一種鑒別白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別食用菌真?zhèn)渭夹g(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鑒別白 玉茹的特征性核巧酸序列、核酸分子引物、試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 白玉茹（whiteHypsizigusmarmoreus)又名白色斑玉葦、白色真姬茹、白色蟹味 茹，在日本則稱之為御茹或者稱為御茸，是斑玉葦（真姬茹）（Hypsizygusmarmoreus)的白 色品系。白玉茹的茹體潔白如玉，質(zhì)地細膩，口感特佳，其多糖、總黃酬、SOD等活性成分含量 均高于真姬茹，倍受國內(nèi)外市場青睞，是食用菌中的"金枝玉葉"和上乘山珍佳品。因此，白 玉茹產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，日產(chǎn)量已達到鮮茹200噸W上，成為我國工廠化生產(chǎn)的主要品種之一。 因此，建立快速鑒別白玉茹的方法非常重要。
[0003] 目前，對白玉茹的鑒別需要將白玉茹菌種接種于培養(yǎng)基中形成菌絲體并培育成 子實體后，再利用子實體的形態(tài)特征進行鑒別，即目前白玉茹和真姬茹在菌絲體階段時無 法從根據(jù)形態(tài)特征進行區(qū)分，它們的不同之處是白玉茹子實體通體白色而真姬茹則呈深褐 色。顯然，利用形態(tài)特征鑒別的方法從菌絲體到子實體所需時間至少需要85天，鑒別時間 相當(dāng)長?，F(xiàn)有的研究主要集中于：利用不同菌株的括抗性及部分同工酶、ITSrDNA、RAPD、 SRAP和mtDNA技術(shù)對真姬茹和白玉茹的種內(nèi)聚類分析和鑒定研究。然而括抗性和同工酶 技術(shù)操作復(fù)雜耗時長，白玉茹與真姬茹的口SrDNA序列一致，難于通過ITS序列鑒定，而 RFLP、RAPD、SRAP等因不能很好地與目標性狀連鎖而應(yīng)用受到限制，mtDNA則存在遺傳穩(wěn)定 性的問題，因此，白玉茹的快速鑒別難于實現(xiàn)（張永杰，2015 ;牛臉東，2001)。W目標起始密 碼子多態(tài)性（startcodontargetedpolymo巧hism，SCoT)分子標記是一種基于翻譯起始 位點的目的基因分子標記新技術(shù)，依據(jù)基因中ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計 單引物并對基因組進行擴增。具有重復(fù)性好，引物設(shè)計簡單，可W在物種間通用的特點，能 有效產(chǎn)生和性狀連鎖的標記，可用于分子標記輔助育種、遺傳多樣性分析、Q化定位和集群 分離分析等諸多領(lǐng)域研究（CollardBCΥ，2009)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種利用分子生物學(xué)手段，從遺傳本質(zhì)上鑒別白玉 茹，尤其是提供針對白玉茹菌絲體及其他白玉茹相關(guān)制品真假的鑒別白玉茹的特征性核巧 酸序列。
[0005] 本發(fā)明用于鑒別白玉茹的特征性核巧酸序列來源于目標起始密碼子多態(tài)性 (SCoT)分子標記中的31號引物（即序列為5' -CCATGGCTACCACCGCCT-3'的非特異性引物）， 擴增白玉茹的基因組DNA，得到的立條基因片段，再經(jīng)克隆、測序，并篩選特異性分子片段的 序列。所述的鑒別白玉茹的特征性核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。 陽006] 本發(fā)明的第二個目的是提供W白玉茹的特征性核巧酸序列（SEQIDNO. 1)為基礎(chǔ) 的，設(shè)計用于鑒別白玉茹的核酸分子引物，該核酸分子引物序列如下：
[0007]FCHS:5'-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3'；
