專利名稱：一種豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法。
背景技術：
豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是一種自主復制型病毒，是引起母豬產畸形胎的主要因素之一，通常初產母豬感染PPV之后可引起繁殖障礙，主要表現(xiàn)為流產、不孕、產死胎和木乃伊胎等，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經濟損失。PPV、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) —直是豬病研究的熱點，最近研究發(fā)現(xiàn)PPV在豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)中扮演著重要角色。PPV基因組為單鏈線狀DNA分子，大小約為5000個核苷酸，成熟的病毒粒子僅含有負鏈DNA基因組。研究發(fā)現(xiàn)，PPV同細小病毒屬的其他細小病毒的基因組有很高的同源性。此外，PPV的基因組結構與其他細小病毒相似，兩端有發(fā)夾結構，3'端有一個102 bp 的回文序列折疊形成的“Y”字型發(fā)夾結構；5'端有一個127 bp的回文序列、中間被一個24 bp的短回文序列中斷并折疊形成的“U”字形發(fā)夾結構，這種末端結構對其復制是非常重要的?；蚪M有2個開放閱讀框架(0RF)，5'端的ORFl編碼非結構蛋白(即調節(jié)蛋白)， 3'端的0RF2編碼結構蛋白，結構蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。由啟動子P4開始轉錄的NS基因編碼3種非結構蛋白NS1、NS2和NS3 ；由啟動子P40開始轉錄翻譯3種結構蛋白 VPU VP2和VP3，它們的分子質量分別約為83、64、60ku。目前市場上防制PPV的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗。在臨床應用中發(fā)現(xiàn)滅活疫苗有如下缺點(1)需要大劑量接種或應用濃縮抗原，免疫期短，常需強化接種；(2)不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；(3)產生完全免疫力需要2-3周，不利于緊急預防接種與降低疫苗費用；(4)存在滅活不徹底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返強、重組及潛在感染的危險，很難在實踐中推廣應用。故傳統(tǒng)疫苗在防制PPV中暴露出越來越多的問題，一種新型既安全又可靠的基因工程疫苗迫在眉睫。VP2是構成PPV衣殼蛋白的主要成分，也是中和抗體作用的靶蛋白，含有病毒的主要抗原決定簇，還具有血凝活性。VP2基因編碼的多肽能自我裝配成類病毒粒子(VLPs)，能誘導很強的免疫應答。趙俊龍等研究發(fā)現(xiàn)PPV VP2在60-68，81-88，266-275，351-357和 398-404氨基酸處存在抗原位點的優(yōu)勢區(qū)域。梁秀麗等發(fā)現(xiàn)VP2蛋白較有可能成為B細胞表位的區(qū)段位于 N 端第 10-18,34- 39、94-103、121-126、137-144、156-165 和 209-214 區(qū)段。Soren K等學者分析了 PPV的抗原結構，發(fā)現(xiàn)有9個線性表位均位于VP2中，只有VP2 N 端表位能誘導病毒中和抗體，用哺乳動物細胞系表達或用桿狀病毒表達時VP2蛋白可形成 VLPs0從分離純化的病毒粒子電鏡圖中可以找到兩種形態(tài)的病毒粒子一種為完整病毒粒子，內含PPV ssDNA ；另一種為病毒空衣殼，內無DNA，病毒空衣殼中VP2含量最高，這種“空芯”病毒粒子仍具有很好的免疫原性。2007年，Yi G X等用重組乳酸菌表達了 VP2蛋白， 其表現(xiàn)出很好的免疫原性?；谏鲜鎏攸c，VP2成為PPV在診斷和免疫學研究方面的熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)巴斯德畢赤酵母中高效表達豬細小病毒主要結構蛋白VP2 基因，所以以此高表達量的結構蛋白為基礎，提供了豬細小病毒基因工程疫苗。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)
