專利名稱：A2超基序亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的內(nèi)容涉及設(shè)計(jì)在大部分人群中，具體是在那些特征性具有A2超型等位基因的人群中有效的疫苗?？稍O(shè)計(jì)包含A2超基序的亞單位疫苗對(duì)這樣的人群起作用。
背景某給定哺乳動(dòng)物的基因組成編碼3與此種動(dòng)物免疫系統(tǒng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)。雖然人群中存在著大量的遺傳多樣性，比較人和其他物種甚至更多，但還是有共同的特征和作用。在哺乳動(dòng)物中，一些與免疫功能相關(guān)的分子稱為主要組織相容性復(fù)合物。
MHC分子分為I型或II型分子。II型MHC分子主要在參與起動(dòng)和維持免疫應(yīng)答的細(xì)胞上表達(dá)，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。II型MHC分子由輔助T淋巴細(xì)胞識(shí)別并誘導(dǎo)輔助T淋巴細(xì)胞增殖和放大對(duì)展示的特異性免疫原性肽的免疫應(yīng)答。I型MHC分子在幾乎所有有核細(xì)胞上表達(dá)并由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)識(shí)別，然后CTLs破壞攜帶抗原的細(xì)胞。CTLs在腫瘤排斥和對(duì)抗病毒感染中特別重要。
CTLs識(shí)別以肽片斷結(jié)合I型MHC分子形式的抗原而不是完整的外來抗原本身。抗原通常必須由細(xì)胞內(nèi)源性合成，一部分蛋白抗原在細(xì)胞質(zhì)中降解成小肽片斷。一些這種小肽移位到前高爾基腔室中并與I型重鏈反應(yīng)以協(xié)助合適的折疊和與微珠蛋白β2亞基相結(jié)合。此肽-I型MHC分子復(fù)合物隨之發(fā)送到細(xì)胞表面而表達(dá)并被特異性Ls潛在識(shí)別。
對(duì)人MHCI類分子、HLA-A2.1晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，肽結(jié)合溝由I型重鏈α1和α2結(jié)構(gòu)域折疊產(chǎn)生(Bjorkman等，Nature 329506(1987))。然而，這些研究沒有確定結(jié)合于此溝的肽的特性。
Buus等，Science 2421065(1988)首先描述了用酸洗脫法從MHC分離結(jié)合的肽的方法。隨后，Rammensee和他的同事(Falk等，Nature 351290(1991))發(fā)展了特征鑒定結(jié)合于I型分子的天然加工的肽的方法。其它研究者成功地實(shí)現(xiàn)了用常規(guī)自動(dòng)測(cè)序從B類I型分子洗脫的肽方法在不同HPLC組分中更豐富肽的直接氨基酸測(cè)序(Hunt等，Science 2251261(1992)。Rotzschke和Falk介紹了MHC I類分子中自然加工的肽的特征的綜述(Rotzschke和Falk，Immunol.Today12447(1991))。PCT出版物WO 97/34621，(納入本文參考文獻(xiàn)中)描述了具有A2.1等位基因結(jié)合基序的肽。
Sette等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863296(1989)顯示MHC等位基因特異性基序可用于預(yù)測(cè)MHC結(jié)合能力。Schaeffer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA864649(1989)表明MHC結(jié)合與免疫原性相關(guān)。其他學(xué)者(De Bruijn等，Eur.J.Immunol.，212963-2970(1991)；Pamer等，Nature 353852(1991))提供了I型結(jié)合基序可在動(dòng)物模型中用于鑒定潛在性免疫原性肽的初步證據(jù)。對(duì)某給定I型同型的一些人等位基因特異的I型基序還有待描述。理想的情況是這些不同的等位基因組合頻率應(yīng)足夠高以覆蓋大部分或者也許絕大部分遠(yuǎn)交人群。
盡管技術(shù)得到發(fā)展，以前的技術(shù)尚沒有提供基于此工作的有用的人肽為基礎(chǔ)的疫苗或治療劑。
概述本發(fā)明提供預(yù)期在大部分目標(biāo)人群中有效的疫苗的設(shè)計(jì)參數(shù)。遵循本文提出的指南，制備針對(duì)具體傳染性生物體或病毒或腫瘤的疫苗，評(píng)估相關(guān)抗原以確定最可能影響對(duì)感染或腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的抗原表位位置。通過本文提出的方法分析該抗原的氨基酸順序，可能鑒定到一套適當(dāng)?shù)目乖砦?。不難測(cè)定由這些抗原表位組成的肽的結(jié)合1個(gè)或多個(gè)具有A2-超型特征的HLA等位基因的能力。通常，以500nM或更少IC50的親合力結(jié)合的肽，具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的高度可能性。這些肽這樣做的能力也可能不難驗(yàn)證。然后可根據(jù)如此鑒定的免疫原性肽設(shè)計(jì)設(shè)苗。此疫苗本身可由肽本身、預(yù)期在體內(nèi)可產(chǎn)生比肽的前體，或編碼在體內(nèi)產(chǎn)生這些肽的核酸組成。
因此，一方面，本發(fā)明涉及鑒定病原或腫瘤特征性抗原中抗原表位方法。用此方法鑒定的抗原表位比任意選擇的肽更可能增強(qiáng)攜帶A2-超型等位基因的個(gè)體的免疫應(yīng)答。此方法包括分析抗原的8-11氨基酸區(qū)段的氨基酸序列，其中2位氨基酸是小的或脂肪族疏水殘基(L、I、V、M、A、T或Q)且該區(qū)段C末端氨基酸也是小的或脂肪族疏水殘基(L、I、V、M、A或T)。在一較佳實(shí)施方案中，2位殘基是L或M。在另一較佳實(shí)施方案中，此區(qū)段包含9-10氨基酸。在又一較佳實(shí)施方案中，當(dāng)該區(qū)段斷是10-聚體時(shí)，其包含1位的Q或N和/或8位的R、H或K，缺少3位的D、E和G。2位和C末端為V也是優(yōu)選的。
包含具有HLA-A2.1分子結(jié)合基序亞序列的免疫原性肽的組合物本文也有描述。此肽中能結(jié)合相應(yīng)MHC等位基因的免疫原性表位宜長(zhǎng)8-11個(gè)殘基，更佳長(zhǎng)9-10個(gè)殘基，并在某些位置如2位和C末端包含保守殘基。而且此肽在本文所確定的不包含負(fù)結(jié)合殘基，如9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽在1、3、6和/或7位和10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽在1、3、4、5、7、8和/或9位。本發(fā)明明確了選擇性有效結(jié)合HLA-A2.1的肽在基序中的位置。
一些免疫原性靶蛋白上的抗原表位可采用本文描述的序列基序來鑒定。合適抗原的例子包括前列腺癌特異性抗原(PSA)，乙型肝炎核心和表面抗原(HBVc，HBVs)丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，人免疫缺陷1型病毒(HIV1)，卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，拉沙病毒，結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53，CEA，錐蟲表面抗原(TSA)和Her2/neu。這些肽和編碼它們的核酸可用于體內(nèi)和體外治療和診斷用的藥物組合物中。
定義術(shù)語“肽”在本說明書中可與“寡肽”交換使用以命名一殘基系列，通常是由α-氨基和毗鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵彼此相連的L-氨基酸。寡肽一般長(zhǎng)度小于250氨基酸，且可小于150、100、75、50、25或15氨基酸長(zhǎng)度。此外，本發(fā)明的寡肽可不包含天然抗原的15個(gè)以上的毗連氨基酸。
用于描述肽化合物的術(shù)語遵循常規(guī)慣例，每個(gè)氨基酸殘基中氨基在左邊(N末端)羧基在右邊(C末端)。在提供的所選出的本發(fā)明具體實(shí)施方案的公式中，氨基和羧基末端，雖然沒有具體顯示，是采取其在生理PH值時(shí)的形式，除非另有說明。在氨基酸結(jié)構(gòu)式中，每個(gè)殘基通常用標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)字母或單字母名稱表示。L-型氨基酸殘基用大寫單字母或三字母符號(hào)第一個(gè)字母大寫表示，具有D型氨基酸的D型用小寫單字母或小寫三字母符號(hào)表示。甘氨酸沒有不對(duì)稱碳原子簡(jiǎn)寫為“Gly”或G。
“免疫原性肽”或“抗原表位”是包含等位基因-特異性基序的肽或氨基酸序列，此種肽序列會(huì)結(jié)合MHC分子并誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性肽能結(jié)合適當(dāng)?shù)腍LA-A2分子并誘導(dǎo)對(duì)衍生該免疫原性肽的抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性肽長(zhǎng)度小于15個(gè)殘基，經(jīng)常長(zhǎng)度小于12個(gè)殘基，通常由約8-11個(gè)之間的殘基組成，9或10個(gè)殘基較佳。
免疫原性肽可用本發(fā)明的算法方便地鑒定。此種算法是產(chǎn)生能選出免疫原性肽的評(píng)分的數(shù)學(xué)程序。通常使用的算法評(píng)分具有一個(gè)“結(jié)合閾值”，能選也具有高度可能性以特定親和力結(jié)合并進(jìn)而具有免疫原性的肽。此種算法是根據(jù)某肽的某具體位置的具體氨基酸對(duì)MHC結(jié)合的作用或在含肽的基序中一具體置換對(duì)結(jié)合的作用。
結(jié)合結(jié)果常用“IC50”表示。IC50是在結(jié)合試驗(yàn)中觀察到的能抑制50％參比肽結(jié)合的肽濃度。試驗(yàn)的條件如本文所述(也就是限制HLA蛋白和標(biāo)記肽濃度)，這些值接近KD值。測(cè)定結(jié)合的試驗(yàn)在PCT出版物WO 94/20127和WO 94/03205中有詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)指出如果試驗(yàn)條件變化IC50值可以變化，通常很劇烈，這取決于所用的具體試劑(如HLA制劑等)。例如，濃度過量的HLA分子會(huì)提高某給定配體的表觀IC50測(cè)定值，因此不能反映真實(shí)KD值。
結(jié)合通常用相對(duì)于參比肽的比率表示。由于具體試驗(yàn)的靈敏度可增加或減少，測(cè)試肽的IC50可能稍有變化。然而，相對(duì)參比肽的結(jié)合不會(huì)顯著改變。例如，在參比肽IC50增加10倍情況下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)試肽的IC50值也會(huì)變化約10倍。因此，為避免含糊不準(zhǔn)，評(píng)價(jià)其肽是否是好的、中等的、弱的或負(fù)結(jié)合劑一般根據(jù)其IC50，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)肽的IC50。如實(shí)施例1中所述，結(jié)合可以報(bào)造為一種比率或者此比率可用于歸一化IC50值。
如本所用，對(duì)HLA I型分子的高親和力定義為以小于50nM的IC50值或KD值結(jié)合。中等親和力是以約50至500nM之間的IC50(或KD)結(jié)合。
“保守殘基”是在某肽中特殊位置比隨機(jī)分布預(yù)期高得多的頻率出現(xiàn)的氨基酸。通常保守殘基是MHC結(jié)構(gòu)的提供與免疫原性肽接觸點(diǎn)的殘基。在確定長(zhǎng)度的一個(gè)肽中有1到3個(gè)保守殘基，2個(gè)較佳，確定了免疫原性肽基序。這些殘基一般與肽結(jié)合溝緊密接觸，它們的側(cè)鏈埋在此溝的特殊袋中。通常，一個(gè)免疫原性肽包括至多3個(gè)保守殘基，更經(jīng)常是2個(gè)保守殘基。
如本文所用，“負(fù)結(jié)合殘基”是如果出現(xiàn)在某些位置(如9-聚體的1、3和/或7位)會(huì)產(chǎn)生不結(jié)合或弱結(jié)合的肽進(jìn)而沒有免疫原性即不能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的氨基酸。
術(shù)語“基序”指確定長(zhǎng)度肽中殘基的模式，通常約8-11個(gè)氨基酸，被特殊MHC等位基因所識(shí)別此種。此種肽基序一般在每種人MHC等位基因中不同并且高保守殘基和負(fù)殘基模式不同。
