一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，該方法是通過考察注射疫苗后機體血清抗體水平來評價的，具體技術方法是創(chuàng)新性的建立了針對PPV的ELISA抗體效價評價方法。具有操作簡便、特異和敏感等特點，為PPV滅活苗抗體檢測提供一種有效技術手段。
【專利說明】一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗【技術領域】，具體涉及一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方 法。

【背景技術】
[0002] 豬細小病毒（Porcine parvovirus, PPV)引起初孕母豬的繁殖障礙性疾病，主要表 現(xiàn)為胚胎和胎豬的感染和死亡，而母豬通常表現(xiàn)為亞臨床癥狀。血清學陰性初孕母豬在妊 娠期小于70天感染PPV，可導致胚胎或胎豬的感染，從而產(chǎn)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖 障礙癥狀。PPV在世界各地普遍存在，目前已成為導致胚胎和胎豬感染和死亡的主要病原之 一。該病毒除了能直接導致母豬繁殖障礙外，還與仔豬的腸炎性腹瀉和仔豬皮炎相關。另 外，PPV與豬圓環(huán)病毒2型混合感染，誘發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥也有報道。
[0003] 目前，所使用的豬細小病毒滅活疫苗效力的評價方法為經(jīng)典的血凝抑制試驗。所 用到的試驗動物為豬或者是豚鼠，由于PPV抗體陰性豬很難找，而且試驗成本又高，選用對 PPV敏感的豚鼠來代替豬完成疫苗的效力評價得到了專家的認可。對于豚鼠的使用，試驗前 一定要測定豚鼠體內(nèi)是否有PPV HI抗體，只有PPV HI抗體陰性豚鼠，才能用于PPV滅活疫 苗的效力檢測，由于豚鼠接觸PPV后，體內(nèi)就會產(chǎn)生PPV抗體，因此，在每次試驗前均應做好 相應的監(jiān)測篩選，保證使用PPV抗體陰性豚鼠，在每次試驗中，也要設立陰性對照組，以防 試驗過程中感染PPV。在這些過程中，我們要通過HI試驗篩選和測定抗體，血清樣品需要進 行白陶土等的處理，對血凝價的判定，4單位HA的標定，試驗用PBS液PH控制等，整個試驗 過程對操作者的要求相對較高，試驗的周期較長，結果的人為因素影響較大，該方法大都只 能作為定性或相對定量，無法進行精確定量。該過程使用的試劑和豚鼠紅細胞影響對疫苗 效果的評價。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評 價方法，以實現(xiàn)測定周期短，結果易判斷，成本低的技術目的。
[0005] 為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0006] -種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，包括以下步驟：
[0007] 1)制備標準陰性血清與標準陽性血清：
[0008] 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，經(jīng)白陶土溶液處理后作為標準陰性血清；選擇滅 活疫苗免疫陰性豚鼠后血清，經(jīng)白陶土溶液處理，血凝抑制價> 1:64的血清，作為標準陽 性血清；
[0009] 2)病毒抗原的濃縮、純化；
[0010] 3)抗原的包被；
[0011] 4)檢測：
[0012] 在酶標板上加入稀釋后的待測血清100μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ;
[0013] 加入已經(jīng)包被PPV純化抗原，37°C作用0· 5?L 5h ;
[0014] 棄去一抗，用PBST洗滌；
[0015] 加入PBS稀釋的HRP標記羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0· 5?1. 5h ;
[0016] 棄去二抗，用PBST洗滌；
[0017] 加入顯色液進行避光顯色15?25min ;
[0018] 每孔加入50 μ 1終止液終止顯色；
[0019] 酶標儀讀取0D45(I的值。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟2)包括以下步驟：
[0021] 利用IBRS-2或ST細胞培養(yǎng)病毒，待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒培養(yǎng)液， 反復凍融收獲保存?zhèn)溆茫粚⒉《九囵B(yǎng)液經(jīng)4°C 5000rmp/min離心30min，去沉淀，上清液再經(jīng) 10000rpm/min 4°C離心60min，取上清；上清裝入透析袋中用0.01M pH7.4PBS緩沖液，透析 3-4d，每天換液4次；然后用PEG6000濃縮，獲得病毒濃縮液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 優(yōu)選的，步驟3)包括以下步驟：
[0023] 以陽性血清與陰性血清在不同抗原濃度下的0D45(I值之差最大作為選定最適血清 稀釋度的標準確定最適血清稀釋度，以此稀釋度對應的抗原稀釋度為最適抗原包被濃度； 利用上述最適血清稀釋度和最適抗原包被濃度為條件對抗原執(zhí)行包被。
[0024] 優(yōu)選的，步驟3)執(zhí)行抗原包被時抗原包被濃度為15?30ug/mL。
[0025] 優(yōu)選的，步驟3)執(zhí)行抗原包被時陽性血清的稀釋倍數(shù)為1:4?1:16。
[0026] 在以上技術方案中當檢測結果、即0D45(I值彡2. 1時判別為抗體陽性、即疫苗已產(chǎn) 生效力；當檢測結果、即〇〇45。值< 2. 1時判別為抗體陰性、即疫苗未產(chǎn)生效力。
[0027] 本發(fā)明具有如下技術優(yōu)越性：
[0028] (1)本發(fā)明的檢測方法檢測周期短，檢測到結果判定僅需3小時左右，而目前HI抑 制試驗檢測時間需要4?6小時。
[0029] (2)該方法穩(wěn)定性優(yōu)于HI方法，操作簡單，可重復性好，批間差異穩(wěn)定。
[0030] (3)特異性好，可準確判定陰陽性結果，而目前HI效價篩選小鼠時只能檢測到 < 23以下，通過本發(fā)明建立的ELISA方法可以精確的確定陰性小鼠，可以更嚴格的篩選陰 性小鼠。
[0031] (4)對抗體水平的評價，本發(fā)明建立的ELISA方法檢測結果與HI效價測定結果符 合率達到100%。
[0032] 本發(fā)明采用純化的細小病毒抗原，用病毒包被ELISA板，然后與待檢豚鼠血清抗 體及制備的豚鼠陽性血清進行反應，然后與辣根過氧化物酶標記的豬抗豚鼠二抗反應，最 后通過TMB顯色，同時利用購入的國標產(chǎn)品豬細小病毒滅活疫苗免疫豚鼠（PPV HK8)后采 血分離血清，制備出針對于PPV的陽性標準血清，同時采集陰性豚鼠（PPV HK8)血清作為 陰性對照，利用酶標儀檢測結果。用于在細小病毒滅活疫苗的效力試驗中陰性豚鼠的篩選， 以及抗體水平的評價。該方法與常規(guī)血凝抑制（HI)試驗比較：測定周期短，結果更易判斷， 敏感性更高，特異性更好。本研究建立的ELISA具有操作簡便、特異和敏感等特點，為PPV 滅活苗豚鼠效力試驗抗體檢測提供一種有效技術手段。

