的3’修飾，并且可以是雙脫氧核苷酸，或可包含3’氨基-烯丙基、3’碳間隔基(spacer)、3’磷酸、3’生物素、3’唾液?；?’巰基。所述3’核苷酸可以是通過3’-3’鍵反向摻入的核苷酸?？蛇x地或另外地，所述鏈侵入寡核苷酸的3’區(qū)可包含具有差的DNA聚合酶底物能力的核苷酸，例如PNA(肽核酸)核苷酸、LNA(鎖核酸)、2’-5’連接的DNA或2’-O-甲基RNA，或其組合。

當所述鏈侵入寡核苷酸是完全由PNA組成的PNA寡聚體時，這樣的寡核苷酸在不存在重組酶時可使雙鏈體DNA不穩(wěn)定并侵入。因此，當使用PNA寡核苷酸時，可在不存在重組酶的情況下進行本發(fā)明的方法。

本文提供了用于產(chǎn)毒艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏茵中靶核苷酸序列的適合的鏈侵入寡核苷酸的具體實例。本發(fā)明提供了SEQ ID NO：23或其經(jīng)修飾的衍生物或變體的鏈侵入寡核苷酸，用于擴增產(chǎn)毒艱難梭茵的靶核酸序列(例如SEQ ID NO：26)；以及SEQ ID NO 29或其經(jīng)修飾的衍生物或變體的鏈侵入寡核苷酸，用于擴增鼠傷寒沙門氏茵的靶核酸序列(例如SEQ ID NO：31)。

如以上所討論的，優(yōu)選本發(fā)明中所使用的鏈侵入寡核苷酸在其3’區(qū)包含一個或多個經(jīng)修飾的寡核苷酸以阻止其用作聚合酶底物。因此，SEQ ID NO：23或29的經(jīng)修飾的衍生物在其3’區(qū)(通常在距離3’末端10-15或10-20個核苷酸內(nèi))可包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個經(jīng)修飾的核苷酸。所述修飾可選自以上討論的那些中的任一種。所述經(jīng)修飾的衍生物可以是SEQ ID NO：23或29的相應序列的PNA寡聚體。

SEQ ID NO 23和29的變體通常是長度大于30個核苷酸，更優(yōu)選至少35個、至少40個或至少45個核苷酸的寡核苷酸，其包含與SEQ ID NO：23或29中存在的相應原始靶互補序列的至少30個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。優(yōu)選地，所述變體包含與SEQ ID NO：23或29中存在的靶互補序列的至少32、35、37、40、42或45個連續(xù)核苷酸部分或完全互補的區(qū)域。

以上變體可包含與SEQ ID NO：23或29的原始鏈侵入寡核苷酸的相應靶互補區(qū)(以及因此與靶序列)具有1、2、3、4、5、6、7或8個錯配(置換)的區(qū)域，因此與其部分互補。因此，例如，所述變體可包含長度為至少30個核苷酸的區(qū)域，其與相應的原始鏈侵入寡核苷酸的至少40個連續(xù)核苷酸的相應區(qū)域具有1、2、3或4個(例如1-4或1-3個)錯配。所述變體可包含長度為至少35、40、42或45個核苷酸的區(qū)域，其與相應的原始鏈侵入寡核苷酸中等效長度的相應區(qū)域具有1、2、3、4、5或6個(例如1-5或1-3個)錯配。所述變體鏈侵入寡核苷酸序列中的任何錯配可間隔至少2個、至少4個、至少5個或至少10個核苷酸。

或者，所述變體可包含長度為至少32、35、37、40、42或45個核苷酸的區(qū)域，其與原始鏈侵入寡核苷酸的靶互補區(qū)完全互補。

SEQ ID NO 23和29的變體也可以是包含靶互補區(qū)域的長度大于30個核苷酸的寡核苷酸，所述靶互補區(qū)域與相應的原始鏈侵入寡核苷酸的靶互補序列具有至少70％的序列同一性，優(yōu)選至少75％、至少80％，更優(yōu)選至少85％、至少90％、至少95％的序列同一性。