1.構建重組酵母表達載體在GenBank上面查找國際標準弱毒株豬細小病毒VP2 基因，序列號NC-001718，表達載體為pGAPZaA，宿主菌為酵母菌株SMD1168 (購自 Invitrogen公司)，構建pGAPZ a A-VP2重組酵母表達載體。PCR擴增出PPV VP2全基因序列，上游引物Pl如SEQ ID NO:1所示，下游引物P2如SEQ ID NO: 2所示，酶切位點為Xho I 和Not I，AAAAGA為Kex2蛋白酶切位點。2.構建重組酵母工程菌將其線性化電擊轉化巴斯德畢赤酵母，構建表達工程菌。將感受態(tài)A/^1Siori1S SMDl 168 100 μ L 與經 Avr II 線性化的 pGAPZ a A-VP2 10 yg 相混合，冰浴5π η，300ν、200Ω電擊15ms，然后迅速加入Iml IM的山梨醇，將轉化后的酵母細胞鋪于新鮮制備的YPDS平板(含100 mg/ml Zeocin)上，將平板倒置，于30°C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，培養(yǎng)纊3 d。采用煮-凍-煮法制備PCR模板分析P.pastoris轉化子。再經不同濃度Zeocin的YPDS平板篩選高拷貝轉化子，用于高效表達目的蛋白。3.重組酵母工程菌的非誘導表達用滅菌槍頭挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，于5mL的YPD液體培養(yǎng)基中進行一級培養(yǎng)，30°C，200 r/min振蕩過夜，至 0D_=2-6，即細胞處于對數(shù)生長期。取ImL—級培養(yǎng)液，重懸于50mL的YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報紙包扎，培養(yǎng)約72小時。4.表達蛋白的純化培養(yǎng)約72小時的培養(yǎng)物低速離心收集上清，用膜系統(tǒng)等方法純化蛋白。5. PPV基因工程疫苗的制備對上訴表達上清進行SDS-PAGE和Western Blot 分析，然后將青霉素、鏈霉素與分離純化的蛋白混合，再加入進口的納米佐劑同生理鹽水或 PBS混合，將混合物PH值調至生理值，即PH7. 0-7. 5，即制備了豬細小病毒基因工程疫苗。由于PPV VP2蛋白對密碼子的偏好性與巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)對密碼子的偏好性差異最小，故選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)，且其對表達外源蛋白十分有利，(1)高穩(wěn)定該系統(tǒng)的表達載體不是以自主復制的質粒形式存在，而是整合到酵母染色體上，故構建的菌株十分穩(wěn)定；(2)高分泌巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中的α-因子信號肽的分子生物學特性研究的十分清楚，加之它自身的生物學特性，其分泌表達可達lg/L，這在已知的分泌表達系統(tǒng)中十分少見；(3)成本低重組蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達比在昆蟲和哺乳動物中表達成本要低，培養(yǎng)基不需要像牛血清白蛋白那樣昂貴的添加物，也不需要二氧化碳培養(yǎng)箱和組織培養(yǎng)箱等昂貴的設備；(4)容易放大重組蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達已在 1000 L發(fā)酵罐中實現(xiàn)了工業(yè)化生產。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明重組酵母菌表達的目的蛋白很高，而且目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，而酵母菌自身表達的蛋白由于沒有信號肽無法分泌到培養(yǎng)基中，故表達上清中幾乎無雜蛋白(見附圖1)，且酵母菌株SMD1168屬于蛋白酶缺陷型菌株，防止了目的蛋白降解；由于表達載體 pGAPZ a A含有a -因子信號肽，易于表達產物分泌到培養(yǎng)基中，從而更容易分離純化目的蛋白，避免了由于酵母細胞壁較牢固難破碎來獲取并純化蛋白的難題，且在PPV VP2蛋白N端引入Kex2蛋白酶，以保證其形成天然N端，從而保證了 VP2蛋白的生物學活性。PPV VP2的密碼子與大腸桿菌、酵母菌、人的密碼子偏愛性差異分析發(fā)現(xiàn)，VP2密碼子與酵母密碼子偏愛性的差異最小，故選擇酵母表達系統(tǒng)優(yōu)化表達以提高表達量，且國內未見VP2在酵母中表達相關報道，本發(fā)明VP2蛋白表達量高達595. 76mg/L (見實施例3)， 明顯優(yōu)于其他表達系統(tǒng)。本發(fā)明選擇的酵母表達載體pGAPZ α A是一種非誘導組成型分泌表達載體，含有 3_磷酸甘油醛脫氫酶強啟動子，優(yōu)于其他啟動子，表達量更高，重要的是不需要甲醇誘導， 防止了甲醇的危險及其對酵母細胞的毒副作用。本發(fā)明從碳源和氮源對發(fā)酵條件進行了初步探索，從成本和表達量兩因素研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖作為碳源優(yōu)于甘油，以尿素作為氮源優(yōu)于胰蛋白胨和硫酸銨，間歇性地流加以補充碳源和氮源更有利于酵母細胞的生長；且在發(fā)酵過程中發(fā)酵罐中的溶氧量對酵母生長以及表達量的提高起著舉足輕重的作用，特別是發(fā)酵第三天，溶氧量要求更高，同時保證發(fā)酵液PH值在5. 5-6. 0之間。