【具體實施方式】
[0033] 實施例1豬細小病毒滅活疫苗評價用豚鼠的篩選
[0034] 1.豚鼠的購入：購入10只豚鼠，來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司。
[0035] 2.采血分離血清，分別進行ELISA抗體和HI抗體效價的測定。
[0036] 2· 1HI抗體效價測定
[0037] 2. 1. 1抗原制備：對豚鼠紅細胞血凝價達1 :128以上且病毒含量達 1051^105(|/0.11111時，經(jīng)甲醛滅活，滅菌徹底后作為血凝抑制試驗抗原。以50%紅細胞凝集 (HA 5CI)的抗原最高稀釋度作為抗原效價結果判定終點?？乖璈A5(I效價不低于1:128。
[0038] 2. 1. 2陽性血清和陰性血清對照樣品的制造：選擇3-6月齡健康易感仔豬，采集血 清測定HI效價為0的血清作為陰性血清對照。選擇滅活疫苗（BJ-2株）免疫豬只后制備 血清，其一個抗原工作量（即4HA 5(I)進行血凝抑制試驗測定，HI效價> 1 :128,作為陽性對 照血清。
[0039] 2. 1. 3豬細小病毒血凝和抗豬細小病毒血清抗體血凝抑制試驗操作步驟
[0040] 2· 1. 3· 1血凝素工作液制備
[0041] ①血凝素凝集價測定：用生理鹽水將血凝素稀釋成不同倍數(shù)，加入0. 5%豚鼠紅 細胞懸液。將96孔板在振蕩器上搖勻，置于20-301：，20-401^11判定結果，使50%紅細胞凝 集的最高稀釋度，作為判定終點。
[0042] 表1血凝素凝集價測定流程數(shù)據(jù)
[0043]

【權利要求】
1. 一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 制備標準陰性血清與標準陽性血清： 采集PPV HI < 1:8的豚鼠血清，經(jīng)白陶土溶液處理后作為標準陰性血清；選擇滅活疫 苗免疫陰性豚鼠后血清，經(jīng)白陶土溶液處理，血凝抑制價> 1:64的血清，作為標準陽性血 清； 2) 病毒抗原的濃縮、純化； 3) 抗原的包被； 4) 檢測： 在酶標板上加入稀釋后的待測血清1〇〇μ 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 加入已經(jīng)包被PPV純化抗原，37°C作用0. 5?1. 5h ; 棄去一抗，用PBST洗滌； 加入PBS稀釋的HRP標記羊抗鼠IgGlOOy 1，37°C作用0. 5?1. 5h ; 棄去二抗，用PBST洗滌； 加入顯色液進行避光顯色15?25min ; 每孔加入50 μ 1終止液終止顯色； 酶標儀讀取〇D45(l的值。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，其特征在于步 驟2)包括以下步驟： 利用IBRS-2或ST細胞培養(yǎng)病毒，待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒培養(yǎng)液，反 復凍融收獲保存?zhèn)溆?；將病毒培養(yǎng)液經(jīng)4°C 5000rmp/min離心30min，去沉淀，上清液再經(jīng) 10000rpm/min 4°C離心60min，取上清；上清裝入透析袋中用0· 01M pH7. 4PBS緩沖液，透析 3-4d，每天換液4次；然后用PEG6000濃縮，獲得病毒濃縮液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3. 根據(jù)權利要求1所述的一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，其特征在于步 驟3)包括以下步驟： 以陽性血清與陰性血清在不同抗原濃度下的〇D45(l值之差最大作為選定最適血清稀釋 度的標準確定最適血清稀釋度，以此稀釋度對應的抗原稀釋度為最適抗原包被濃度；利用 上述最適血清稀釋度和最適抗原包被濃度為條件對抗原執(zhí)行包被。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，其特征在于步 驟3)執(zhí)行抗原包被時抗原包被濃度為15?30ug/mL。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種豬細小病毒滅活疫苗免疫效力評價方法，其特征在于步 驟3)執(zhí)行抗原包被時陽性血清的稀釋倍數(shù)為1:4?1:16。
【文檔編號】G01N33/96GK104215781SQ201410449450
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權日:2014年9月4日
【發(fā)明者】呂茂杰, 楊保收, 盛長忠, 梁武 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司