所述變體鏈侵入寡核苷酸可包含與所述原始鏈侵入寡核苷酸序列部分或完全互補的區(qū)域的5’和/或3’側(cè)翼核苷酸序列。所述5’和/或3’側(cè)翼序列可以是與靶核酸序列非互補的，或可與位于所述靶核酸序列中原始鏈侵入寡核苷酸的結(jié)合區(qū)側(cè)翼的區(qū)域(例如，所述靶核酸序列中原始鏈侵入寡核苷酸的結(jié)合區(qū)的5’和/或3’端的5-10或5-15個核苷酸)的序列互補。

所述變體鏈侵入寡核苷酸的其余序列通常與靶序列無關(guān)，并且也通常與原始鏈侵入寡核苷酸無關(guān)。

所述變體鏈侵入寡核苷酸在其3’區(qū)還包含一個或多個經(jīng)修飾的寡核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8或更多個經(jīng)修飾的寡核苷酸，其可在距離3’末端的10-15或10-20個核苷酸內(nèi)。所述修飾可選自以上討論的那些中的任一種。

靶核苷酸序列的檢測

本發(fā)明提供了用于檢測靶核苷酸序列的上游和下游引物、寡核苷酸探針和鏈侵入寡核苷酸的特定組合。因此，本發(fā)明提供了在至少一種單鏈DNA結(jié)合蛋白的存在下檢測樣品中產(chǎn)毒艱難梭茵的靶核酸序列的方法，包括在促進所述靶核酸序列擴增的條件下，使所述樣品與上述SEQ ID NO：24或25或其任一種的變體的寡核苷酸探針、上述SEQ ID NO：21或其變體的上游引物、上述SEQ ID NO：22或其變體的下游引物，以及上述SEQ ID NO：23或其經(jīng)修飾的衍生物或變體的鏈侵入寡核苷酸接觸。所述方法可包括檢測SEQ ID NO：26的靶核酸序列。

本發(fā)明還提供了在至少一種單鏈DNA結(jié)合蛋白的存在下檢測樣品中鼠傷寒沙門氏菌的靶核酸序列的方法，包括在促進所述靶核酸序列擴增的條件下，使所述樣品與上述SEQ ID NO：30或其變體的寡核苷酸探針、上述SEQ ID NO：27或其變體的上游引物、上述SEQ ID NO：28或其變體的下游引物，以及上述SEQ ID NO：29或其經(jīng)修飾的衍生物或變體的至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸。所述方法可包括檢測SEQ ID NO：31的靶核酸序列。

本發(fā)明還提供了在至少一種單鏈DNA結(jié)合蛋白的存在下檢測樣品中SEQ ID NO：20的靶核酸序列的方法，包括在促進所述靶核酸序列擴增的條件下，使所述樣品與上述SEQ ID NO：13或14或其變體的寡核苷酸探針、SEQ ID NO：11或其變體的上游引物、SEQ ID NO：12或其變體的下游引物，以及SEQ ID NO：15或其經(jīng)修飾的衍生物或變體的至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸?？筛鶕?jù)上述用于SEQ ID NO 21、22、27和28的變體的相同標準，選擇SEQ ID NO 11和12的變體?？筛鶕?jù)上述用于SEQ ID NO 23和29的變體的相同標準，選擇SEQ ID NO 15的變體和經(jīng)修飾的衍生物。

本發(fā)明也提供了在至少一種單鏈DNA結(jié)合蛋白的存在下檢測樣品中SEQ ID No：34的靶核酸序列的方法，包括使所述樣品與SEQ ID NO 3至10或其變體中任一種的寡核苷酸探針接觸。

本發(fā)明的產(chǎn)品

核酸

本發(fā)明還提供了作為產(chǎn)品本身的寡核苷酸探針，其包含熒光團、猝滅劑和與靶核酸序列互補的區(qū)域。所述寡核苷酸探針的序列包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸探針產(chǎn)品可以是用于本發(fā)明方法的上述任何寡核苷酸探針。本發(fā)明也具體提供了上述SEQ ID NO：3至10、13、14、24、25或30或其任一種的變體的寡核苷酸探針。

組合物

本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的寡核苷酸探針的組合物和制劑。所述組合物可以是，例如，溶液、凍干物、懸浮液或在油性或水性載體中的乳液。所述組合物還可包含一種或多種選自上游引物、下游引物和鏈侵入寡核苷酸的寡核苷酸組分。所述組合物還可包含一種或多種選自DNA聚合酶、能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白、重組酶和重組酶輔助蛋白的蛋白。所述組合物優(yōu)選包含寡核苷酸探針以及(i)包含與靶核酸序列互補的區(qū)域的鏈侵入寡核苷酸和/或(ii)至少一種能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白。分別設(shè)計所述組合物的探針、引物和鏈侵入寡核苷酸組分，用于檢測靶核酸序列。

