專利名稱：一種聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微球制備方法領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)因子是一類能刺激靶細(xì)胞產(chǎn)生某些生物效應(yīng)的生物活性多肽或蛋白質(zhì)，目前此類蛋白質(zhì)藥物主要包裹方式是采用有機(jī)溶媒如氯仿、二氯甲烷制備的高分子微球，會(huì)有遇到蛋白藥物穩(wěn)定性降低的問(wèn)題，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)藥物突釋等問(wèn)題。如何采用相對(duì)溫和的條件包裹蛋白質(zhì)藥物保持其長(zhǎng)效活性，并且實(shí)現(xiàn)可控釋放，是目前藥物載體系統(tǒng)研究的一個(gè)重要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有包括生長(zhǎng)因子的藥物載體中存在的穩(wěn)定性降低、藥物突釋等問(wèn)題，提供一種穩(wěn)定性好、具有長(zhǎng)效活性且可控釋放的自組裝載藥微球的制備方法。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明以水溶性聚合物為囊材，包括蛋白質(zhì)藥物，采用高壓靜電使其分散成一定粒徑的霧滴狀膠囊，可避免使用傳統(tǒng)乳化成囊法所需的有機(jī)溶媒。利用相同的原理，將含有蛋白質(zhì)藥物的海藻酸鈉溶液在高壓電場(chǎng)力的作用下分散成小液滴，使之與堿土金屬離子交聯(lián)形成微水凝膠，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)毒包裹，并得到表面光滑、圓整、均勻性好的微球。一種聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，包括如下步驟
(1)以含有生長(zhǎng)因子的海藻酸鈉水溶液為原料液，以氯化鈣溶液為凝膠浴，在高壓靜電場(chǎng)裝置中制備微凝膠；
(2)用靜電納米層層自組裝技術(shù)在微凝膠表面組裝多層高分子聚電解質(zhì)膜，得到自組裝載藥微球；
步驟(1)中，所述高壓靜電場(chǎng)裝置由靜電場(chǎng)發(fā)生器和注射器泵組成，所述原料液裝入注射器泵上，將靜電場(chǎng)發(fā)生器正極與注射器銳孔連接，負(fù)極與氯化鈣凝膠浴連接，使銳孔和凝膠浴之間形成靜電場(chǎng)；靜電場(chǎng)發(fā)生器輸出電壓，在注射器泵的推動(dòng)力和電場(chǎng)力的作用下，原料液克服黏滯力和表面張力，從銳孔以液滴狀滴入氯化鈣溶液中固化，形成包封了含有生長(zhǎng)因子的海藻酸鈣的微凝膠，生長(zhǎng)因子會(huì)均勻分布于微凝膠中；
步驟(2)中，將微凝膠置于殼聚糖溶液中成膜反應(yīng)后，去離子水洗除去未吸附的殼聚糖，再將其置于右旋糖酐硫酸鈉溶液中成膜反應(yīng)，再用去離子水洗除去未吸附的右旋糖酐硫酸鈉，重復(fù)上述操作，逐層吸附殼聚糖和右旋糖酐硫酸鈉，得到所需層數(shù)的自組裝載藥微球。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述原料液含10ug/ml的bFGF和2wt%的海藻酸鈉。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述靜電場(chǎng)發(fā)生器的輸出電壓為15kV。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述成膜反應(yīng)的時(shí)間為15min ；所述洗脫時(shí)間為 30s。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述殼聚糖溶液中含有0. 1質(zhì)量體積％的殼聚糖，PH值為5.6。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述右旋糖酐硫酸鈉溶液中含有0. 1質(zhì)量體積％ 的右旋糖酐硫酸鈉，pH值為5. 6。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)將含有蛋白質(zhì)藥物的海藻酸鈉溶液在高壓電場(chǎng)力的作用下分散成小液滴，使之與堿土金屬離子交聯(lián)形成微水凝膠，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)毒包裹，并得到表面光滑、圓整、均勻性好的微球；
(2)本發(fā)明通過(guò)層層自組裝方法可以改變納米層的厚度及組成，進(jìn)而保護(hù)生長(zhǎng)因子活性，并能有效避免突釋，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效恒速率釋放；而且，早期微球中生長(zhǎng)因子的釋放屬于擴(kuò)散機(jī)制，生長(zhǎng)因子穿過(guò)表面的聚電解質(zhì)多層納米膜進(jìn)行釋放；在釋放后期，海藻酸鹽微凝膠由于交聯(lián)點(diǎn)密度降低，出現(xiàn)基體崩解，同時(shí)聚電解質(zhì)多層納米膜發(fā)生降解，因此生長(zhǎng)因子的釋放同時(shí)受到擴(kuò)散及降解兩種機(jī)制調(diào)控，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的控釋；
(3)本發(fā)明的層層自組裝這種層疊方式主要通過(guò)靜電相互作用成囊，是一種弱相互作用力，基本上不會(huì)影響包載藥物的性質(zhì)，這對(duì)于穩(wěn)定性差、生物半衰期短的多肽類藥物來(lái)說(shuō)，非常適合包載。


圖1為高壓靜電液滴法制備微球的裝置圖； 圖2為納米層層自組裝技術(shù)路線；
圖3為本發(fā)明經(jīng)過(guò)自組裝后生長(zhǎng)因子的釋放速率。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)材料