等位基因的結(jié)合基序可用精確度增加程度確定。在一種情況中，所有保守殘基出現(xiàn)在肽中的正確位置并且在1、3和/或7位沒有負(fù)殘基。
“超基序”是2種或多種HLA等位基因編碼的HLA分子共有一種肽結(jié)合特異性。帶有超基序的抗原表位可被2種或多種HLA抗原以高或中等親和力(如本文所述)優(yōu)選識(shí)別。
“HLA超型或家族”，如本文所用，指以共有肽結(jié)合特異性為基礎(chǔ)分組的幾套HLA分子。對(duì)帶有某些氨基酸基序的肽共有一些相似結(jié)合親和力的HLA I型分子可分組為HLA超型。術(shù)語HLA超家族、HLA超型家族和HLA xx-類超型分子(xx指一具體HLA型)是同義詞。
短語“分離的”或“生物學(xué)純化”指充分或基本上沒有天然狀態(tài)下所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨成分的物質(zhì)。因此，本發(fā)明的肽不含有通常在原來環(huán)境中相伴隨的物質(zhì)，如抗原呈遞細(xì)胞上的MHC I分子。即使蛋白分離到同質(zhì)性或優(yōu)勢(shì)條帶，仍有5-10％天然蛋白的痕量污染物與所需蛋白共純化。本發(fā)明的分離肽不含有這種內(nèi)源性共純化蛋白。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1.HLA-A*0201的2位和C末端的精細(xì)特異性。顯示2位(a)或C末端(b)特殊殘基優(yōu)先作為攜帶以500nM或更高IC50結(jié)合A*0201的特殊殘基的肽百分比的函數(shù)。在2位(a)或C末端(b)攜帶特殊殘基的肽的ARB值如本文所述計(jì)算，相對(duì)于具有最高結(jié)合能力的殘基進(jìn)行指數(shù)化。2位L肽的平均(幾何)結(jié)合能力為1991nM。C末端V肽的平均(幾何)結(jié)合能力為2133nM。此分析中包括的肽有至少1個(gè)耐受的錨定殘基，如文中所述，在2位或C末端。
圖2.A*0201基序圖。8-聚(b)、10-聚(c)和11-聚(d)肽的A*0201基序概要圖。在次要錨定位置，所示優(yōu)選(或有害)殘基以至少3倍于(或小于3倍)同一位置帶其它殘基的相同大小肽的平均結(jié)合能力相結(jié)合。在主要錨定位置，優(yōu)選殘基是以同一位置最佳殘基10倍以內(nèi)的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。耐受的主要錨定殘基是以同一位置最佳殘基的10到100倍之間的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。
圖3.HLA-A2-超型分子的2位精細(xì)特異性。如文中所述計(jì)算了每種A2-超型分子的2位攜帶特殊殘基的肽的ARB值，相對(duì)每個(gè)特殊分子具有最高ARB的殘基進(jìn)行指數(shù)化。攜帶具有最高ARB殘基的肽的平均(幾何)結(jié)合能力對(duì)A*0202，A*0206和A*6802分別為55，59，89和41nM。
圖4.HLA-A2-超型分子C末端的精細(xì)特異性。如文中所述計(jì)劃處了每種A2-超型分子的C末端攜帶特殊殘基的肽的ARB值。相對(duì)每個(gè)特殊分子具有最高ARB的殘基進(jìn)行指數(shù)化。攜帶具有最高ARB殘基的肽的平均(幾何)結(jié)合能力對(duì)A*0202，A*0203，A*0206和A*6802分別為291，48，250和553nM。
圖5.A*0202基序圖。9-聚(a)、10-聚(b)肽的A*0202基序概要圖。在次級(jí)錨定位置，所示優(yōu)選(或有害)殘基以至少3倍于(或小于3倍)同一位置帶其它殘基的相同大小肽的平均結(jié)合能力相結(jié)合。在主要錨定位置，優(yōu)選殘基是以同一位置最佳殘基10倍以內(nèi)的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。耐受的主要錨定殘基是以同一位置最佳殘基的10到100倍之間的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。
圖6.A*0203基序圖。9-聚(a)、10-聚(b)肽的A*0203基序概要圖。在次要錨定位置，所示優(yōu)選(或有害)殘基以至少3倍于(或小于3倍)同一位置帶其它殘基的相同大小肽的平均結(jié)合能力相結(jié)合。在主要錨定位置，優(yōu)選殘基是以同一位置最佳殘基10倍以內(nèi)的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。耐受的主要錨定殘基是以同一位置最佳殘基的10到100倍之間的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。
圖7.A*0206基序圖。9-聚(a)、10-聚(b)肽的A*0206基序概要圖。在次要錨定位置，所示優(yōu)選(或有害)殘基以至少3倍于(或小于3倍)同一位置帶其它殘基的相同大小肽的平均結(jié)合能力相結(jié)合。在主要錨定位置，優(yōu)選殘基是以同一位置最佳殘基10倍以內(nèi)的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。耐受的主要錨定殘基是以同一位置最佳殘基的10到100倍之間的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。
圖8.A*6802基序圖。9-聚(a)、10-聚(b)肽的A*6802基序概要圖。在次要錨定位置，所示優(yōu)選(或有害)殘基以至少3倍于(或小于3倍)同一位置帶其它殘基的相同大小肽的平均結(jié)合能力相結(jié)合。在主要錨定位置，優(yōu)選殘基是以同一位置最佳殘基10倍內(nèi)平均結(jié)合能力相結(jié)合。耐受的主要錨定殘基是以同一位置最佳殘基的10到100倍之間的平均結(jié)合能力相結(jié)合的殘基。
圖9.次要和主要錨定對(duì)9-(a)和10-聚(b)肽的A2-超型結(jié)合能力影響的A2超基序共有序列小結(jié)。所示殘基顯著影響了對(duì)3種或多種A2-超型分子的結(jié)合。受影響分子的數(shù)量在括號(hào)中列出。在次要錨定位置，僅在對(duì)1種以上分子沒有有害影響時(shí)認(rèn)為該殘基是優(yōu)選的。對(duì)1種分子有害的優(yōu)選殘基用簡(jiǎn)化字體和下劃線表示。對(duì)主要錨定位置的評(píng)估根據(jù)單個(gè)替換和肽文庫分析，如文中所討論的那樣。
較佳實(shí)施方案的說明本發(fā)明涉及部分基于抗原表位的疫苗設(shè)計(jì)方法。這種方法的基礎(chǔ)是已明確確定的以下發(fā)現(xiàn)，即發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)CTL免疫應(yīng)答的機(jī)制包括作為與展示在抗原呈遞細(xì)胞上的HLA分子相結(jié)合的約8-11氨基酸的肽，來呈遞CTL抗原表位的步驟HLA分子是MHC I類產(chǎn)物，其中此產(chǎn)物在大部分有核細(xì)胞上表達(dá)。
MHC I類等位基因的產(chǎn)物一般按特征分為A、B和C HLA分子。每種分類中，人群中有多種等位基因變種；確實(shí)，相信有遠(yuǎn)超過500種I型和II型等位基因。由于不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答除非待免疫個(gè)體的細(xì)胞表面含有I型HLA分子呈遞的抗原表位，重要的是該抗原表位是能夠結(jié)合此個(gè)體表達(dá)的HLA的表位。
因此，設(shè)計(jì)有效疫苗的出發(fā)點(diǎn)是保證該疫苗于產(chǎn)生能有效呈遞的大量抗原表位。也許有可能給予代表抗原表位本身的肽。這種給予依賴于對(duì)象細(xì)胞上顯示存在“空”的HLA分子。在使用免疫原性肽本身的一種方法中，將這些肽與待處理對(duì)象的抗原呈遞細(xì)胞活體外一起培育，然后將細(xì)胞回輸給該對(duì)象。
另錢，8-11個(gè)氨基酸肽可通過給予含有編碼它的核苷酸序列的核酸在原位產(chǎn)生。提供這種核酸分子的方法在WO 99/58658中有描述，其內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)中。此外，免疫原性肽可作為較大肽分子的一部分給予被切割后釋放出所需的肽。較大肽可包括外來氨基酸，通常越少越好。因此，含這種氨基酸的肽一般為25個(gè)氨基酸或更少，更常見的是20個(gè)氨基酸或更少和15個(gè)氨基酸或更少。前體也可是含有多個(gè)不同或相同CTL抗原表位的異聚物或均聚物。當(dāng)然，也可采用能產(chǎn)生多種多樣免疫原性肽的肽和核酸的混合物。肽疫苗、核酸分子或者異-或均聚物的設(shè)計(jì)取決于包含的所需抗原表位。本發(fā)明提供了鑒定在整個(gè)A2超型特征性個(gè)體范圍寬闊人群中有效的相關(guān)抗原表位的范例。以下幾頁描述了鑒定A2超基序?qū)嶒?yàn)的方法和結(jié)果。
優(yōu)選此種肽包含能結(jié)合HLA-A2超型等位基因的抗原表位。這些基序可用于確定任何所需抗原中的T細(xì)胞表位，尤其是那些與人類病毒疾病、癌癥或自身免疫性疾病相關(guān)的表位，其潛在抗原或自身抗原靶標(biāo)的氨基酸順序是已知的。
一些潛在靶蛋白質(zhì)上的抗原表位可根據(jù)HLA結(jié)合基序鑒定。合適抗原的例子包括前列腺特異性抗原(PSA)，乙型肝炎核心和表面抗原(HBVc，HBVs)丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人免疫缺陷病毒(HIV)抗原，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，p53，CEA，錐蟲表面抗原(TSA)和Her2/neu。
可合成包含來自這些抗原的肽然后在試驗(yàn)中測(cè)試它們結(jié)合相應(yīng)MHC分子的能力，例如，該試驗(yàn)采用純化的I型分子和放射性碘化的肽和/或表達(dá)空I型分子的細(xì)胞，采用例如免疫熒光染色和流式顯微熒光儀，肽-依賴I型分子裝配的試驗(yàn)和抑制肽競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別CTL。能結(jié)合I型分子的肽可進(jìn)一步評(píng)估它們作為受感染或免疫接種個(gè)體的CTL的靶標(biāo)的能力，以及它們?cè)隗w外或體內(nèi)誘導(dǎo)初次CTL應(yīng)答的能力，CTL應(yīng)答產(chǎn)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞群能與病毒感染靶細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞反應(yīng)作為潛在治療劑。
MHC I類抗原由HLA-A、B和c基因座編碼。HLA-A和B抗原在細(xì)胞表面以大約相同的密度表達(dá)，而HLA-C表達(dá)低得多(也許低10倍之多)。每個(gè)基因座有許多等位基因。本發(fā)明的肽結(jié)合基序?qū)γ總€(gè)等位基因亞型有相對(duì)特異性。
對(duì)于肽疫苗，這種肽宜包含人群中廣泛分布的MHC I類分子所識(shí)別的基序，或包含遺傳多樣性人群所識(shí)別的基序。由于MHC等位基因在不同的民族和種族中以不同頻率出現(xiàn)，目標(biāo)MHC等位基因的選擇也許依賴于目標(biāo)人群。表1列出不同種族中在HLA-a基因座產(chǎn)物上不同等位基因的頻率。例如，絕大部分高加索人群可由能結(jié)合4種HLA-A等位基因亞型的肽所覆蓋，即HLA-A2.1，A1，A3.2和A24.1。類似地，絕大部分亞洲人群可通過加入能結(jié)合第五種等位基因HLA-A11.2的肽來包含。
表1

此表匯編自B.Dupont，Immunobiology of HLA，Vol.I，組織相容性試驗(yàn)，1987，Springer-Verlag，紐約1989。
*N＝黑人；A＝亞洲人；C＝高加索人。括號(hào)中數(shù)字表示分析中個(gè)體的數(shù)目。
可能發(fā)生HLA-A2.1基序攜帶肽與其它HLA-A2等位基因-特異分子的交叉反應(yīng)性結(jié)合。認(rèn)為享有與HLA-A2.1結(jié)合特異性的那些等位基因-特異性分子包含有HLA-A2.1超型。A2超型HLA分子的B袋特征為包含殘基F/Y9、A24、M45、E/N63、K/N66、V67、H/Q70和Y/C99的共有序列基序(此命名采用單字母氨基酸碼，其中下標(biāo)表示肽位置)。類似地，A2超型F袋特征為包含殘基D77、T80、L81和Y116(155)的共有序列基序。約66％結(jié)合A*0201的肽在3種或多種A2超型等位基因中有交叉反應(yīng)。