所述組合物可包含SEQ ID NO：24或25或其變體的寡核苷酸探針，以及(i)SEQ ID NO：21或其變體的上游引物，(ii)SEQ ID NO：22或其變體的下游引物和/或(iii)SEQ ID NO：23或其變體的鏈侵入寡核苷酸。另外地或可選地，所述組合物可包含SEQ ID NO：30或其變體的寡核苷酸探針，以及(i)SEQ ID NO：27或其變體的上游引物，(ii)SEQ ID NO：28或其變體的下游引物和/或(iii)SEQ ID NO：29或其變體的鏈侵入寡核苷酸。另外地或可選地，所述組合物可包含SEQ ID NO 17至19和32或其變體中任一種的寡核苷酸探針，以及(i)SEQ ID NO：11或其變體的上游引物，(ii)SEQ ID NO：12或其變體的下游引物和/或(iii)SEQ ID NO：15或其變體的鏈侵入寡核苷酸。

試劑盒

本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的至少一種寡核苷酸探針的試劑盒。所述試劑盒任選地還包括用于本發(fā)明的方法的使用說明。所述試劑盒可包括檢測所擴增的DNA的工具。所述試劑盒可包括上游引物和/或下游引物。所述試劑盒可包括鏈侵入寡核苷酸?？稍谒鲈噭┖兄幸曰旌衔锏男问交蛟诜珠_的容器中提供以上各寡核苷酸。

所述試劑盒或組合物任選地包括DNA聚合酶、重組酶和重組酶輔助蛋白中的一種或多種。優(yōu)選地，所述DNA聚合酶是Bsu聚合酶。優(yōu)選地，所述重組酶是細茵噬茵體T4UvsX，其任選地與重組酶輔助蛋白UvsY和gp32組合。所述試劑盒或組合物可還包括dNTP、適合的緩沖液和上述本發(fā)明方法中的DNA擴增所需的其他要素。

所述試劑盒可包括與本發(fā)明的方法和組合物有關(guān)的上述寡核苷酸探針、上游引物、下游引物和/或鏈侵入寡核苷酸的任何組合。

用于檢測靶核酸序列的應用

本發(fā)明的方法可用于需要檢測靶核酸序列的任何應用。

診斷方法

本發(fā)明在醫(yī)學環(huán)境下是特別有利的。本發(fā)明的檢測方法提供高度特異性的檢測以允許確定臨床樣品是否包含靶核酸序列。所述方法可應用于一系列疾病環(huán)境中。本發(fā)明提供了在受試者中診斷疾病的方法，包括在來自所述受試者的樣品中實施本發(fā)明的檢測靶核酸序列的方法以檢測與所述疾病相關(guān)的靶核酸序列。

所述方法可用于在受試者中診斷病原體感染，包括檢測來自所述病原體的靶核酸序列。可以在患者中存在或疑似存在任何疾病或病痛的背景下確定是否存在病原體。所述疾病可包括由病原體存在引起的、與其存在相關(guān)或因其存在而惡化的那些疾病。因此，患者可表現(xiàn)出指示病原體存在的癥狀，并且可從所述患者中獲得樣品以通過上述方法確定病原體的存在。

可檢測任何病原體。所述病原體可以是病毒或細菌或寄生蟲。所述病原體例如，但不限于，真菌；病毒，包括人乳頭瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(A型、B型和C型)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、諾沃克病毒類、腸病毒、星狀病毒、麻疹病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、腺病毒、風疹病毒、人T細胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、馬爾堡病毒和埃博拉病毒；細菌，包括結(jié)核分枝桿茵(Mycobacterium tuberculosis)、衣原體屬(Chlamydia)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、志賀茵屬(Shigella)、沙門氏茵屬(Salmonella)、霍亂弧茵(Vibrio cholerae)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、假單胞茵屬(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布魯桿菌屬(Brucella)、土拉弗氏茵(Franciscella tularensis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、腎臟鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、嗜肺軍團病桿菌(Legionellapneumophila)、鼠疫耶爾森氏茵(Yersinia pestis)、鏈球菌屬(Streptococcus)(A型和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、腦膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)(b型)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、彎曲茵(Campylobacteriosis)、粘膜炎莫拉茵(Moraxella catarrhalis)、腹股溝肉芽腫(Donovanosis)和放線茵(Actinomycosis)；真菌病原體，包括念珠茵病(Candidiasis)和曲霉菌病(Aspergillosis)；寄生病原體，包括絳蟲屬(Taenia)、吸蟲(Flukes)、蛔蟲(Roundworms)、阿米巴病(Amoebiasis)、賈第蟲病(Giardiasis)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、血吸蟲屬(Schistosoma)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、滴蟲病(Trichomoniasis)和旋毛蟲病(Trichinosis)。

