團(tuán)頭魴低氧性狀相關(guān)snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于魚(yú)類(lèi)分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體設(shè)及團(tuán)頭妨低氧相關(guān)基因fih-1的SNP 分子標(biāo)記及應(yīng)用，所述的分子標(biāo)記可應(yīng)用于團(tuán)頭妨育種基因型的輔助選擇。
【背景技術(shù)】
[0002] 團(tuán)頭妨（Megalobrama amblyce地ala),俗稱(chēng)武昌魚(yú)、編魚(yú)，隸屬于經(jīng)形目，經(jīng)科， 妨屬，是我國(guó)重要的草食性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。但與草魚(yú)、經(jīng)、娜等典型的經(jīng)科魚(yú)類(lèi)相比，團(tuán)頭 妨是不耐低氧的種類(lèi)，容易發(fā)生缺氧浮頭，制約了其養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高。而同一群體的不同個(gè) 體對(duì)低氧環(huán)境的耐受能力不同。因此團(tuán)頭妨耐低氧新品系的培育對(duì)于團(tuán)頭妨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展 具有重要意義。
[0003] 低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-in化ciblefactor,HI巧在動(dòng)物耐受低氧的生理應(yīng)答中 起關(guān)鍵作用，其活性主要由α亞基決定。因此，可W在分子水平上探究不同個(gè)體對(duì)低氧環(huán) 境的耐受能力的差異。HIF-1是在研究缺氧誘導(dǎo)的促紅細(xì)胞生成素（&ryt虹opoietin，EP0) 基因表達(dá)時(shí)被發(fā)現(xiàn)的（SemenzaandWang1992)，研究顯示缺氧可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HIF的活性 增強(qiáng)。HIF能夠激活下游一系列氧敏感基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)調(diào)控諸如能量代謝、血管生成W及 細(xì)胞增殖和調(diào)亡等生理過(guò)程，從而維持機(jī)體在缺氧狀態(tài)下的存活。目前已在多種魚(yú)類(lèi)中 都發(fā)現(xiàn)了HIF-la、HIF-2a和HIF-3QΞ種α亞基，其在低氧應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮不同的功 能（Shenet曰1 2010)。HIF-1通過(guò)與其勒1基因上的低氧反應(yīng)元件化ypoxiaresponsive element,HR巧結(jié)合，引發(fā)下游祀基因諸如EPO、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（in化cible nitricoxidesynthase,iNOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)等基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響紅細(xì)胞生成、血管發(fā)生、細(xì)胞調(diào)亡和增殖等生理、病 理過(guò)程，并使機(jī)體產(chǎn)生一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)（陸蘊(yùn)松等2009)。
[0004] HIF-1 抑制因子（factorinhibitingHIF-1，F(xiàn)IH-1)是一個(gè)重要的HIF-1 上游調(diào) 控基因。在常氧條件下它能夠?qū)IF-la中天冬酷胺的氨基徑基化，從而阻礙了HIF-1基 因C端的反式結(jié)構(gòu)域TAD-C與轉(zhuǎn)錄輔因子CBP/P300的結(jié)合，抑制HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性度ell etal2005)。相反，在低氧條件下，天冬酷胺徑化酶活性受到抑制，從而增加了CBP/P300 的結(jié)合作用，促進(jìn)祀基因的表達(dá)（化ee血anetal2002)。因此，F(xiàn)IH-1在低氧調(diào)節(jié)中具有 極其重要的作用。
[0005] 單核巧酸多態(tài)（singlenuclearpolymo巧hisms,SNPs)主要是指在基因組水平上 由于單個(gè)核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，即同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密 碼單個(gè)堿基的變化。常表現(xiàn)為單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失（唐立群等2012)。根據(jù)它 們?cè)诨蚪M分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs(cSNPs)、基因間SNPs(iSNPs)和基因周邊 SNPs(pSNPs)Ξ類(lèi)（Wanget曰1 1998)。Sun等（2007)通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)CASP8基因啟動(dòng) 子區(qū)域-6526N缺失與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的降低存在顯著相關(guān)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了SNPs功能驗(yàn)證，發(fā) 現(xiàn)由于-6526N的缺失使得CASP8基因?qū)?yīng)的mRNA表達(dá)量有所下降，最終導(dǎo)致T淋己細(xì)胞中 CASP8的活性和在癌細(xì)胞抗原誘導(dǎo)下的細(xì)胞死亡率降低。目前，SNPs分子標(biāo)記已在魚(yú)、郵、 蟹、貝等水產(chǎn)動(dòng)物中得到了廣泛的研究和應(yīng)用，包括親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性調(diào)查、Q化定 位、分子標(biāo)記輔助選育等方面。Moen等（2008)基于EST開(kāi)發(fā)了 304個(gè)SNPs標(biāo)記，構(gòu)建了 大西洋娃雌性和雄性的SNP連鎖圖譜。Prudence等（2006)對(duì)太平洋牡頗（化assostrea gigas)amylase基因（AMYA和AMYB)進(jìn)行了PCR-RFLP分析，結(jié)果表明，牡頗肉重與amylase 基因型顯著相關(guān)，運(yùn)對(duì)于遺傳育種中提高牡頗生長(zhǎng)速度具有重要的潛在價(jià)值。