A2超型如本文定義的那樣與活細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)(del Guercio，M.-F.等，J.Immuno.154685，1995)的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)(Fruci，D等，Hum.Immunol.38187，1993)和結(jié)合于HLA-A2等位基因-特異分子的天然加工肽測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)(Sudo，T.等，J.Immuno.1554749，1995)相一致。因此HLA分子家族(即結(jié)合這些肽的HLA-A2超型)包括至少9種HLA-A蛋白A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802和A*6901。
如本文所述，HLA-A2超基序包括肽配體和L、I、V、M、A、T或Q作為抗原表位2位的主要錨定殘基及L、I、V、M、A或T作為C末端的主要錨定殘基。與本發(fā)明權(quán)利要求最為相關(guān)的HLA-A2基序包含2位的V、A、T或Q和C末端錨定位置的L、I、V、M、A或T。含有1個(gè)HLA-A2超基序的肽抗原表位可結(jié)合1個(gè)以上的HLA-A2超型分子。
可用于鑒定本發(fā)明的肽的程序已公開在Falk等，Nature 351290(1991)中，納入本文參考文獻(xiàn)中。簡(jiǎn)單來說，此方法包括大規(guī)模分離MHC I類分子，通常采用免疫沉淀或親和層析，從適當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞系中分離。本領(lǐng)域熟知的分離所需MHC分子的其他方法的例子包括離子交換層析、凝集素層析、大小排阻、高效配基層析和上述技術(shù)的組合。
在一典型例子中，使用免疫沉淀分離所需等位基因。一些操作可使用，取決于所用抗體的特異性。例如，等位基因-特異性mAb試劑可用于HLA-A、HLA-B和HLA-c分子的親和純化?？色@得用于分離HLA-A分子的幾種mAb試劑。單克隆BB7.2適于分離HLA-A2分子。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用這些mAb制備的親和柱已成功地用于分別純化HLA-A等位基因產(chǎn)物。
除了等位基因-特異性mAbs，廣泛反應(yīng)性的抗-HLA-A、B和C mAbs，如W6/32B9.12.1和B1.23.2，可用于如下面實(shí)施例部分描述的另一種親和純化方案。
與分離的MHC分子的肽結(jié)合溝相結(jié)合的肽通常用酸處理洗脫。也可通過各種標(biāo)準(zhǔn)變化方法將肽從I型分子上解離下來，如加熱、PH、洗滌劑、鹽、離液劑或它們的組合。
將肽片斷進(jìn)一步用反相高效液相色譜(HPLC)從MHC分子中分離出來并測(cè)序。可用許多其它本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離肽，包括過濾、超濾、電泳、大小層析、特異性擠體沉淀離子交換層析、等電聚焦等方法。
測(cè)序分離的肽可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如埃德曼降解(Hunkapiller，M.W.等，MethodsEnzymol.91，399 )進(jìn)行。其它適于測(cè)序的方法包括質(zhì)譜測(cè)序前面描述的各個(gè)肽(Hunt等，Science 2251261(1992)，納入本文參考文獻(xiàn)中)。來自不同I型分子的大批異質(zhì)性肽(如合并的HPLC組分)的氨基酸測(cè)序通?？山沂久糠NI類等位基因的特征性序列基序。
明確了不同的I型等位基因的特異性基序使得能鑒定氨基酸序列已知的抗原蛋白質(zhì)的潛在的肽表位。一般，鑒定潛在的肽表位是用電腦掃描所需抗原的氨基酸序列中基序的存在。
鑒定攜帶基序的表位后，隨之合成諸表位基序。結(jié)合MHCI型分子的能力可用許多不同方法測(cè)量。一種方法是如相關(guān)申請(qǐng)中描述的I型分子結(jié)合試驗(yàn)，在下面敘述。其它文獻(xiàn)中描述的方法包括抑制抗原呈遞(Sette等，J.Immunol.1413893(1991)，體外裝配試驗(yàn)(Townsend等，Cell 62285(1990)和使用突變細(xì)胞的基于FACS的試驗(yàn)，如RMA.S(Melief等，Eur.J.Immunol，212963(1991))。
如本文所述，較高的HLA結(jié)合親和力與較強(qiáng)的免疫原性相關(guān)連。較強(qiáng)的免疫原性可以幾種不同方式表現(xiàn)。免疫原性可能與是否引起免疫應(yīng)答，具體應(yīng)答反應(yīng)的力度以及產(chǎn)生應(yīng)答的多種多樣人群的范圍相一致。例如，一種肽可能在多個(gè)系列的人群中引起免疫應(yīng)答，但不產(chǎn)生強(qiáng)有力的應(yīng)答。根據(jù)本文所述的原則，已發(fā)現(xiàn)接近90％的高結(jié)合性肽是免疫原性肽，與中等親和力結(jié)合的肽的大約50％形成對(duì)照。此外，較高結(jié)合親和力的肽產(chǎn)生更強(qiáng)有力的免疫原性應(yīng)答。結(jié)果，如果采用高親和力結(jié)合肽，誘導(dǎo)類似生物效果所需肽時(shí)就較少。因此，本發(fā)明的較佳實(shí)施方案中，高親和力結(jié)合表位特別有用。然而，采用中等或高結(jié)合肽已取得了超過先前技術(shù)的很大改進(jìn)。
本發(fā)明在本領(lǐng)域首次確定了HLA I型分子結(jié)合親和力和互不關(guān)聯(lián)的肽表位的免疫原性之間的關(guān)系。在這些提到的互不關(guān)聯(lián)的肽的實(shí)驗(yàn)中，要指出的是即使采用更長(zhǎng)的片斷，體內(nèi)肽的細(xì)胞加工會(huì)產(chǎn)生這類肽。因此，包含1個(gè)或多個(gè)抗原表位的更長(zhǎng)肽在本發(fā)明范圍內(nèi)。結(jié)合親和力和免疫原性之間的關(guān)系可通過兩種不同實(shí)驗(yàn)方法分析(Sette等，J.Immunol，1535586-5592，1994)。在第一種方法中，對(duì)HLA結(jié)合親和力范圍超過10,000倍幅度的潛在表位的免疫原性在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠中作了分析。在第二種方法中，對(duì)所有攜帶A*0201結(jié)合基序的大約100個(gè)不同乙型肝炎病毒(HBV)衍生的潛在表位的抗原性，采用急性肝炎病人的PBL(外周血淋巴細(xì)胞)作了評(píng)估。依照這些方法，確定了大約500nM(50nM或更小較佳)的親和力閾值與肽表位誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力相關(guān)。這些數(shù)據(jù)對(duì)天然加工的肽和合成的T細(xì)胞表位的I型結(jié)合親和力測(cè)定是真實(shí)的。這些數(shù)據(jù)也表明在形成T細(xì)胞應(yīng)答中決定基選擇的重要作用(見，如Schaeffer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA864649-4653，1989)。
因此，CTL-誘導(dǎo)肽宜包括IC50為500nM或更小的I型HLA分子。就腫瘤相關(guān)抗原的攜帶基序肽表位而言，已顯示200nM結(jié)合親和力閾值與產(chǎn)生的CTL細(xì)胞群對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷相關(guān)。
在一較佳實(shí)施方案中，評(píng)估HLA-A2等位基因-特異性分子的結(jié)合能力后，對(duì)表現(xiàn)出高或中等親和力的肽考慮作進(jìn)一步分析?？稍谠摮图易宓钠渌蓡T上測(cè)試所選出的肽。在較佳實(shí)施方案中，將表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性結(jié)合的肽用于疫苗或細(xì)胞篩選分析。
例如，對(duì)在HLA-A2結(jié)合試驗(yàn)中檢驗(yàn)陽性的肽，即結(jié)合親和力值為500nM或更小的肽，測(cè)試了這些肽體外誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答的能力。例如可檢驗(yàn)與肽一起培育的抗原呈遞細(xì)胞在應(yīng)答細(xì)胞群體中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力?？乖蔬f細(xì)胞可以是正常細(xì)胞如外周血單個(gè)核細(xì)胞或樹突細(xì)胞(Inaba等，J.Exp.Med.166182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol.18219 )。
另外方便地利用了內(nèi)部加工肽負(fù)載I型分子能力有缺陷的突變哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如小鼠細(xì)胞系RMA-S(Karre等，Nature，319675(1986)；Ljunggren等，Eur.J.Immunol.212963-2970(1991))，和人的體細(xì)胞性T細(xì)胞雜交株，T-2(Cerundolo等，Nature，345449-452(1990)及用轉(zhuǎn)染了編碼人I型分子的合適基因的細(xì)胞，當(dāng)肽從外部加入時(shí)，測(cè)試該肽在體外誘導(dǎo)初次CTL應(yīng)答的能力。其它可用的真核細(xì)胞系包括各種昆蟲細(xì)胞系如蚊子幼蟲(ATCC細(xì)胞系CCL 125，126，1660，1591，6585，6586)，桑蠶(ATTC CRL 8851)，粘蟲(ATTC CRL 1711)，蛾(ATTC CCL 80)和果蠅細(xì)胞系如施奈德細(xì)胞系(見Schneider J.Embryol.Exp.Morphol.27353-365 )。
在正常獻(xiàn)血員或病人靜脈穿刺或leukapheresis后方便地分離得到外周血淋巴細(xì)胞作為CTL前體細(xì)胞的應(yīng)答細(xì)胞源使用。在一實(shí)施方案中，將合適的抗原呈遞細(xì)胞與10-100μM肽在無血清培養(yǎng)基中適當(dāng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4小時(shí)。將肽-負(fù)載抗原呈遞細(xì)胞隨后與應(yīng)答細(xì)胞群在體外最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7到10天。陽性CTL活化可通過測(cè)試培養(yǎng)物中是否存在能殺傷放射性標(biāo)記靶細(xì)胞，包括特異性肽-脈沖的靶細(xì)胞和表達(dá)產(chǎn)生該肽序列的有關(guān)病毒或腫瘤抗原內(nèi)源加工形式的靶細(xì)胞的CTL。
CTL特異性和MHC限制通過測(cè)試對(duì)表達(dá)適當(dāng)或不適當(dāng)?shù)娜薓HC I類分子的不同肽靶細(xì)胞的殺傷來確定。在MHC結(jié)合試驗(yàn)中檢驗(yàn)陽性并引起特異性CTL應(yīng)答的肽本文稱為免疫原性肽。
Kast等(J.Immunol.1523904-3912，1994)證明攜帶基序的肽占能結(jié)合等位基因-特異性HLA I型分子的表位的90％。在此項(xiàng)研究中，所有可能的9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且有8個(gè)氨基酸重疊的肽(240肽)，覆蓋了16型人乳頭瘤病毒E6和E7蛋白質(zhì)的全部序列，測(cè)試了它們結(jié)合在不同民族中高頻率表達(dá)的5種等位基因-特異性HLAI型分子的能力。這一套無偏倚的肽可評(píng)估HLA I型基序的預(yù)測(cè)值。從一套240種肽中，鑒定出22種肽以高或中等親和力結(jié)合等位基因-特異性HLA分子。在這22種肽中，20種(也就是91％)是攜帶基序肽。因此，此研究證明這些基序在鑒定疫苗中包含的肽表位時(shí)的價(jià)值應(yīng)用以基序?yàn)榛A(chǔ)的鑒定技術(shù)消除了90％潛在表位的篩選工作量?？傻玫降碾牡牧亢秃Y選過程的復(fù)雜性使綜合評(píng)估抗原很困難，如果不用這些基序就不可能。
本發(fā)明的免疫原性肽表位可包括在多表位疫苗組合物中，此疫苗組合物含有相同抗原的其它肽表位、相同來源的抗原和/或來自不同來源的抗原。此外，II型抗原表位可和I型抗原表位一起包含在疫苗中。同一抗原的肽表位也許是順序相毗連的毗鄰抗原表位或可獲自該蛋白質(zhì)的不同區(qū)域。
如下面更詳細(xì)描述的，免疫原性肽可合成制備，如用化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)或分離自天然來源如全病毒或腫瘤。雖然肽宜基本上沒有其它天然產(chǎn)生的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片斷，但在一些實(shí)施方案中肽可以合成偶聯(lián)于天然片斷或顆粒。