特定的目的病原體包括產(chǎn)毒艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏茵，適于診斷這些病原體感染的方法和寡核苷酸的組合在上文中描述。

本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案是鑒定具有胃腸道感染(特別是具有腹瀉癥狀)的患者中存在的產(chǎn)毒艱難梭茵。

因此，本發(fā)明提供了胃腸道疾病(例如，由產(chǎn)毒艱難梭茵和鼠傷寒沙門氏菌引起的腹瀉)的診斷方法。所述診斷方法還可包括檢測抗生素抗性標記物和毒力標記物。所述方法顯著改善了患者的胃腸道疾病管理，因為它允許對給定患者進行最佳治療學治療。因此，所述測試將縮短住院時長、降低再入院的頻率并降低費用。

基于獲自患者樣品的核酸可便利地進行所述診斷方法，為臨床醫(yī)生提供關(guān)于胃腸道疾病是否可歸因于產(chǎn)毒艱難梭茵或鼠傷寒沙門氏茵感染的指示。例如，所述診斷方法可提供關(guān)于艱難梭茵的毒素型和毒力以及艱難梭茵是否對任何抗生素具有抗性的指示。然后根據(jù)所述測試的結(jié)果可優(yōu)化醫(yī)學治療，例如通過使用抗生素。

鼠傷寒沙門氏茵的檢測

在更廣泛的方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品的鼠傷寒沙門氏茵的方法，所述方法包括在促進擴增包含SEQ ID NO：31的靶核酸序列的條件下，使所述樣品與至少一種上游引物、至少一種下游引物和至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸，其中各所述引物和所述鏈侵入寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補的區(qū)域；并且其中所述鏈侵入寡核苷酸使所述靶核酸序列的至少一部分成為單鏈以允許結(jié)合所述上游引物和下游引物。

優(yōu)選地，所述方法還包括使所述樣品與至少一種寡核苷酸探針接觸，所述寡核苷酸探針包含熒光團、猝滅劑和與所述靶核酸序列互補的區(qū)域。通常，所述寡核苷酸探針包含至少20％的RNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸，因此是上述本發(fā)明的寡核苷酸探針。通常，在至少一種能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白的存在下實施所述檢測鼠傷寒沙門氏茵的方法。通常，所述能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白是重組酶。

優(yōu)選地，所述上游引物包含SEQ ID NO：27或其變體的序列，所述下游引物包含SEQ ID NO：28或其變體的序列，所述鏈侵入寡核苷酸包含SEQ ID NO：29或其變體的序列。

以下實施例舉例說明本發(fā)明。

實施例

實施例1——不同的寡核苷酸對單鏈DNA結(jié)合蛋白的親和力

研究了能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白對包含熒光團和猝滅劑的單鏈寡核苷酸探針產(chǎn)生的信號的影響。所述寡核苷酸探針由天然DNA或RNA或經(jīng)修飾的核酸(例如，2’-氟RNA、2’-O-甲基RNA)、PNA或LNA組成。與其他探針(長度為16-21個堿基)相比，LNA和PNA探針的長度分別為12和14個堿基。使用更短的LNA和PNA探針，這是由于它們的熔解溫度更高。親和測定中寡核苷酸探針的濃度為100nM，PNA除外，其為800nM。

在包含20mM Tris-乙酸鹽pH 8.0、10mM乙酸鎂、2mM ATP、60mM Tris-磷酸肌酸和0.025U/μl肌酸激酶的緩沖液中，在存在或不存在200nM互補模板(對于具有SEQ ID NO 1-8的探針，為SEQ IDNO：34；或者對于具有SEQ ID NO 9或10的探針，為SEQ ID NO：44)和5μM UvsX的情況下，孵育寡核苷酸探針。在40℃孵育20分鐘后，測量熒光。