[0006] 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種在魚(yú)類(lèi)育種工作中越來(lái)越重要。分 子標(biāo)記技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)育種實(shí)踐，并表現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性。但目前尚未見(jiàn)到有關(guān) 團(tuán)頭妨低氧相關(guān)基因的SNP分子標(biāo)記的報(bào)道。而本發(fā)明在團(tuán)頭妨低氧耐受和低氧敏感群體 中進(jìn)行fih-1基因的SNPs位點(diǎn)檢測(cè)W及與低氧性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)其SNPs與團(tuán)頭妨低 氧性狀顯著相關(guān)，本發(fā)明可用于團(tuán)頭妨遺傳育種及功能基因組中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供團(tuán)頭妨fih-1基因的SNP分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記作為團(tuán) 頭妨育種基因型的輔助選擇。
[0008] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所示：
[0009] 本發(fā)明通過(guò)團(tuán)頭妨低氧處理及基因組DNA提取，引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化測(cè) 序，SNP分子標(biāo)記的篩選與分析，W及通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切法（PCR-RFL巧和高分辨率烙 解曲線(xiàn)法（HRM)在團(tuán)頭妨低氧敏感和耐受群體中確定基因型，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處 理，卡方檢驗(yàn)分析基因型與低氧性狀的顯著性差異，在fih-1基因共發(fā)現(xiàn)3個(gè)與團(tuán)頭妨低氧 性狀顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)：即位于啟動(dòng)子上-402T/A突變位點(diǎn)，位于5'UTR上-106G/T突 變位點(diǎn)及位于3'UTR上+1557C/T突變位點(diǎn)（起始密碼子設(shè)為0)。
[0010] 申請(qǐng)人通過(guò)基因克隆技術(shù)，獲得團(tuán)頭妨低氧相關(guān)基因fih-lcDNA及啟動(dòng)子序列， 首次證實(shí)3個(gè)與團(tuán)頭妨低氧性狀相關(guān)的基因fih多態(tài)性SNP分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記是 下列基因片段所對(duì)應(yīng)的核巧酸序列：
[0011] (1)團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子上的SNP分子標(biāo)記，其核巧酸序列如SEQIDNO;1所 示，其中在該序列表的l〇9bp處有一個(gè)等位基因突變，利用HRM法來(lái)進(jìn)行通量分析；
[001引 似團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR上的SNP分子標(biāo)記，其核巧酸序列如沈QIDNO:2 所示，其中在該序列表的337bp處有一個(gè)等位基因突變，產(chǎn)生酶切多態(tài)性：
[001引 做團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR上的SNP分子標(biāo)記，其核巧酸序列如沈QIDNO:3 所示，其中在該序列表的87bp處有一個(gè)等位基因突變，利用HRM法來(lái)進(jìn)行通量分析。
[0014] 上述Ξ個(gè)標(biāo)記為單獨(dú)使用，且使用時(shí)無(wú)先后順序。
[0015] 本發(fā)明所述-402T/A和+1557C/T位點(diǎn)的SNPs采用HRM方法制備，而-106G/T位 點(diǎn)采用PCR-RFLP方法制備。
[0016] 本發(fā)明制備的SNPs分子標(biāo)記可應(yīng)用在檢測(cè)團(tuán)頭妨低氧相關(guān)基因fih-1多態(tài)性中， 可有效輔助選擇低氧耐受基因型。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 序列表SEQIDNO:1，是團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子和cDNA序列。
[0018] 序列表SEQIDN0:2,是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子-402T/A突變位點(diǎn)的 序列，序列長(zhǎng)度為163bp，是突變后的序列，突變位點(diǎn)燈/A)位于該序列的109bp處。
[0019] 序列表SEQIDNO:3是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR區(qū)-106G/T突變位點(diǎn) 的序列，序列長(zhǎng)度為49化P，是突變后的序列，突變位點(diǎn)（G/T)位于該序列的337bp處。