多肽或肽可以有不同長(zhǎng)度，以中性(無電荷)形式或者鹽形式，沒有修飾如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化或者含有這些修飾，所處條件下的修飾不會(huì)破壞本文所述的多肽的生物活性。
當(dāng)需要基本維持長(zhǎng)肽的所有生物活性時(shí)，肽盡可能小為好?？赡艿脑?，本發(fā)明的最優(yōu)化肽表位長(zhǎng)度9或10個(gè)氨基酸殘基為理想，此大小與結(jié)合于細(xì)胞表面MHCI類分子的內(nèi)源加工的病毒肽或腫瘤細(xì)胞肽相當(dāng)。
具有所需活性的肽可進(jìn)行必要修飾以提供某些所需屬性，如提高的藥理特性，同時(shí)提高或至少基本保持未修飾肽結(jié)合所需MHC分子和活化適當(dāng)T細(xì)胞的所有生物活性。例如，可使肽經(jīng)歷各種變化，如置換，保守或非保守性置換，這些變化在它們的使用中可提供某些優(yōu)點(diǎn)，如提高的MHC結(jié)合。保守性置換意味用另一生物學(xué)和/或化學(xué)性質(zhì)類似的氨基酸殘基替換一氨基酸殘基，如一疏水殘基替換另一疏水殘基，或一極性殘基替換另一極性殘基。置換包括組合如Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。單一氨基酸置換的效果可用D-氨基酸探測(cè)。這些修飾可采用熟知的肽合成程序進(jìn)行，如在Merrifield，Science 232341-347(1986)，Branny和Merrifield，肽，Gross和Meienhofer，編.(紐約，學(xué)術(shù)出版社)，pp.1-284(1979)；Stewart和Young，固相肽合成(Rockford，I11.，Pierce)，第二版(1984)有描述。
此種肽也可通過延伸或縮短化合物的氨基酸序列進(jìn)行修飾，如加入或去除氨基酸。本發(fā)明的肽或類似物也可能通過改變某些殘基的順序或組成進(jìn)行修飾，不難理解對(duì)生物活性必需的某些氨基酸殘基，如位于關(guān)鍵接觸位置的或保守性殘基，通常不作改變以避免對(duì)生物活性產(chǎn)生不良作用。非關(guān)鍵氨基酸不限于那些在蛋白中天然產(chǎn)生的如L-α-氨基酸，但可包括非天然氨基酸如β-γ-δ-氨基酸以及許多L-α-氨基酸的衍生物如天然氨基酸的D-異構(gòu)體。
通常，采用一系列單個(gè)氨基酸替換的肽來確定靜電電荷、疏水性等對(duì)結(jié)合的作用。例如，沿肽長(zhǎng)度的一系列正電荷(如Lys或Arg)或負(fù)電荷(如Glu)氨基酸替換顯示對(duì)各種MHC分子和T細(xì)胞受體的敏感性的不同模式。另外，可采用小的相對(duì)中性分子如Ala、Gly、Pro或類似殘基的多處替換。這種置換可產(chǎn)生均寡聚物或異寡聚物的多表位肽。替換或加入的殘基數(shù)量和類型取決于基本接觸點(diǎn)和追求某些功能屬性之間必要的距離(如疏水性對(duì)親水性)。與親代肽的親和力相比，對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的提高的結(jié)合親和力也可通過置換而實(shí)現(xiàn)。在任何情況下，這些置換一般采用經(jīng)過挑選的氨基酸殘基或其它分子片斷，以避免可能破壞此種結(jié)合的空間和電荷干擾。
氨基酸替換通常是單個(gè)殘基。替換、缺失、插入或它們?nèi)我唤M合可聯(lián)用以得到最后的肽。替換性變體是其中肽的至少一個(gè)殘基被去除并在其位置插入一個(gè)不同殘基的變化。這些替換當(dāng)需要精細(xì)調(diào)節(jié)肽的特性時(shí)，一般依照下表2實(shí)施。
表2原先的殘基示范性替換Ala SerArg Lys，HisAsn GlnAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Lys；ArgIle Leu；ValLeu Ile；ValLys Arg；HisMet Leu；IlePhe Tyr；TrpSer ThrThr SerTrp Tyr；PheTyr Trp；PheVal Ile；Leu比表2所列保守性差的選擇替換使功能(如對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的親和力)大為改變，即選擇的殘基在其維持(a)替換區(qū)域肽主鏈的結(jié)構(gòu)，如片層或螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位置的電荷或疏水性或(c)側(cè)鏈大小上的作用差別很大。通常預(yù)期在肽特性上產(chǎn)生最大變化的替換是其中的(a)親水性殘基，如絲氨酰替換(或被替換)為疏水性殘基如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙酰、纈氨?；虮滨?；(b)具有陽電荷側(cè)鏈的殘基如谷氨?；蛱於滨＃换?c)具有大側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸替換(或被替換)為沒有側(cè)鏈的殘基如甘氨酸。
此種肽也可包括免疫原隆肽中2個(gè)或多個(gè)殘基的等排物。本文定義的等排物是可替換為第二個(gè)序列的2個(gè)或多個(gè)殘基的序列因?yàn)榈谝粋€(gè)序列的空間構(gòu)象適合第二個(gè)序列的特異性結(jié)合位點(diǎn)。此術(shù)語特別包括本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的肽主鏈修飾。這些修飾包括氨基氮、α-碳、氨基羰基的修飾、酰胺鍵的完全替換、延伸、缺失或主鏈交聯(lián)。一般見Spatola，Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides and Proteins，Vol III(Weinstein ed.，1983)。
具有各種氨基酸擬似物或非天然氨基酸修飾的肽對(duì)提高肽的體內(nèi)穩(wěn)定性特別有用。穩(wěn)定性可用許多方法測(cè)試。例如，已用肽酶和各種生物培養(yǎng)基如人血漿和血清測(cè)試了穩(wěn)定性。參見Verhoef等，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokin.11291-302(1986)。本發(fā)明肽的半衰期可用25％人血清(v/v)試驗(yàn)方便地測(cè)定。操作一般如下。特合并的人血清(AB型，非加熱無活)在使用前用離心法脫去脂質(zhì)。該血清隨后用PRMI組織培養(yǎng)液稀釋至25％用于測(cè)試肽的穩(wěn)定性。在預(yù)定時(shí)間間隔中，取出少量反應(yīng)溶液加入6％含水三氯乙酸或乙醇中。將不透明的反應(yīng)樣品冷卻(4℃)15分鐘隨后離心沉降已沉淀的血清蛋白質(zhì)。然后采用穩(wěn)定性-特異性層析條件作反相HPLC確定此肽的存在。
可修飾本發(fā)明的肽或具有CTL刺激活性的類似物以提供除提高的血清半衰期外其他所需屬性。例如，此肽誘導(dǎo)CTL活性的能力可通過聯(lián)接含有至少一個(gè)能誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞應(yīng)答的表位序列而增強(qiáng)。
在一些實(shí)施方案中，此T輔助肽是大部分人群T輔助細(xì)胞所能識(shí)別的肽。這可通過選擇能結(jié)合許多、大多數(shù)或所有MHC II類分子的氨基酸序列來實(shí)現(xiàn)。這些序列稱為“疏松的MHC-限制性”T輔助序列。疏松的MHC-限制性氨基酸序列的例子包括來自抗原的序列如破傷風(fēng)毒素830-843位(QYIKANSKFIGITE)、惡性瘧原蟲環(huán)孢子(CS)蛋白378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)和鏈球菌18kD蛋白1-16位(YGAVDSILGGVATYGAA)序列。
另外，可能以疏松的MHC-限制性方式采用自然界中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列制備能刺激T輔助淋巴細(xì)胞的合成肽。這些合成化合物稱為泛-DR-結(jié)合表位或PADRETM分子(Epimmune，圣迭哥，加州)，可根據(jù)它們對(duì)大部分HLA-DR(人MHC II類)分子的結(jié)合活性進(jìn)行設(shè)計(jì)(如見美國(guó)專利號(hào)5,736,142)。
將特別優(yōu)選的免疫原性肽/T輔助表位偶聯(lián)物以一間隔分子相連。此間隔乳通常含有較小的中性分子如在生理?xiàng)l件下基本上不帶電荷的氨基酸或氨基酸擬似物。此間隔分子一般選自如Ala、Gly或其它非極性氨基酸或中性氨基酸的中性間隔物。應(yīng)理解這種任選的間隔物不需包含相同的殘基因此可以是異質(zhì)或同質(zhì)寡聚物。當(dāng)存在時(shí)，此間隔物通常至少為1或2個(gè)殘基，更多的是3到6個(gè)殘基?；蛘撸珻TL肽可不用間隔與T輔助肽相連。
免疫原性肽可直接或通過一間隔，在CTL肽的氨基或羧基末端與T輔助肽相連。免疫原性肽或T輔助肽的氨基末端可以?；?。示范性T輔助肽包括破傷風(fēng)類毒素830-843、流感307-319、瘧原蟲環(huán)孢子蛋白382-398和378-389。
在一些實(shí)施方案中，可能需要本發(fā)明的藥物組合物至少包含一種誘發(fā)CTL的成分。業(yè)已鑒定到脂質(zhì)可作為能誘發(fā)體內(nèi)抗病毒抗原CTL的制劑。例如，可將棕櫚酸殘基連接于賴氨酸殘基的α和ε氨基并隨后通過一個(gè)或多個(gè)連接殘基如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等與免疫原性肽聯(lián)接。該脂化肽可隨后直接以膠束形式、摻入到脂質(zhì)體中或以佐劑，如不完全弗氏佐劑乳化面注射。在一較好實(shí)施方案中，特別有效的免疫原包括與賴氨酸的α和ε氨基相連的棕櫚酸，通過接頭如Ser-Ser連接于免疫原性肽的氨基末端。
誘發(fā)CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一例子，大腸桿菌脂蛋白如三棕櫚酰-S-甘油半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)當(dāng)與適當(dāng)肽共價(jià)相連時(shí)可用于誘發(fā)病毒特異性CTL。見Deres等，Nature 342561-564(1989)。本發(fā)明的肽可與P3CSS偶連，例如給予個(gè)體此脂肽以特異引起對(duì)靶抗原的CTL應(yīng)答。此外，誘導(dǎo)中和性抗體也可用與顯示有適當(dāng)表位的肽相偶聯(lián)的P3CSS來誘發(fā)，這兩個(gè)組合物可組合以更有效誘導(dǎo)對(duì)感染的體液和細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答反應(yīng)。
此外，可將其他的氨基酸加到肽末端以提供肽之間的連接，偶連于一載體支持物或更大的肽，修飾此肽或寡肽的物理或化學(xué)性質(zhì)等等?？蓪被崛缋野彼?、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等引入此肽或寡肽的C或N末端。在一些例子中C末端的修飾可能改變此肽的結(jié)合特性。另外，此肽或寡肽的序列，可通過末端-NH2?；缤轷；?C1-C20)或2-硫基乙醇乙酰化，末端羧基酰胺化如氨水、甲胺等修改而與天然序列不同。在一些情況中，這些修飾可提供連接載體或其它分子的位點(diǎn)。
本發(fā)明的肽可用許多方法制備。由于它們大小較短，此種肽(互不相關(guān)表位或多表位肽)可在溶液中或固體載體上按常規(guī)技術(shù)合成。各種自動(dòng)化合成儀可購買到并按已知操作方案使用。參見Stewart和Young，固相肽合成，第二版.，PierceChemical Co.(1984)，同上。
另外，本發(fā)明肽的制備可包括使用重組DNA技術(shù)，其中將編碼感興趣的免疫原性肽的核苷酸序列插入到一表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到適當(dāng)宿主細(xì)胞中并在適合于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些程序一般為本領(lǐng)域所知，其一般描述見Sambook等，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，冷泉港出版社，紐約(1982)，納入本文參考文獻(xiàn)中。因此，可采用包含本發(fā)明1個(gè)或多個(gè)肽序列的融合蛋白來呈遞適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞表位。