與不存在互補模板的情況下產(chǎn)生的信號相比，所有的寡核苷酸探針與其互補模板的孵育導致熒光信號增加(圖1a)。然而，在不存在互補模板的情況下，細菌噬茵體T4UvsX的存在也導致天然DNA寡核苷酸探針(SEQ ID NO：1和2)的熒光信號顯著增加，如圖1a所示。對這一觀察的可能的解釋是，UvsX使DNA探針的二級構(gòu)象不穩(wěn)定，導致探針和猝滅劑之間的距離增大，即使在不存在互補模板的情況下探針信號也增加。當在包含UvsX的反應中監(jiān)測DNA擴增時，預期這種探針的非特異性激活將導致差的信號背景比。

相比之下，在UvsX存在下，具有相同序列但是由RNA(SEQ IDNO：3和4)或經(jīng)修飾的RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)或LNA(SEQID NO：9)或PNA(SEQ ID NO：10)組成的寡核苷酸探針仍然被猝滅，僅在互補模板存在的情況下信號顯著增加。

也說明了單鏈DNA結(jié)合蛋白——細菌噬茵體T4gp32(新英格蘭Biolabs)對與UvsX一起使用的相同寡核苷酸探針的信號的影響。在包含20mM Tris-乙酸鹽pH 7.9、50mM乙酸鉀、10mM乙酸鎂和1mM DTT的緩沖液中，在存在或不存在0.25mg/ml gp32和200nM互補模板(對于具有SEQ ID NO 1-8的探針，為SEQ ID NO：34；或者對于具有SEQ ID NO 9或10的探針，為SEQ ID NO：44)的情況下孵育寡核苷酸探針，其濃度與和UvsX一起使用的那些寡核苷酸探針的濃度相似。

在不存在互補模板的情況下，gp32的存在再次導致DNA探針(SEQ ID NO：1和2)的信號顯著增加，如圖1b所示。當存在gp32時，在存在或不存在互補模板的情況下DNA探針產(chǎn)生的信號之間也沒有顯著差異。因此，在包含T4gp32的反應中，雙標記的天然DNA探針不適合用于靶標檢測。

相比之下，在存在T4gp32的情況下，RNA(SEQ ID NO：3和4)或經(jīng)修飾的RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)、LNA(SEQ ID NO：9)和PNA(SEQ ID NO：10)探針表現(xiàn)出熒光的少許增加或無顯著增加。

采用在利用單鏈結(jié)合蛋白和重組酶二者用于擴增的等溫的基于鏈侵入的擴增方法中所使用的試劑條件來測試寡核苷酸探針。反應中的試劑組分為10mM Tris-乙酸鹽pH 8.0、10mM乙酸鎂、5％DMSO、5％PEG 1000、4mM DTT、0.5mM EDTA、0.1mg/ml BSA、150mM蔗糖、2mM ATP、200μM DNTP’s、1∶100000SYBR Green I、60mMTris-磷酸肌酸。反應中的蛋白為250ng/μl gp32、5μM UvsX、0.0625U/μl BSU、0.0125U/μl蔗糖磷酸化酶和0.025U/μl肌酸激酶(Sigma-Aldrich St.Louis，MO，U.S.A)。引物和鏈侵入寡核苷酸的濃度為200nM。除非另有說明，所使用的探針的濃度為200nM。

配制所有反應物，而不含有靶DNA或乙酸鎂。然后，通過添加適量的在乙酸鎂中配制的靶DNA或僅使用乙酸鎂來開始反應。在40℃下在96孔板中實時檢測反應中產(chǎn)生的熒光信號。

在以上試劑組合物(沒有引物和鏈侵入寡核苷酸)與DNA探針(SEQ ID NO 1和2)一起孵育時，在存在或不存在互補模板的情況下產(chǎn)生的信號沒有差異(圖1c)。因此，不希望將包含天然DNA的探針用于使用單鏈結(jié)合蛋白和/或重組酶的DNA擴增反應。相比之下，顯示RNA(SEQ ID NO：3和4)或經(jīng)修飾的RNA(SEQ ID NO：5、6、7、8)、LNA(SEQ ID NO：9)和PNA(SEQ ID NO：10)探針僅在存在互補模板時產(chǎn)生信號增加。因此，RNA、經(jīng)修飾的RNA、LNA和PNA探針適合于使用單鏈結(jié)合蛋白和/或重組酶的DNA擴增反應。