[0020] 序列表SEQIDNO:4是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR區(qū)+1557C/T突變位點(diǎn) 的序列，序列長(zhǎng)度為14化P，是突變后的序列，突變位點(diǎn)（C/T)位于該序列的87bp處。
[002。 序列表SEQIDN0:5,是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子-402T/A突變位點(diǎn)的 突變前序列，序列長(zhǎng)度為163bp。
[002引序列表SEQIDNO:6,是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR區(qū)-106G/T突變位點(diǎn) 的突變前序列，序列長(zhǎng)度為49化P。
[002引序列表SEQIDNO:7,是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR區(qū)+1557C/T突變位點(diǎn) 的突變前序列，序列長(zhǎng)度為14化P。
[0024] 是序列表SEQIDN0:8,是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-402T/A位點(diǎn)的左側(cè)引物 序列。
[002引是序列表SEQIDN0:9,是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-402T/A位點(diǎn)的右側(cè)引物 序列。
[0026] 序列表SEQIDN0:10,是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-106G/T位點(diǎn)的左側(cè)引物序 列。
[0027] 序列表SEQIDN0:11，是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-106G/T位點(diǎn)的右側(cè)引物序 列。
[0028] 序列表SEQIDN0:12,是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因+1557C/T位點(diǎn)的左側(cè)引物 序列。
[0029] 序列表SEQIDN0:13,是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因+1557C/T位點(diǎn)的右側(cè)引物 序列。
[0030] 圖1 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子中-402T/A位點(diǎn)不同基因型的 測(cè)序峰圖。
[003。 圖2 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR中-106G/T位點(diǎn)不同基因型的 測(cè)序峰圖。
[003引 圖3 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR中+1557C/T位點(diǎn)不同基因型的 測(cè)序峰圖。
[003引圖4 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子中-402T/A位點(diǎn)不同基因型的HRM結(jié)果。
[0034] 圖5 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR中-106G/T位點(diǎn)PCR-RFLP產(chǎn)物MboI酶切電泳結(jié)果分析。
[003引 圖6 :本發(fā)明的實(shí)施例中團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR中+1557C/T位點(diǎn)不同基因型的 HRM結(jié)果。
[003引 圖7 :是團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子和cDNA序列（SEQIDNO:1)。
[0037] 圖8 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子-402T/A突變位點(diǎn)的序列（SEQIDNO: 2)，序列長(zhǎng)度為163bp，是突變后的序列，突變位點(diǎn)燈/A)位于該序列的109bp處。
[003引圖9 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR區(qū)-106G/T突變位點(diǎn)的序列（SEQID NO:3)，序列長(zhǎng)度為49化p，是突變后的序列，突變位點(diǎn)（G/T)位于該序列的337bp處。
[0039] 圖10 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR區(qū)+1557C/T突變位點(diǎn)的序列（SEQID NO:4)，序列長(zhǎng)度為14化P，是突變后的序列，突變位點(diǎn)（C/T)位于該序列的87bp處。
[0040] 圖11 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因啟動(dòng)子-402T/A突變位點(diǎn)的突變前序列（SEQ IDNO:5)，序列長(zhǎng)度為163bp。
[0041] 圖12 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因5'UTR區(qū)-106G/T突變位點(diǎn)的突變前序列 (沈QIDNO:6)，序列長(zhǎng)度為49化P。
[0042] 圖13 :是用于檢測(cè)團(tuán)頭妨fih-1基因3'UTR區(qū)+1557C/T突變位點(diǎn)的突變前序列 (沈QIDNO: 7)，序列長(zhǎng)度為14化P。
[004引 圖14 :是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-402T/A位點(diǎn)的左側(cè)引物序列（SEQIDNO: 8)。
[0044] 圖15 :是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-402T/A位點(diǎn)的右側(cè)引物序列（SEQIDNO: 9) ο
[004引 圖16 :是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-106G/T位點(diǎn)的左側(cè)引物序列是（SEQIDNO: 10) 。
[004引圖17 :是用于擴(kuò)增團(tuán)頭妨fih-1基因-1