[0008] RCHS:5 --GGAGCACCGAGGGTTAGT-3 -。
[0009] 上述核酸分子引物序列FC服和RC服，它們的退火溫度相近（53°C~54°C)，GC含 量相當(dāng)（55%~62%)，均不能形成引物二聚體，具有極高的專一性，僅能與白玉茹發(fā)生反 應(yīng)，而不與真姬茹或其他食用菌擴增生成PCR條帶。因此，利用該核酸分子引物通過PCR擴 增可W快速的對白玉茹（菌絲體、子實體）進行鑒別。
[0010] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供一種白玉茹快速鑒定試劑盒，包括上述的白玉茹的核 酸分子引物FC服、RC服和PCR反應(yīng)試劑。
[0011] 所述的白玉茹快速鑒定試劑盒優(yōu)選還包括真姬茹子實體DNA或真姬茹菌絲體 DNA，該DNA可W作為鑒定白玉茹的陰性對照，W及白玉茹菌絲體DNA或白玉茹子實體DNA， 該DNA可W作為鑒定白玉茹的陽性對照。
[0012] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒別白玉茹的方法，其特征在于，采用上述核酸 分子引物FC服和RC服作為擴增引物，W待測樣品基因組DNA為模板，利用PCR的方法鑒定 待測樣品是否是白玉茹。具體是經(jīng)PCR擴增，電泳檢測，可W直接獲得清晰的白玉茹特異 性條帶，無需測序步驟，實現(xiàn)對白玉茹菌絲體無需培養(yǎng)成子實體，直接鑒別其品種的快速鑒 別。
[0013] 優(yōu)選，利用真姬茹菌絲體DNA或真姬茹子實體DNA作為PCR模板，W白玉茹的核酸 分子引物FC服和RC服作為PCR引物，進行常規(guī)的PCR，W作為陰性對照（如圖3)。
[0014] 本發(fā)明基于SCoT分子標記中第31號引物擴增白玉茹基因組DNA，經(jīng)克隆測序，獲 得白玉茹的特征性核巧酸序列，該特征性核巧酸序列如SEQIDNO. 1，并根據(jù)該序列設(shè)計特 異性的核酸分子引物FC服和RC服。用該核酸分子引物，W白玉茹基因組DNA為模板，按照 常規(guī)PCR方法進行擴增，獲得的DNA片段，經(jīng)測序其具體序列為序列SEQIDNO. 1中第27~ 476位堿基所示，長度為45化P(如圖1)。利用本發(fā)明的核酸分子引物FC服和RC服進行PCR 擴增，僅有白玉茹能夠擴增獲得該特異性片段，而其他樣品沒有擴增到任何片段（如圖3)， 而利用真姬茹DNA作為PCR模板，W白玉茹的核酸分子引物FC服和RC服作為PCR引物，進 行常規(guī)的PCR，作為陰性對照（如圖3)。本發(fā)明的核酸分子引物FC服和RC服具有極高的 專一性，可W用于快速的鑒別白玉茹（菌絲體和子實體）及其相關(guān)制品的真?zhèn)巍?br>[0015] 本發(fā)明采用PCR技術(shù)進行檢測，材料用量少，僅20mg就足夠，方法簡單，特異性好， 用時短，3h內(nèi)即可完成。
【附圖說明】：
[0016] 圖1是本發(fā)明所述的鑒別白玉茹的特征性核巧酸序列，左側(cè)為5'端，右側(cè)為3' 端，其中黑色部分為核酸分子引物FC服和RC服擴增的片段大小及位置。 陽017] 圖2是利用SCoT分子標記中第31號引物作為PCR引物按照常規(guī)的PCR方法對不 同樣品進行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中1、白玉茹菌絲體DNA，2、白玉茹子實體DNA，3、真姬 茹菌絲體DNA，4、真姬茹子實體DNA，Μ為2肺的DNA分子量標準，從上到下分別是2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0018] 圖3是利用白玉茹的核酸分子引物FC服和RC服作為PCR引物按照常規(guī)的PCR方 法對不同樣品進行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中1、白玉茹菌