海藻酸鈉(251時(shí)^)水溶液的粘度為250cps)，Sigma公司；右旋糖酐硫酸鈉(Mw > 5000 000)，Sigma公司；人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，暨南大學(xué)生物工程研究所；殼聚糖 (粘度為4(TIOOMPa . s)，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；human basic ELISA試劑盒，達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，廣州化學(xué)試劑廠；氯化鈣(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇(分析純)，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q (Integral 5)去離子水。連續(xù)變倍體視顯微鏡(Smz-T4)，重慶奧特光學(xué)儀器公司；掃描電子顯微鏡(XL-30), Philips公司；高壓直流電源(DW-P503-4ACCD)，天津三川公司；微量注射器泵 (LSP01-1A)，保定蘭格公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器(CHA-S)，江蘇金壇有限公司；注射器 (2. 5ml)，浙江京環(huán)醫(yī)療用品公司。實(shí)驗(yàn)方法
采用高壓靜電液滴法制備海藻酸鈣微球，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。以含10Ug/ml的bFGF 和2wt%的海藻酸鈉水溶液為原料液，3. 0% (w/v)的CaCl2水溶液為接收器，微量注射器泵以5ml/h的速率推注出海藻酸鈉水溶液，在電壓為15kV的電場(chǎng)力作用下，海藻酸鈉溶液克服表面張力及粘滯力，以一定粒徑的液滴落入氯化鈣溶液中，通過(guò)Ca2+與海藻酸鈉交聯(lián)固化形成不溶于水的海藻酸鈣微球，固化20分鐘，去離子水洗后，于pH值為5. 6的0. 1質(zhì)量體積％的殼聚糖溶液中成膜反應(yīng)，成膜時(shí)間為15min ；將微球取出，去離子水洗30s，于pH值為5.6的0. 1質(zhì)量體積％的右旋糖酐硫酸鈉溶液中成膜反應(yīng)，成膜時(shí)間為15min。重復(fù)上述操作，逐層吸附殼聚糖和右旋糖酐硫酸鈉，得到所需層數(shù)的自組裝載藥微球。1.包封率的測(cè)定
用3wt%乙二胺四乙酸二鈉溶液溶解靜電液滴法制備所得微球，10000rpm，4°C離心10 分鐘，ELISA方法測(cè)定上清液中bFGF含量，計(jì)算微球包封率。包封率=(實(shí)測(cè)值/理論值)％。表1藥物包封率數(shù)據(jù)
理論值/ng780實(shí)測(cè)值/ng450包封率％57.69231
2.體外釋放
將上訴所得不同疊層層數(shù)的微球置于5ml的PH=7. 4的PBS溶液中，37°C，IOOrpm恒溫振蕩器中進(jìn)行體外藥物釋放，特定的時(shí)間取Iml上清液，加入相同體積的新鮮PBS，ELISA試劑盒測(cè)試生長(zhǎng)因子含量，計(jì)算藥物累積釋放率，繪制bFGF累計(jì)釋放曲線。藥物累積釋放率％= (t時(shí)間藥物釋放總量/實(shí)際載藥量)％。表2不同疊層層數(shù)微球藥物累積釋放率％
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于包括如下步驟(1)以含有生長(zhǎng)因子的海藻酸鈉水溶液為原料液，以氯化鈣溶液為凝膠浴，在高壓靜電場(chǎng)裝置中制備微凝膠；(2)用靜電納米層層自組裝技術(shù)在微凝膠表面組裝多層高分子聚電解質(zhì)膜，得到自組裝載藥微球；步驟(1)中，所述高壓靜電場(chǎng)裝置由靜電場(chǎng)發(fā)生器和注射器泵組成，所述原料液裝入注射器泵上，將靜電場(chǎng)發(fā)生器正極與注射器銳孔連接，負(fù)極與氯化鈣凝膠浴連接，使銳孔和凝膠浴之間形成靜電場(chǎng)；靜電場(chǎng)發(fā)生器輸出電壓，原料液從銳孔以液滴狀滴入氯化鈣溶液中固化，形成包封了含有生長(zhǎng)因子的海藻酸鈣的微凝膠；步驟(2)中，將微凝膠置于殼聚糖溶液中成膜反應(yīng)后，去離子水洗除去未吸附的殼聚糖，再將其置于右旋糖酐硫酸鈉溶液中成膜反應(yīng)，再用去離子水洗除去未吸附的右旋糖酐硫酸鈉，重復(fù)上述操作，逐層吸附殼聚糖和右旋糖酐硫酸鈉，得到所需層數(shù)的自組裝載藥微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述原料液含10ug/ml的bFGF和2wt%的海藻酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述靜電場(chǎng)發(fā)生器的輸出電壓為15kV。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述成膜反應(yīng)的時(shí)間為15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述洗脫時(shí)間為30s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述殼聚糖溶液中含有0. 1質(zhì)量體積％的殼聚糖，PH值為5. 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法，其特征在于所述右旋糖酐硫酸鈉溶液中含有0. 1質(zhì)量體積％的右旋糖酐硫酸鈉，PH值為 5. 6。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種聯(lián)合高壓靜電液滴法和層層自組裝法制備自組裝載藥微球的方法。本發(fā)明是以含有生長(zhǎng)因子的海藻酸鈉水溶液為原料液，以氯化鈣溶液為凝膠浴，在高壓靜電場(chǎng)中制備微膠囊，使生長(zhǎng)因子均勻分布于微凝膠中，然后再用靜電納米層層自組裝技術(shù)在微凝膠表面組裝多層高分子聚電解質(zhì)膜，得到自組裝載藥微球。本發(fā)明方法制得的自組裝載藥微球表面光滑、圓整、均勻性好，可保護(hù)生長(zhǎng)因子的活性并有效避免突釋，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效恒速率釋放。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102258481SQ20111023975
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者何留民, 左琴華, 張奕, 施云峰, 薛巍, 謝莎莎, 黃躍新 申請(qǐng)人:薛巍