也說明了大腸桿菌重組酶RecA(新英格蘭Biolabs)對來自寡核苷酸探針的信號的影響(圖1d)。在含有70mM Tris-HCl pH 7.6、10mM MgCl₂、5mM DTT和10mM ATP的緩沖液中，在存在或不存在100μg/ml RecA的情況下孵育寡核苷酸探針，其濃度與圖1a和圖1b中所使用的探針的濃度類似。RecA的存在也導致包含天然DNA的探針的信號增加(圖1d，DNA21[SEQ ID NO：2])。但是，所述增加并沒有像采用T4UvsX所觀察到的增加那樣高。然而，如采用T4UvsX所觀察到的，采用包含RNA(RNA21SEQ ID NO：4)、2’-氟RNA(2-氟RNA21，SEQ ID NO：8)、2’-O-甲基RNA(2-O-甲基RNA21，SEQID NO：6)、LNA(SEQ ID NO：9)或PNA(SEQ ID NO：10)的探針孵育RecA并不導致信號的任何顯著增加。

此外，說明了極高熱穩(wěn)定性單鏈DNA結(jié)合蛋白——ET-SSB(新英格蘭Biolabs)對這些寡核苷酸探針的影響(圖1e)。與如果在50℃以上的溫度下使用則喪失活性的T4-gp32不同，ET-SSB在95℃仍保持其活性。因此，如果在高溫下進行的反應(例如聚合酶鏈式反應(PCR)或DNA測序)中需要單鏈結(jié)合蛋白，則ET-SSB是適合的選擇。在含有20mM Tris-乙酸鹽pH 7.9、50mM乙酸鉀、10mM乙酸鎂和1mM DTT的緩沖液中，在存在或不存在50μg/ml ET-SSB的情況下孵育寡核苷酸探針，其濃度與圖1a和圖1b中所使用的探針的濃度類似。ET-SSB的存在也導致包含天然DNA的探針的信號顯著增加(圖1e，DNA21SEQ ID NO：2)。因此，僅包含天然DNA的雙標記探針不適于包含ET-SSB的反應。相比之下，包含RNA(RNA21，SEQ ID NO：4)、2’-氟RNA(2-氟RNA21，SEQ ID NO：8)、2’-O-甲基RNA(2-O-甲基RNA21，SEQ ID NO：6)、LNA(SEQ ID NO：9)或PNA(SEQ ID NO：10)的探針對ET-SSB更具抗性。因此，這些經(jīng)修飾的探針更適于在單鏈結(jié)合蛋白如ET-SSB的存在下進行的反應。

實施例2——使用不同的寡核苷酸探針檢測基于鏈侵入的擴增(SIBA^TM)

測試了由天然DNA(SEQ ID NO：16)、2’-氟DNA(SEQ ID NO：17)和LNA(SEQ ID NO：18)組成三種探針，它們均標記有熒光團和猝滅劑。圖2a中概述了正向引物(SEQ ID NO：11)、反向引物(SEQ ID NO：12)、探針、鏈侵入寡核苷酸(SEQ ID NO：15)和靶核酸序列(SEQ ID NO：20)的構(gòu)象。設(shè)計所述探針以與所述反向引物(SEQ ID NO：12)的下游區(qū)域部分重疊，因此所述探針與所述反向引物結(jié)合于靶模板上的相同區(qū)域。

在如實施例1中所述，在基于鏈侵入的擴增反應中，使用探針、引物和鏈侵入寡核苷酸實時擴增并檢測了人工靶DNA(SEQ ID NO：20)。只有在含有靶DNA的反應中獲得靶DNA的擴增，而無模板對照(NTC)不產(chǎn)生擴增，如在使用SYBR Green I染料檢測的反應中所顯示的(圖2b)。也觀察到對依賴于模板的擴增的特異性檢測，其中分別使用SEQ ID NO 17和18的2’-氟RNA或LNA探針(圖2c和2d)。由于反向引物和探針之間的競爭，在采用含有2’-氟RNA或LNA的探針檢測的樣品中觀察到擴增開始的稍許延遲。通過降低探針的濃度可進一步使這種競爭最小化。