圖1是PPV VP2蛋白SDS-PAGE分析，1 未經濃縮pGAPZ α A-VP2表達上清；2 pGAPZ α A空載體表達上清；M 預染蛋白分子量Marker ；
圖2是PPV VP2蛋白Western Blot分析，1，2 未經濃縮pGAPZ α A-VP2表達上清；M 預染蛋白分子量Marker ；3 :pGAPZ α A空載體表達上清。圖3是實施例3中PPV VP2蛋白濃度測定制作的標準蛋白BSA濃度曲線。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1
1.構建重組酵母表達載體表達載體為pGAPZ α A，宿主菌為酵母菌株SMDl 168。PCR擴增出PPV VP2全基因序列，上游引物Pl如SEQ ID NO: 1所示，下游引物Ρ2如SEQ ID NO:2 所示，酶切位點為Xho I和Not I，AAAAGA為Kex2蛋白酶切位點。2.構建重組酵母工程菌以上述構建好的重組酵母表達載體線性化電擊轉化酵母菌株SMDl 168，線性化酶為Avr II。3.重組酵母工程菌的非誘導表達用滅菌槍頭挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，于5mL的YPD液體培養(yǎng)基中進行一級培養(yǎng)，30°C，200 r/min振蕩過夜，至0D6(1(1=2-6， 即細胞處于對數(shù)生長期。取ImL—級培養(yǎng)液，重懸于50mL的YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報紙包扎，培養(yǎng)約72小時。4.表達蛋白的純化培養(yǎng)約72小時的培養(yǎng)物低速離心收集上清，用膜系統(tǒng)等方法純化蛋白。5. PPV基因工程疫苗的制備對上訴表達上清進行SDS-PAGE和Western Blot分析 (圖廣2)，然后將青霉素、鏈霉素與分離純化的蛋白混合，再加入佐劑同生理鹽水或PBS混合，將混合物PH值調至生理值，即PH7. 0-7. 5，即制備了豬細小病毒基因工程疫苗。佐劑選用進口納米佐劑。
實施例2
動物實驗將上述制備的PPV基因工程疫苗免疫體重基本無差異、精神狀況良好PPV陰性的仔豬，同時設陽性對照、空載體對照、生理鹽水對照、佐劑對照以及不做任何處理的空白對照，15天后加強免疫，經ELISA試劑盒檢測產生抗體后，使用豬細小病毒強毒株進行攻毒實驗(F組除外)，以檢測所產生的抗體有沒有保護力。實驗如下
權利要求
1.豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)根據(jù)豬細小病毒VP2基因序列，構建重組酵母載體pGAPZα A-VP2 ；(2)將線性化的重組酵母載體pGAPZα A-VP2電擊轉化酵母菌株SMD1168，篩選高拷貝的重組酵母工程菌，鑒定；(3)將鑒定的陽性重組酵母工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，表達豬細小病毒主要結構蛋白VP2；(4)對表達的結構蛋白進行純化，加佐劑，制得豬細小病毒基因工程疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法，其特征在于步驟(2)所述篩選高拷貝的重組酵母工程菌是將線性化的重組酵母載體PGAPZ α A-VP2電擊轉化酵母菌株 SMDl 168 后，分別涂布于含 100 μ L、150 μ L、200 μ L ZeocinC 100mg/ml)抗性的 YPDS 平板，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置避光培養(yǎng)2 3天，待白色的單菌落長出，即篩選出不同Zeocin 抗性濃度下的高拷貝重組酵母工程菌。
3.根據(jù)權利要求1所述豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法，其特征在于所述佐劑為納米佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬細小病毒基因工程疫苗的制備方法。本發(fā)明所述方法首先是構建重組酵母表達載體pGAPZαA-VP2，然后電擊轉化巴斯德畢赤酵母菌株SMD1168，使VP2蛋白在YPD培養(yǎng)基中高效分泌表達，形成不含病毒核酸的病毒樣顆粒，然后純化蛋白，經SDS-PAGE和WesternBlot及電鏡檢測，加相應的免疫佐劑即制成了豬細小病毒基因工程疫苗。本發(fā)明所述方法制得的豬細小病毒基因工程疫苗解決了當前豬細小病毒傳統(tǒng)疫苗存在的缺陷，可用于預防和治療豬細小病毒感染及其引起的相關疾病，也同樣適用于制備檢測豬細小病毒抗體ELISA試劑盒的包被抗原。
文檔編號A61P31/20GK102319440SQ201110239759
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權日2011年8月19日
發(fā)明者劉德輝, 郭春和, 黃毓茂 申請人:華南農業(yè)大學