由于本文預(yù)期長(zhǎng)度肽的編碼序列可用化學(xué)技術(shù)合成，例如用Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.1033185(1981)的磷酸三酯法合成，可簡(jiǎn)單地通過用適當(dāng)?shù)膲A基替換那些編碼天然肽序列的堿基來進(jìn)行修飾，然后提供合適的接頭將編碼序列與本領(lǐng)域通?？傻玫降谋磉_(dá)載體相連，用此載體轉(zhuǎn)化合適宿主以產(chǎn)生所需的融合蛋白。一些這類載體和合適的宿主系統(tǒng)現(xiàn)在已可得到。為表達(dá)此融合蛋白，提供與編碼序列操作性連接的起始和終止密碼子、啟動(dòng)子和終止子區(qū)域以及通常的復(fù)制系統(tǒng)以準(zhǔn)備表達(dá)載體在理想的細(xì)胞宿主中表達(dá)。例如，與細(xì)菌宿主相容的啟動(dòng)子序列在含有插入所需編碼序列的方便的限制位點(diǎn)的質(zhì)粒中提供。將所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入合適的細(xì)菌宿主中。當(dāng)然，采用適當(dāng)載體和調(diào)控序列酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主也可使用。
本發(fā)明的肽和藥物及其疫苗組合物可用于對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人給藥，治療處理和/或預(yù)防感染和癌癥?？捎帽景l(fā)明免疫原性肽治療的疾病的例子包括前列腺癌，乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、腎癌、宮頸癌、淋巴瘤、CMV感染和condlylomaacuminatum。
就藥物組合物而言，本發(fā)明的免疫原性肽通常給予已患癌癥或感染了感興趣病毒的人。那些在潛伏期或感染急性期的病人可用此免疫原性肽或與其它治療方法(如果適當(dāng))聯(lián)合治療。在治療應(yīng)用中，病人使用的組合物的量足以誘導(dǎo)對(duì)感染的疾病因子或腫瘤抗原的有效CTL應(yīng)答并治痊或至少部分抑制癥狀和/或并發(fā)癥。達(dá)到這樣效果的適當(dāng)量定義為“治療有效劑量”或“單位劑量”。有效產(chǎn)生這樣作用的量取決于例如肽的組成、給藥方式、所治疾病的病期和嚴(yán)重性、病人體重和全身健康狀況、開藥醫(yī)師的判斷。一般人的首次免疫(治療或預(yù)防性給藥)劑量范圍70kg病人為約1.0μg到20,000μg肽，較佳為100μg、-150μg、-200μg、-250μg、-300μg、-400μg或-500μg-、20,000μg，接著以相同劑量范圍依照數(shù)周到數(shù)月的加強(qiáng)注射作加強(qiáng)免疫，取決于病人反應(yīng)和狀況可通過測(cè)量病人血液中特異性CTL活性而定。在使用重組核酸的實(shí)施方案中，滴定所給予的物質(zhì)以獲得適當(dāng)?shù)闹委煼磻?yīng)。必須記住的是本發(fā)明的肽和組合物通?？捎糜趪?yán)重的疾病狀態(tài)，即威脅生命或可能威脅生命的情形。在這些例子中，鑒于本發(fā)明組合物中的外源性物質(zhì)如相對(duì)無毒性的肽已最小化，使用大大過量的這些組合物是可能的且治療醫(yī)師可能覺得是需要的。
對(duì)于治療應(yīng)用，應(yīng)在急性感染時(shí)出現(xiàn)感染最初癥狀或檢測(cè)到或手術(shù)切除腫瘤或診斷后不久開始給藥。隨后給予加強(qiáng)劑量直到至少癥狀大為緩解并在這之后維持一段時(shí)間。在慢性感染時(shí)，也許需要加載劑量然后給予加強(qiáng)劑量。
用本發(fā)明組合物治療感染個(gè)體可能促進(jìn)解決急性感染個(gè)體的感染。對(duì)易感染(或易于)發(fā)展為慢性感染的個(gè)體，此組合物在防止急性感染變成慢性的方法中特別有用。當(dāng)易感染個(gè)體在感染前或感染中被確認(rèn)，例如本文所述，此組合物可針對(duì)他們，盡量減小對(duì)較大群的用藥需要。
此肽組合物也可用于治療慢性感染和刺激免疫系統(tǒng)以消除攜帶者中的病毒感染細(xì)胞。重要的是在配方中提供的免疫增效肽的量和服藥方式應(yīng)足以有效激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。因此，治療慢性感染，免疫劑量后也許需要在設(shè)定的間隔，如1至4周時(shí)作加強(qiáng)免疫，可能需延長(zhǎng)時(shí)間以有效免疫個(gè)體。在慢性感染的例子中，用藥必須連續(xù)直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室測(cè)試表明感染已消除或大大緩解并在之后持續(xù)一段時(shí)間。
用于治療的藥物組合物是腸胃外、局部、口服或區(qū)域用藥。本發(fā)明的肽可以編碼該肽的核酸形式使用。藥物組合物優(yōu)選腸胃外給藥，如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了腸胃外用藥的組合物，其包含免疫原性肽溶解或懸浮在可接受運(yùn)載體中的溶液，優(yōu)選含水運(yùn)載體。可使用各種含水運(yùn)載體如水、緩沖水、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可用常規(guī)的熟知的無菌技術(shù)滅菌或過濾滅菌。所得水溶液可包裝使用或凍干，此種凍干制備在使用前無菌液體組合。該組合物可含有接近生理?xiàng)l件所需的藥物學(xué)上可接受輔助物質(zhì)，如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨聚糖單十二酸酯(？)、油酸三乙醇胺鹽等。
本發(fā)明的CTL刺激肽濃度在藥物配方中可能變化很大，即重量從低于0.1％，常常在2％或至少約2％到20％至50％或更多，主要按流體體積、粘度等選擇，按所選的具體給藥方式而定。此肽組合物的人用單位劑量形式一般包括在藥物組合物中，該藥物組合物含有可接受運(yùn)載體的人用單位劑量，優(yōu)選含水運(yùn)載體，采用本領(lǐng)域技術(shù)人已知的流體體積給藥將此種組合物給予病人。
本發(fā)明的肽也可通過脂質(zhì)體給藥，脂質(zhì)體的作用是將此靶向具體的組織如淋巴組織或選擇性靶向感染細(xì)胞以及提高此肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫劑、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散劑、薄片層等。在這些制備物中摻入了待輸送的此肽作為脂質(zhì)體的一部分，單獨(dú)或與結(jié)合性分子如淋巴細(xì)胞中常見的受體一起，例如結(jié)合CD45抗原的單克隆抗體或與其它治療或免疫原性組合物一起給藥。因此，可將裝滿或帶有本發(fā)明的肽的脂質(zhì)體直接用于淋巴細(xì)胞部位，在那里脂質(zhì)體隨后遞送所選的治療/免疫原性肽組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可從自標(biāo)的運(yùn)載體形成脂質(zhì)，一般包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇如膽固醇制備。脂質(zhì)的選擇通常要考慮如脂質(zhì)體大小，酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血流中的穩(wěn)定性。已有許多方法用于制備脂質(zhì)體，參見如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國(guó)專利號(hào)4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369。
為了靶向免疫細(xì)胞，摻入脂質(zhì)體中的配體可能包括對(duì)所需免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇特異性的抗體或其片斷。含肽的脂質(zhì)體懸浮液可通過靜脈內(nèi)、區(qū)域、局部等給藥，劑量則根據(jù)特別是給藥方式、被遞送的肽、待治療疾病的病期而不同。
對(duì)于固體組合物，可采用常規(guī)的無毒性固體運(yùn)載體，包括例如藥物等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服，制備藥學(xué)上可接受的無毒組合物可通過加入常用的賦形劑，如前面列出的運(yùn)載體和一般為10-95％的活性成分，即本發(fā)明的一種或多種肽，濃度25％-75％較佳。
對(duì)于氣霧劑給藥，此免疫原性肽宜與表面活性劑和推進(jìn)劑一起以精細(xì)的分離形式提供。典型的肽百分比為0.01％-20％重量，1％-10％較佳。當(dāng)然，表面活性劑必須無毒且宜溶于推進(jìn)劑。這類試劑的代表是含6到22個(gè)碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如具有脂肪族多羥基醇或其環(huán)化酐的己酸、辛酸、十二烷酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸?；旌硝ト缁旌匣蛱烊桓视王タ墒褂?。表面活性劑可占該組合物0.1％-20％，占0.25-5％較佳。該組合物的其余部分是普通的推進(jìn)劑。運(yùn)載體也可包括，(如需要)用于鼻內(nèi)輸送的卵磷脂。
因此，本發(fā)明一個(gè)方面的內(nèi)容涉及包含如本文所述活性成分免疫原性肽的免疫有效量的疫苗。此肽也可以用編碼在接受者中表達(dá)的本發(fā)明肽的核酸形式給予?？蓪⒋穗呐c其自身運(yùn)載體相連接或作為活性肽單位的均聚物或異聚物引入宿主包括人中。此聚合物的優(yōu)點(diǎn)在于提高免疫學(xué)反應(yīng)并且當(dāng)使用不同的肽組成此聚合物時(shí)，加強(qiáng)了其誘導(dǎo)與病毒或腫瘤細(xì)胞不同抗原決定簇反應(yīng)的抗體和/或CTLs的能力。本領(lǐng)域熟知的有用運(yùn)載體包括如甲狀腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素、聚氨基酸如聚(賴氨酸谷氨酸)、流感、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重組疫苗等。此疫苗也可包含生理耐受性(可接受的)稀釋劑如水、磷酸緩沖鹽水或鹽水，更常包含佐劑。不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬等物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的佐劑。如上面提到的，CTL應(yīng)答可通過將本發(fā)明的肽與脂質(zhì)，如P3CSS偶聯(lián)而誘發(fā)。如本文所述，對(duì)于肽組合物的免疫接種，可通過注射、氣霧劑、口服、皮膚或其它途徑，宿主免疫系統(tǒng)對(duì)疫苗的應(yīng)答是產(chǎn)生大量針對(duì)所需抗原的特異性CTL細(xì)胞，因此宿主至少對(duì)后來的感染具有部分免疫力或?qū)Πl(fā)生慢性感染有抵抗力。
在一些例子中，需要將本發(fā)明的肽疫苗與能誘導(dǎo)對(duì)感興趣病毒的尤其是對(duì)病毒包膜抗原的中和抗體應(yīng)答的疫苗聯(lián)用。
出于治療或免疫接種目的，本發(fā)明的肽可以編碼一種或多種本發(fā)明肽的核酸形式給予。該核酸可編碼本發(fā)明的肽以及任選的一種或多種其它分子。常規(guī)上使用一些方法將核酸遞送給病人。例如，核酸可直接作為“裸露DNA”遞送。此方法在Wolff等，Science 2471465-1468(1990)和美國(guó)專利號(hào)5,580,859及5,589,466中有所描述。核酸也可使用彈道方法遞送，如在美國(guó)專利號(hào)5,204,253中所述。也可給予只包括DNA的顆粒。另外，DNA可粘附于顆粒如金顆粒上。
也可將核酸與陽離子化合物如陽離子脂質(zhì)復(fù)合后遞送。脂質(zhì)-介導(dǎo)的基因傳遞方法例如在WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino和Gould-Fogerite，Bio Techniques6(7)682-691(1988)；Rose美國(guó)專利號(hào)5,279,833；WO 91/06309；和Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7414(1987)中所述。
本發(fā)明的肽也可用減毒病毒宿主表達(dá)，如牛痘或鳥痘。此方法包括使用牛痘病毒作為表達(dá)編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列的載體。導(dǎo)入急性或慢性感染宿主或者非感染宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)該免疫原性肽，從而誘導(dǎo)宿主CTL應(yīng)答。在免疫方案中有用的牛痘載體和方法如在美國(guó)專利號(hào)4,722,848中所述。另一載體是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體如在Stover等，(Nature 351456-460(1991))中所述。許多其它對(duì)本發(fā)明肽的治療用藥或免疫接種有用的載體，如傷寒沙門菌載體等，通過本文描述本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)。