相比之下，DNA探針(SEQ ID NO：16)不能在靶模板的存在下檢測任何擴增(圖2e)。這是由于反應中存在的單鏈結(jié)合蛋白即使在不存在復制子的情況下也導致探針信號的顯著增加。因此，發(fā)現(xiàn)DNA探針不適合用于在其試劑方案中包含DNA結(jié)合蛋白的方法。

實施例3——使用RNA寡核苷酸探針對SIBA的多重檢測

在實施例1中所述的鏈侵入擴增反應條件下，同時納入標記有Cy5和Iowa black的2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：25)或標記有ROX和BHQ2的2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：17)。平行檢測艱難梭茵靶序列(SEQ ID NO：26)和人工靶序列(SEQ ID NO：20)的擴增。

用于擴增艱難梭茵基因的所述靶序列的正向引物、反向引物和鏈侵入寡核苷酸分別為SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。用于擴增所述人工靶標的正向引物、反向引物和鏈侵入寡核苷酸分別為SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15。分別使用10,000和10⁷個拷貝的艱難梭茵基因組DNA和人工靶DNA來進行反應。圖3a示出通過使用包含2’-氟RNA堿基的探針同時實現(xiàn)對DNA靶標的擴增的實時監(jiān)測。使用標記有Cy5和Iowa black的2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：25)檢測來自艱難梭茵的靶序列，同時使用標記有ROX和BHQ2的2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：17)檢測所述人工靶序列。使用SYBR Green I(圖3b)或2’-氟RNA探針(圖3c)的熔解分析進一步確認，兩個反應都是特異性的并且在相同的反應管中發(fā)生。2’-氟RNA探針也可代替SYBR Green充當熔解分析的工具，因為所述探針在反應中不水解。

實施例4——用于增強信號產(chǎn)生的RNA探針的RNase H切割

在實施例1中所述的鏈侵入DNA擴增反應條件下，在存在或不存在其互補靶模板的情況下將天然DNA、經(jīng)修飾的RNA、LNA和PNA探針用或不用10μg/ml Thermococcus gammatolerans RNase H2孵育。如之前實驗所顯示的，所有的探針(除了包含天然DNA的那些)在其靶序列存在時產(chǎn)生信號的增加(圖4a)。但是，在RNase H2存在的反應條件中，檢測到2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：17)的信號的進一步增加，這是由來自RNA探針和靶DNA的雙鏈體上的RNA堿基的切割造成的。其他探針DNA(SEQ ID NO：16)、PNA(SEQ ID NO：10)、LNA(SEQ ID NO：9)和2’-O-甲基RNA(SEQ ID NO：32)不被RNase H2切割。

在以上反應條件下，在存在或不存在RNase H2的情況下也使用SEQ ID NO：24的2’-氟RNA探針檢測艱難梭茵的靶序列的擴增。圖4b示出了RNase H2對于從探針產(chǎn)生信號而言不是必需的。但是，RNase H2的存在進一步增強信號。

實施例5——通過基于鏈侵入的擴增和RNA寡核苷酸探針檢測鼠傷寒沙門氏菌

使用2’-氟RNA探針(SEQ ID NO：30)檢測低拷貝的靶DNA。在檢測鼠傷寒沙門氏茵靶基因的試驗中，在實施例1中所述的基于鏈侵入的擴增反應條件下納入2’-氟RNA探針。用于擴增的正向引物、反向引物和鏈侵入寡核苷酸分別為SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。

通過使用系列稀釋的10⁵到10個拷貝的鼠傷寒沙門氏茵基因組DNA來評估所述測試的靈敏度。所述探針能夠檢測最小為10個拷貝的基因組DNA樣品(圖5)。無模板對照(NTC)未產(chǎn)生任何可檢測的信號，證實了2’-氟RNA探針是高度特異性的。

實施例6——具有連接于3’端的猝滅劑的RNA寡核苷酸探針不作為聚合酶延伸的底物

設(shè)計上述RNA探針以與反向引物的下游區(qū)域重疊，所述探針因此可與反向引物競爭結(jié)合靶序列。使用實施例2中所述的人工系統(tǒng)來研究SEQ ID NO：17的探針是否能夠作為引發(fā)DNA擴增的底物。圖6a示出了所述探針由于存在連接于3’端的猝滅劑而不作為引物。靶序列的擴增僅在互補的反向引物(SEQ ID NO：12)的存在下發(fā)生。當單獨使用所述探針而無同源的反向引物，或與非同源反向引物或假反向引物SPU R-引物(SEQ ID NO：33)一起使用所述探針時，未發(fā)生擴增。此外，在無反向引物的樣品中，在存在RNase H2的情況下，未觀察到擴增(圖6b)。這表明所述探針在擴增過程中是惰性的并且僅參與靶擴增子的結(jié)合。

實施例7——具有雙引物/探針功能的RNA寡核苷酸

使用實施例2中所述的人工系統(tǒng)研究了包含2’-氟RNA的寡核苷酸是否能夠同時充當探針和引物(圖7a)。SEQ ID NO：12的反向引物中的部分或全部天然DNA核苷酸被2’-氟RNA替換以產(chǎn)生SEQ ID NO：13和14的寡核苷酸。這些2’-氟RNA引物能夠擴增人工靶DNA，其擴增效率與天然DNA反向引物一樣好(圖7b)。所述在3’端保留一些天然DNA堿基的2’-氟RNA引物(SEQ ID NO：14)的效率稍微更高一些。

然后，推斷熒光團和猝滅劑可被添加到2’-氟RNA引物中以提供探針功能，只要3’端是游離的用于延伸靶序列。進一步假定這樣的構(gòu)象仍然對DNA結(jié)合蛋白對探針信號的干擾具有抗性，因此仍允許對擴增的特異性檢測。用內(nèi)部熒光團和5’猝滅劑(SEQ ID NO 19)標記所述2’-氟RNA引物。圖7c示出了在基于鏈侵入的擴增反應中SEQ ID NO：19能夠擴增并檢測人工靶DNA(SEQ ID NO：20)。

實施例8——嵌合的DNA-RNA雙標記探針對DNA結(jié)合蛋白的親和力

研究了通過修飾天然DNA探針的序列以部分地摻入RNA或經(jīng)修飾的RNA堿基而提供對DNA結(jié)合蛋白的抗性的能力。雙標記探針、UvsX和T4-gp32的濃度與實施例1中所使用的那些相同。

圖8示出了包含DNA和RNA(SEQ ID NO：35、36、37)堿基，或DNA和2’-氟RNA(SEQ ID NO：38、39、40)堿基，或DNA和2’-O-甲基RNA(SEQ ID NO：41、42、43)堿基的混合物的雙標記探針也表現(xiàn)出對DNA結(jié)合蛋白UvsX和T4-gp32的抗性。由于添加UvsX或T4-gp32，結(jié)果顯示為熒光增加的倍數(shù)?？剐缘某潭戎饕Q于存在于所述雙標記探針中的RNA堿基的量。雙標記探針對DNA結(jié)合蛋白的抗性隨著探針中存在的RNA堿基的量的增加而增加。

用含有不同比例的DNA-RNA、DNA-2’-氟RNA和2’-O-甲基RNA的21堿基雙標記探針孵育UvsX(圖8a)。在所有的情況下，含有5個RNA或2’-氟RNA或2’-O-甲基RNA堿基和15個DNA堿基的21堿基雙標記探針比僅含有DNA堿基的20堿基雙標記探針對UvsX的抗性更強。采用T4-細茵噬茵體gp32(單鏈結(jié)合蛋白)進行了類似的實驗(圖8b)。同樣，對DNA結(jié)合蛋白的抗性主要取決于雙標記探針中存在的RNA堿基的量。含有5個RNA或2’-氟RNA或2’-O-甲基RNA堿基和15個DNA堿基的21堿基雙標記探針足以表現(xiàn)出對T4-gp32的抗性。因此，嵌合的DNA-RNA或DNA-2’-氟-RNA或DNA-2’-O-甲基RNA雙標記探針也適合用于包含DNA結(jié)合蛋白的反應。

進一步研究了嵌合探針中所包含的RNA堿基的數(shù)目與能夠結(jié)合單鏈DNA的蛋白對探針信號的破壞的抗性之間的關(guān)系。圖8c示出了采用包含不同比例的DNA-RNA的其他一系列21堿基雙標記探針孵育UvsX的結(jié)果。圖8d示出了采用相同系列的探針以及采用gp32孵育的結(jié)果。如實施例1中的描述進行測定。發(fā)現(xiàn)在DNA探針中至少約20％的堿基被RNA堿基取代(參見，例如，探針DNA 17+RNA 4)的情況下觀察到對探針信號干擾的一致減少。