給予編碼本發(fā)明肽的核酸的一種較佳方法采用了編碼本發(fā)明多個(gè)表位微小基因構(gòu)建物任選地與其它分子一起給予。為了產(chǎn)生編碼所選CTL表位(微小基因)的DNA序列在人細(xì)胞中表達(dá)，須反向翻譯該表位的氨基酸序列。采用人密碼子使用表來指導(dǎo)每個(gè)氨基酸的密碼子選擇。將編碼這些表位的DNA序列直接毗連，產(chǎn)生編碼一連續(xù)多肽序列的分子。為了優(yōu)化表達(dá)和/或免疫原性，可將其他成分加入該小基因設(shè)計(jì)中。可被反向翻譯和包含在該微小基因序列中的氨基酸序列的例子包括輔助性T淋巴細(xì)胞表位、前導(dǎo)(信號(hào))序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。此外，CTL表位的MHC呈遞可通過包括將合成的(如聚丙氨酸)或天然產(chǎn)發(fā)的接序列毗鄰于CTL表位而得到促進(jìn)。
微小基因序可通過裝配編碼該微小基因的正鏈和負(fù)鏈的寡核苷酸而轉(zhuǎn)變成DNA。合成重疊的寡核苷酸(30-100堿基長(zhǎng))、磷酸化，純化并用熟知的技術(shù)在適當(dāng)條件下退火。這些寡核苷酸的兩末端用T4 DNA連接酶相連。編碼CTL表位多肽的這種合成性微小基因隨后可克隆到理想的表達(dá)載體中。
通?？蓪⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)序列包括在此載體中以確保在靶細(xì)胞中表達(dá)。需要幾種載體元件具有微小基因插入的下游克隆位點(diǎn)的啟動(dòng)子；用于有效轉(zhuǎn)錄終止的聚腺苷酸化信號(hào)；大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)和大腸桿菌選擇標(biāo)記(如氨卡青霉素或卡那霉素抗性)。許多啟動(dòng)子可用于此目的，如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子。其它適合的啟動(dòng)子序列見美國(guó)專利號(hào)5,580,859和5,589,466。
可能需要其他的載體修飾以優(yōu)化微小基因的表達(dá)和免疫原性。在一些例子中，有效的基因表達(dá)需要內(nèi)含子，可將一個(gè)或個(gè)多合的成或天然產(chǎn)生的內(nèi)含子加入到微小基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域。也可考慮包括mRNA穩(wěn)定性序列以增加微小基因的表達(dá)。最近提出免疫刺激序列(ISS或CpG)在DNA疫苗免疫原性中發(fā)揮作用。這些序列如果發(fā)現(xiàn)能提高免疫原性，可包括在載體中、微小基因編碼序列外。
在一些實(shí)施方案中，可采用雙順反子表達(dá)載體來產(chǎn)生微小基因編碼的表位和所包含的第二個(gè)蛋白質(zhì)以增強(qiáng)或減弱免疫原性。如果共同表達(dá)可有效提高免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或多肽的例子包括細(xì)胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)分子(如LeIF)或共刺激分子。此外，如使用輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)抗原，可將該HTL表位加入細(xì)胞內(nèi)靶信號(hào)，與CTL表位分開來表達(dá)。這樣可將HTL表位導(dǎo)入不同于CTL表位的細(xì)胞腔室，這可更有效促進(jìn)HTL表位進(jìn)入MHC II類通路，從而有利于和提高CTL誘導(dǎo)。與CTL誘導(dǎo)相反，通過共表達(dá)免疫抑制分子(如TGF-β)特異減弱免疫應(yīng)答對(duì)一些疾病時(shí)可能有益。
一旦選定表達(dá)載體，將該微小基因克隆至啟動(dòng)子下游的多接頭區(qū)域。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌菌株中，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備DNA。微小基因的取向和DNA序列以及載體中包括的所有其它元件用限制性酶切圖和DNA序列分析驗(yàn)證。接受正確質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞可貯存作為主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。
可通過在大腸桿菌中發(fā)酵接著純化來產(chǎn)生治療用量的質(zhì)粒DNA。取工作細(xì)胞庫的等分用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基(如Terrific肉湯)，根據(jù)熟知的技術(shù)在搖瓶或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)至飽和。質(zhì)粒DNA可采用標(biāo)準(zhǔn)的生物分離技術(shù)如Quiagen提供的固相陰離子交換樹脂來純化。如果需要，超螺旋DNA可用電泳膠或其它方法與開環(huán)和線性形式分離。
純化的質(zhì)粒DNA可用許多配方制備用于注射。最簡(jiǎn)單的是將凍干的DNA在無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中重建。許多方法已有描述，也有一些新技術(shù)。如上面所述，核酸可與陽離子脂質(zhì)方便地配制。共同歸類為保護(hù)性、相互作用性、非凝聚性(PINC)的糖脂、融合性脂質(zhì)體、肽和化合物也可與純化質(zhì)粒DNA組成復(fù)合物以影響變量如穩(wěn)定性、肌肉內(nèi)分散或者輸送給特異器官或細(xì)胞類型。
靶細(xì)胞致敏可用作微小基因編碼的CTL表位的表達(dá)和MHC I類呈遞的功能性試驗(yàn)?？蓪⒋速|(zhì)粒DNA導(dǎo)入適于作為標(biāo)準(zhǔn)CTL鉻釋放試驗(yàn)靶細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。所用的轉(zhuǎn)染方法取決于最后的制劑。電穿孔可用于“裸露”DNA，而陽離子脂質(zhì)允許直接體外轉(zhuǎn)染。可共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光蛋白(GFP)以增加用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些細(xì)胞隨后用鉻-51標(biāo)記并作為表位特異性CTL系的靶細(xì)胞。細(xì)胞溶解、51Cr釋放的檢測(cè)表明產(chǎn)生了微小基因編碼的CTL表位的MHC呈遞。
體內(nèi)免疫原性是微小基因DNA制劑功能試驗(yàn)的第二種方法。表達(dá)適當(dāng)?shù)娜薓HC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠可用此DNA產(chǎn)物免疫。用藥劑量和途徑是制劑依賴的(如IM代表PBS中DNA，IP代表脂質(zhì)-復(fù)合的DNA)。免疫后21天，收集脾細(xì)胞并在編碼每個(gè)待測(cè)試表位的肽存在情況下重刺激一周。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析這些效應(yīng)細(xì)胞(CTL)對(duì)負(fù)載了肽的鉻-51標(biāo)記的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用。被負(fù)載了對(duì)應(yīng)于微小基因編碼表位的MHC致敏的靶細(xì)胞溶解，表明DNA疫苗在體內(nèi)功能為誘導(dǎo)CTL。
具有適當(dāng)單倍型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可提供了優(yōu)化微小基因DNA體內(nèi)免疫原性的有用工具。此外，動(dòng)物如猴子，具有保守性HLA分子能與人MHC分子識(shí)別的CTL表位起交叉反應(yīng)，可用于測(cè)定CTL表位的人類免疫原性(Bertoni等，J.Immunol.1614447-4455(1998))。
需要這些體內(nèi)研究以說明疫苗開發(fā)的關(guān)鍵性變量，這是體外試驗(yàn)不易評(píng)估的，如用藥途徑、疫苗配方、組織的生物分布和參與的主要和次要淋巴器官。由于其簡(jiǎn)單性和靈活性，與在高等動(dòng)物如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中更麻煩和花費(fèi)更大的研究相比，HLA轉(zhuǎn)基因小鼠代表另一種吸引人的選擇，至少對(duì)初始的疫苗開發(fā)研究如此。
抗原肽也可用于誘導(dǎo)活體外的CTL。產(chǎn)生的CTL可用于治療對(duì)其它常規(guī)治療方式或?qū)﹄囊呙缰委煼椒ú黄鸱磻?yīng)的病人的慢性感染(如病毒或細(xì)菌)或腫瘤。對(duì)特殊病原(感染病源或腫瘤抗原)的CTL應(yīng)答可通過在組織培養(yǎng)中一起培養(yǎng)病人的CTL前體細(xì)胞(CTLp)和抗原呈遞細(xì)胞(APC)及相應(yīng)的免疫原性肽來誘導(dǎo)。在適當(dāng)時(shí)間(通常1-4周)培養(yǎng)后，CTLp被激活、成熟和擴(kuò)增成為效應(yīng)CTL，將其回注給該病人，它們會(huì)在病人體內(nèi)破壞其特異性靶細(xì)胞(感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。
也發(fā)現(xiàn)此種肽可作為診斷試劑。例如，本發(fā)明的肽能用于測(cè)定具體個(gè)體對(duì)使用此肽或相關(guān)肽治療方案的是感性，因此對(duì)修改現(xiàn)有治療方案或確定受影響個(gè)體的預(yù)后有所幫助。
例如，本發(fā)明的肽可用于四聚物染色試驗(yàn)，以評(píng)估外周血單個(gè)核細(xì)胞在接觸病原或免疫原后是否有抗原特異性CTL存在。采用HLA-四聚復(fù)合物來直接顯現(xiàn)抗原特異性CTL(見如Ogg等，Science2792103-2106，1998；和Altman等，Science 17494-96，1996)并確定抗原特異性CTL細(xì)胞群在外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚物試劑可如下產(chǎn)生使結(jié)合等位基因的特異性HLA分子或超型分子的肽，在相應(yīng)HLA重鏈和β2-微珠蛋白存在時(shí)重折疊以產(chǎn)生四分子的復(fù)合物。該復(fù)合物在預(yù)先加入蛋白質(zhì)位點(diǎn)的重鏈羧基末端生物素?；Ｈ缓蠹尤腈溍褂H和物素誘導(dǎo)四聚物形成。通過熒光標(biāo)記鏈霉親和物素，該四聚物可用于染色抗原特異性細(xì)胞。然后用流式細(xì)胞儀可鑒定這些細(xì)胞。這種分析可用于診斷或預(yù)后目的。
此外，這種肽也可用于預(yù)測(cè)哪個(gè)個(gè)體會(huì)有發(fā)生慢性感染的很大風(fēng)險(xiǎn)。
本專利申請(qǐng)涉及美國(guó)專利序列號(hào)08/589,108(提交于1/23/96，現(xiàn)已作廢)，和涉及美國(guó)專利序列號(hào)08/205,713(提交于3/4/94)，是美國(guó)專利序列號(hào)08/159,184(提交于11/29/93)的延續(xù)部分，現(xiàn)已作廢，后者是美國(guó)專利序列號(hào)73,205(提交于6/4/93)的延續(xù)部分，現(xiàn)已人廢，后者是美國(guó)專利序列號(hào)08/027,146(提交于3/5/93)的延續(xù)部分，現(xiàn)已作廢。本應(yīng)用也涉及美國(guó)專利序列號(hào)60/013,980(提交于3/21/96)現(xiàn)已作廢，美國(guó)專利序列號(hào)08/454,033(提交于5/26/95)，美國(guó)專利序列號(hào)08/349,177(提交于12/2/94)和美國(guó)專利序列號(hào)08/753,622(提交于1/27/96)，現(xiàn)已作廢。上述提到的各專利申請(qǐng)納入本文參考文獻(xiàn)中。
實(shí)施例實(shí)施例1肽如先前Ruppert，J.等，“結(jié)合HLA-A2.1分子的肽中次要錨定殘基的顯著作用”，Cell 74929-937(1993)所述合成了所用的肽或作為原始材料從Chiron Mimotopes(Chiron公司，澳洲)購買。將合成的肽通過反相HPLC純化至勻質(zhì)性超過95％。合成肽的純度用分析性反相HPLC和氨基酸分析、測(cè)序和/或質(zhì)譜測(cè)定。將凍干肽在100％DMSO中重懸浮為4-20mg/ml，隨后以PBS+0.05％(v/v)NP40(FlukaBiochemika，Buchs，瑞士)稀釋劑所需濃度。
實(shí)施例2MHC純化EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系JY(A*0201)、M7B(A*0202)、FUN(A*0203)、DAH(A*0205)、CLA(A*0206)、KNE(A*0207)、AP(A*0207)和AMAI(A*6802)用作MHC分子主要來源。單個(gè)MHC等位基因轉(zhuǎn)染的721.221系也用作A*0202和A*0207來源。細(xì)胞在體外用添加有2mM L-谷氨酸(GIBCO，Grand Island，紐約)、100U(100μg/ml)青霉素-鏈霉素溶液(GIBCO)和10％熱滅活FCS(Hazelton Biologics)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)維持(Flow Laboratory，McLean，維吉尼亞)。大規(guī)模培養(yǎng)物在滾瓶中維持。從細(xì)胞裂解物中純化HLA分子(Sidney，J.等，“用膠過濾測(cè)定MHC/肽相互作用”，Curr Prot Immunol 18.3.1-18.3.19(1998))。簡(jiǎn)言之，使細(xì)胞在50mM Tris-HCl、pH8.5、含1％(v/v)NP-40、150mM NaCl、5mM EDTA和2mM PMSF中以108細(xì)胞/ml濃度裂解。使裂解物隨后通過0.45μM過濾器，10,000xg離心20分鐘去除細(xì)胞核和碎片，用單克隆抗體親和層析純化MHC分子。
為為親和純化，將失活的瓊脂糖CL4B和蛋白A瓊脂糖柱用作預(yù)柱。經(jīng)反復(fù)通過偶聯(lián)了抗HLA(A、B、C)抗體W6/32的蛋白A瓊脂糖珠捕獲I類分子(Sidney，J.等，同上)。HLA-A分子進(jìn)一步通過B1.23.2柱從HLA-B和-C分子中純化。通過2到4次后，用10倍柱體積的10mM Tris-HCl，pH8.0，1％(v/v)NP-40，2倍柱體積的PBS，2倍柱體積含0.4％(w/v)n-辛基糖苷的PBS洗滌W6/32柱。I型分子用50mM二甲胺(溶于含0.4％(w/v)n-辛基糖苷的0.15M NaCl中，pH 11.5)洗提。加入1/26體積的2.0M pH6.8 Tris到洗脫液中以降低pH到～8.0。然后在Centriprep 30濃縮器中以2000rpm離心濃縮洗脫液(Amicon，Beverly，麻薩諸塞州)。蛋白質(zhì)的純度、濃度和去除(雜質(zhì))步驟的有效性用SDS-PAGE和BCA試驗(yàn)監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例3MHC-肽結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定肽與可溶I型分子結(jié)合的定量試驗(yàn)依據(jù)對(duì)放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)肽結(jié)合的抑制。如前面描述進(jìn)行這些試驗(yàn)(Sidney，J.等，同上)。簡(jiǎn)言之，將1-10nM放射性同位素標(biāo)記肽室溫與1μM到1nM的純化的MHC在1μM人β2-微球蛋白(Scripps Laboratories，圣迭哥，加州)和蛋白酶抑制劑混合物存在時(shí)共同培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，放射性結(jié)合的MHC百分比用TSK 2000柱通過大小排阻凝膠過濾層析測(cè)定。或者，放射性結(jié)合的MHC百分比通過在W6/32抗體包被板上捕獲的MHC/肽復(fù)合物并用TopCount微量閃爍計(jì)數(shù)器(Packard Instrument公司，Meriden，CT)測(cè)定每分鐘結(jié)合計(jì)數(shù)(Southwood等，Epimmune Technical Report Epi 063-99)。
用于A*0201、A*0202、A*0203、A*0205、A*0206和A*0207試驗(yàn)的放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)肽，是HBV核心18-27表位(序列FLPSDYFPSV)的F6＞Y類似物。此肽對(duì)各個(gè)分子的平均IC50分別為5.0、4.3、10、4.3、3.7和23nM。HBV pol 646(序列FTQAGYPAL)或MAGE 1282(序列YVIKVSARV)的C4＞A類似物在A*6802試驗(yàn)中用作標(biāo)記。它們對(duì)A*6802的IC50分別為40和8nM。
在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，計(jì)算產(chǎn)生放射性同位素標(biāo)記肽結(jié)合50％抑制的肽濃度。首先以1或2種高劑量測(cè)試這些肽。然后在后續(xù)試驗(yàn)中測(cè)定產(chǎn)生陽性抑制的肽的IC50，試驗(yàn)中測(cè)試了2到6種稀釋度。在所用條件下，當(dāng)[標(biāo)記]＜[MHC]和IC50≥[MHC]時(shí)，測(cè)定的IC50值是真實(shí)Kd值的合理近似值。每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)肽在2到4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測(cè)試。作為陰性對(duì)照，也在每次實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了未用放射性同位素標(biāo)記的探針。
實(shí)施例4另一種結(jié)合試驗(yàn)將EB病毒(EBV)-轉(zhuǎn)化的純合子細(xì)胞系，纖維母細(xì)胞，CIR獲721.22轉(zhuǎn)染子用作HLA I型分子的來源。這些細(xì)胞體外在添加有2mM L-谷氨酸(GIBCO，GrandIsland，紐約)、50μM 2-ME、100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素(Irvine Scientific)和10％熱滅活FCS(Irvine Scientific，Santa Ana，加州)的。RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)維持。細(xì)胞在225-cm2組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)或在滾瓶裝置中大規(guī)模培養(yǎng)。用IEC-CRU5000離心機(jī)和259轉(zhuǎn)頭1500 RPM離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖鹽水(PBS)(0.01MPO4，0.154M NaCl，pH7.2)洗3遍。
沉淀細(xì)胞并-70℃儲(chǔ)存或用洗滌劑裂解液處理以制備洗滌劑裂解液。細(xì)胞裂解液通過將洗滌劑原液[1％NP-40(Sigma)或Renex30(Accurate Chem.Sci.公司，Westbury，紐約11590)，150mM NaCl，50mM Tris，pH8.0]以50-100×106細(xì)胞/每ml洗滌劑液加到細(xì)胞沉淀(來先已計(jì)數(shù)過)中制備。將蛋白酶抑制劑混合物加入到已測(cè)量過體積的洗滌劑原液中然后立即加入到細(xì)胞沉淀中。加入的蛋白酶抑制劑混合物產(chǎn)生以下最終濃度苯甲基磺酰氟(PMSF)，2mM；抑酶肽，5μg/ml；亮抑酶肽，10μg/ml；胃酶抑素，10μg/ml；碘乙酰胺，100μM和EDTA，3ng/ml。使細(xì)胞裂解4℃進(jìn)行1小時(shí)并定期混合。通常以50-100ml洗滌劑溶液裂解5-10×109個(gè)細(xì)胞。4℃以15,000xg離心30分鐘，然后使上清組分通過0.2μ過濾單元(Nalgene)澄清裂解液。
HlA-A抗原的純化采用mAb-偶聯(lián)瓊脂糖珠制備的親和柱而實(shí)現(xiàn)。為產(chǎn)生抗體，將細(xì)胞在大組織培養(yǎng)瓶中(Corning25160-225)用含10％FBS的RPMI培養(yǎng)。通過硫酸銨分離然后蛋白-A-瓊脂糖(Sigma)親和層析從澄清的組織培養(yǎng)液中純化得到抗體。簡(jiǎn)言之，緩慢攪拌將飽和硫酸銨加入到組織培養(yǎng)上清液中至45％(體積對(duì)體積)，4℃過夜沉淀免疫球蛋白。沉淀的蛋白質(zhì)以10,000xg離心30分鐘而收獲。將沉淀物然后溶解在最小體積的PBS中并轉(zhuǎn)入透析袋(Spectro/Por2，Mol.wt.cutoff12,000-14,000，Spectum Medical Ind.)。以PBS(蛋白質(zhì)溶液的20倍體積)透析4℃24-48小時(shí)、更換透析緩沖液4-6次。透析后的蛋白溶液通過離心(10,000xg 30分鐘)和用1N NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至pH8.0而澄清。根據(jù)生產(chǎn)商說明水合蛋白-A-瓊脂糖(Sigma)并準(zhǔn)備蛋白-A-瓊脂糖柱。10ml柱床體積的柱一般可結(jié)合50-100mg小鼠IgG。
對(duì)于大加載體積采用蠕動(dòng)泵或?qū)τ谳^小體積(＜100ml)通過重力將蛋白樣品加載到蛋白-A-瓊脂糖柱上。用幾體積PBS洗滌此柱，以分光光度計(jì)在A280監(jiān)測(cè)洗脫液直到達(dá)到基線。結(jié)合的抗體用0.1M檸檬酸在適當(dāng)pH(用1N NaOH調(diào)節(jié)到合適pH)下洗脫。pH6.5用于小鼠IgG-1，pH4.5用于IgG2a，pH3.0用于IgG2b和IgG3。用2M Tris堿中和洗脫液。合并含抗體(以A280監(jiān)測(cè))的組分，以PBS透析并用Amicon Stirred Cell系統(tǒng)(帶有YM30膜的Amicon 8050型)進(jìn)一步濃縮?？笰2 mAb、BB7.2用于親和純化。
HLA-A抗原用mAb偶聯(lián)瓊脂糖珠制備的親和柱純化。該親和柱通過培育蛋白-A-瓊脂糖珠(Sigma)和上述親和純化的mAb制備。每ml珠5到10mg mAb是較佳比例。MAb結(jié)合珠用硼酸鹽緩沖液(硼酸鹽緩沖液100mM四硼酸鈉，154mMNaCl，pH8.2)洗滌直到洗出液顯示A280在基線上。加入溶于200mM三乙醇胺中的二甲基pimelimidate(20mM)使mAb共價(jià)交聯(lián)結(jié)合于蛋白-A-瓊脂糖(Schneider等，J.Biol.Chem.25710766(1982)。室溫下在旋轉(zhuǎn)器中培育45分鐘后，用10-20ml的20mM pH8.2乙醇胺洗滌珠2次去除過量的交聯(lián)試劑。每次之間，將珠漿液室溫下置于旋轉(zhuǎn)器上5分鐘。用硼酸鹽緩沖液和PBS加0.02％疊氮化鈉洗滌珠。
然后使細(xì)胞裂解液(5-10×109細(xì)胞同等物)緩慢通過5-10ml親和柱(流率為0.1-0.25ml/每分鐘)以使抗原結(jié)合于固定的抗體。裂解該通過柱后，隨之用20倍柱體積的洗滌劑儲(chǔ)存液加0.1％十二烷基硫酸鈉，20倍柱體積的0.5M NaCl，20mMTris，pH8.0和10倍柱體積的20mM Tris，pH8.0洗滌此柱。結(jié)合mAb的HLA-A抗原用堿性緩沖液(50mM二甲胺水溶液)洗脫。另一種方法是，也用酸性溶液如0.15-0.25M乙酸洗脫結(jié)合的抗原。取洗脫液一等分(1/50)用比色試驗(yàn)(BCA試驗(yàn)，Pierce)或SDS-PAGE，或兩者作蛋白定量。SDS-PAGE分析如Laemmli所述進(jìn)行(Laemmli，英國(guó)，Nature 227680(1970))，用已知量的牛血清白蛋白(Sigma)作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。等位基因特異性抗體用于純化特異性MHC分子。在HLA-A2例子中，使用mAb BB7.2。
用于測(cè)定肽與I型HLA分子結(jié)合的方案的詳細(xì)描述已出版(Sette等，Mol.Immunol.31813，1994；Sidney等，Current Protocols in Immunology Margulies，編，John Wiley和Sons，紐約，Section 18.3，1998)。簡(jiǎn)言之，將純化的MHC分子(5到500nM)與各種未標(biāo)記的肽抑制劑和1-10nM125I-放射性同位素標(biāo)記探針肽在含0.05％Nouidet P-40(NP40)的PBS中(或20％w/v洋地黃皂苷用于H-2 IA試驗(yàn))在蛋白酶抑制劑混合物存在情況下培育48小時(shí)。蛋白酶抑制劑(各購自CalBioChem，LaJolla，加州)的最終濃度為1mM PMSF、1.3nM 1.10鄰二氮雜菲、73μM胃酶抑素、8mM EDTA、6mM N-乙基馬來酰亞胺和200μM N-α-對(duì)位甲苯磺酰基-L-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)。所有試驗(yàn)在pH7.0進(jìn)行。
培育后，將MHC-肽復(fù)合物通過在7.8mm×15cm TSK200柱(TosoHaas16215，Montgomeryville，PA)上作凝膠過濾與游離肽分離，用含0.5％NP40和0.1％NaN3的PBS pH6.5以1.2ml/分鐘洗脫。使TSK柱的洗脫液通過Beckman170放射性同位素探測(cè)器，對(duì)放射活性作圖并用Hewlett-Packard 3396A積分儀積分，確定了肽結(jié)合組分。
放射性同位元素標(biāo)記肽用氯胺-T方法碘化。在每次試驗(yàn)中使用了特異性放射性同位素標(biāo)記的探針肽。通常，在初步實(shí)驗(yàn)中，在存在固定量的放射性同位素標(biāo)記的肽時(shí)滴定各個(gè)MHC制品以確定結(jié)合10-20％總放射性必須的HLA分子的濃度。
所有后續(xù)抑制試驗(yàn)和直接結(jié)合試驗(yàn)用這些HLA濃度進(jìn)行。
由于在這些條件[標(biāo)記]＜[HLA]和IC50≥[HLA]下，測(cè)定的IC50值是真實(shí)Kd值的合理近似值。肽抑制劑一般在濃度范圍120μg/ml到1.2ng/ml，在2到4次完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中測(cè)試。為比較不同實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，將每個(gè)測(cè)試肽IC50(通常為未用放射性同位素標(biāo)記的探針肽)的IC50。除以陽性抑制對(duì)照，也即包括在每次結(jié)合試驗(yàn)中的參比肽的IC50，計(jì)算出各肽的相對(duì)結(jié)合指數(shù)。為用于數(shù)據(jù)庫和實(shí)驗(yàn)間比較，匯總相對(duì)結(jié)合值。這些值可隨后通過將感興趣肽的相對(duì)結(jié)合值除以參比肽的標(biāo)準(zhǔn)歷史IC50值轉(zhuǎn)變成標(biāo)準(zhǔn)化的IC50nM值。此種數(shù)據(jù)匯總方法經(jīng)證明對(duì)于比較不同日期測(cè)試的肽或不同批純化的MHC是最精確和一致的。例如，本文描述的HLA-A2.1結(jié)合試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參比肽(或陽性對(duì)照)是具有序列FLPSDYFPSV的肽，在多次重復(fù)結(jié)合試驗(yàn)中其平均歷史IC50為5nM。此標(biāo)準(zhǔn)值可用于標(biāo)準(zhǔn)化本文所述HLA-A2.1結(jié)合試驗(yàn)報(bào)告的IC50值。因此，測(cè)試HLA-A2.1攜帶基序肽的相對(duì)結(jié)合值可通過將測(cè)試的HLA-A2.1攜帶基序肽的相對(duì)結(jié)合值除以標(biāo)準(zhǔn)參此品的IC50值即5nM轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)化的IC50。
實(shí)施例5順序和結(jié)合分析采用實(shí)施例3所述試驗(yàn)，將各測(cè)試肽的IC50除以陽性抑制對(duì)照的IC50計(jì)算出各肽的相對(duì)結(jié)合值。這些值隨后，可通過將感興趣肽的相對(duì)結(jié)合值除以陽性抑制對(duì)照的IC50轉(zhuǎn)變成IC50nM值。這種數(shù)據(jù)匯總方法已證明對(duì)于比較不同日期測(cè)試的肽或不同批純化的MHC是最精確和一致的。標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)結(jié)合值(ARB)也可計(jì)算出具有特別特征的所有肽的幾何平均值或相對(duì)結(jié)合平均值(ARB)(Ruppert，J.等，“結(jié)合HLA-A2.1分子的肽中次要錨定殘基的顯著作用”，Cell 74929-937(1993)；Sidney，J.等，“HLA-A3-類超基序的明確顯示常見HLA分子的重疊肽結(jié)合組成成分”，Hum Immunol.4579-93(1996)；Sidney，J.等，“結(jié)合HLA-B7-類似I型分子的肽的特異性和簡(jiǎn)并性”，J.Immunol.1573480-3490(1996)；Kondo，A.等，“結(jié)合HLA-A24人I型分子的肽中次要錨定殘基的顯著作用”，J.Immunol.1554307-4312(1995)；Kondo，A.等，“兩種不同HLA-A*0101-特異性亞基序闡明了另一種肽結(jié)合模式”，Immunogenetics 45249-258(1997)；Gulukota，K.等，“預(yù)測(cè)結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體分子的肽的兩種互補(bǔ)方法”，J.Mol.Biol.2671258-1267(1997)；Southwood，S.等“幾種常見HLA-DR類型共有大的重疊肽結(jié)合組成成分”，J.Immunol.1603363-3373(1998))。
基于ARB的影響到肽結(jié)合于HLA-A2超型分子的次要相互作用圖已如前所述獲得(Ruppert，J.等，“結(jié)合HLA-A2.1分子的肽中次要錨定殘基的顯著作用”，Cell74929-937(1993)；Sidney，J.等，“HLA-A3-類超基序的明確顯示常見HLA分子的重疊肽結(jié)合組成成分”，Hum Immunol.4579-93(1996)；Sidney，J.等，“結(jié)合HLA-B7-類I型分子的肽的特異性和簡(jiǎn)并性”，J.Immunol.1573480-3490(1996)；Kondo，A.等，“結(jié)合HLA-A24人I型分子的肽中次要錨定殘基的顯著作用”，J.Immunol.1554307-4312(1995)；Kondo，A.等，“兩種不同HLA-A*0101-特異性亞基序闡明了另一種肽結(jié)合模式”，Immunogenetics 45249-258(1997)；Gulukota，K.等，“預(yù)測(cè)結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體分子的肽的兩種互補(bǔ)方法”，J.Mol.Biol.2671258-1267(1997))。基本上選出了有給定大小(8、9、10或11個(gè)氨基酸的肽)和至少一個(gè)耐受性主要錨定殘基進(jìn)行分析。對(duì)各個(gè)大小組的肽的結(jié)合能力通過測(cè)定在特殊位置含特異性氨基酸殘基的肽的ARB值作了分析。為測(cè)定主要錨定位置的特異性，將ARB值相對(duì)于帶有最佳結(jié)合相關(guān)殘基的肽的ARB進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于次要錨定決定基，將ARB值相對(duì)于整個(gè)肽組的ARB進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如，測(cè)定了所有1位含A或7位含F(xiàn)等的9-聚肽的ARB值。由于某些氨基酸罕見，一些分析殘基如前所述根據(jù)各自化學(xué)相似性進(jìn)行分類(Ruppert，J.等，同前；Sidney，J.等，同前；Sidney，J.等，同前；Kondo，A.等，同前；Kondo，A.等，同前；Gulukota，K.等，同前；Southwood，S.等，同前)。
HLA-A2-超型分子的頻率為選擇代表主要民族中頻率最高的等位基因形式的一組A2-超型分子，采用了D.Mann和M.Fernandez-Vina的未發(fā)表的人群分類數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)與發(fā)表的數(shù)據(jù)一致(Sudo，T.等，“HLA I型等位基因的DNA分類I.HLA-A2和-A28亞組”，Hum.Immunol.33163-173(1992)；Ellis，J.M.等，“HLA-A2等位基因在五種美國(guó)人群中的頻率”Hum.Immunol.61334-340(2000)；Krausa，P.等“HLA-A*02中的遺傳性多態(tài)現(xiàn)象不同人群中表現(xiàn)出顯著的等位基因變化”，Tissue Antigens45233-231(1995)和Imanishi，T.等“在不同民族中HLA及互補(bǔ)基因座的等位基因和單倍型的頻率”Tsuji，K.等(eds)HLA 1991，第十一屆國(guó)際組織相容性專題討論會(huì)和大會(huì)論文匯編，第一卷，牛津大學(xué)出版社，牛津，pp.1065-1220(1992))，并列在表3中。對(duì)所考慮的4個(gè)主要民族，顯然7個(gè)HLA等位基因代表了絕大部分A2-超型等位基因。包括在此組的有A*0201、A*0202、A*0203、A*0205、A*0206、A*0207和A*6802。每個(gè)這些等位基因存在于2％或更多的普通人群中，在至少一個(gè)主要民族中也超過5％頻率出現(xiàn)。其他等位基因在任何一個(gè)主要民族人群中僅有1.3％或不到的稀少頻率，而且在一般人群中此種稀少等位基因沒有一種頻率超過1％?；谶@些觀察，選擇A*0201、A*0202、A*0203、A*0205、A*0206、A*0207和A*6802來研究在A2-超型中所定義肽的結(jié)合特異性和交叉反應(yīng)。
A2-超型分子的主要錨定位置前面研究表明對(duì)命名為A2-超型的一組I型分子有著大重疊肽結(jié)合特異性。這里，對(duì)A2-超型分子的主要肽結(jié)合特異性作了更詳?shù)丶?xì)檢測(cè)。一些結(jié)果前面已發(fā)表，這里列出的僅作為參考目的(Ruppert，J.等，同上；和Sidney，J.等，“HLA-A*0207肽結(jié)合組成成分局限于A*0201組成成分的一個(gè)亞組”，Hum.Immunol.5812-20(1997))。
在第一系列研究中，將非保守賴氨酸(K)替換引入2個(gè)前述能結(jié)合多個(gè)A2-超型分子的兩種肽的每個(gè)位置1)HCVNS3 590 9-聚肽(序列YLVAYQATV)，2)HBV核心18 F6＞Y 10-聚類似物肽(序列FLPSDYFPSV)。測(cè)試了這些肽結(jié)合A*0201、A*0202、A*0203、A*0205、A*0206、A*0207和A*6802的能力。在表4a和4b中，結(jié)合能力以相對(duì)于親代肽的比率表示。結(jié)合能力在最佳結(jié)合劑10倍內(nèi)的肽認(rèn)為較佳；相對(duì)結(jié)合能力小于最佳結(jié)合劑10-100倍的肽認(rèn)為耐受。破折號(hào)(“-”)表示小于0.01的相對(duì)結(jié)合。在HCV NS3 590肽(表4a)例子中，在2位和C末端的K替換導(dǎo)致對(duì)各HLA分子的結(jié)合下降了100多倍。在A*6802中當(dāng)1和5位作K替換時(shí)，也發(fā)現(xiàn)結(jié)合下降了100多倍。當(dāng)在其它幾個(gè)位置尤其是3和7位作替換時(shí)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合能力下降范圍為10-100倍。當(dāng)研究10-聚HBV核心18 F6＞Y配體時(shí)(表4b)，當(dāng)肽在2位和C末端替換時(shí)，再次發(fā)現(xiàn)結(jié)合能力下降100多倍。結(jié)合的顯著降低也在7位替換后觀察到。
總之，這些數(shù)據(jù)提示A2-超型分子通過2位和C末端錨定殘基能結(jié)合9-和10-聚肽配體。朝向肽中部的存在其他主要或次要錨定殘基由結(jié)合9-和10-聚肽的能力通常為7位替換所減弱的得到證明。
表3

表4a

表4b

2位和C末端錨定殘基的特異性基于這些結(jié)果，對(duì)A2-超型分子在2位和C末端的配體特異性采用其他的HCVNS3 590和HBV核心18 F6＞Y單替換類似物以及聚丙氨酸肽(肽953.01；序列ALAKAAAAV)的單替換類似物作了分析。為了這些分析，錨定殘基的較佳氨基酸定義為結(jié)合能力在最佳殘基10倍以內(nèi)的相關(guān)氨基酸。相對(duì)結(jié)合能力在0.01和0.1之間的氨基酸定義為耐受，結(jié)合能力低于0.01的相關(guān)氨基酸認(rèn)為是非耐受。在附表中，破折號(hào)(“-”)表示低于0.01的相對(duì)結(jié)合。結(jié)合能力以每個(gè)分子相對(duì)于最高結(jié)合親和力的相關(guān)類似物的比率表示。
發(fā)現(xiàn)在2位為2個(gè)小的脂肪族疏水殘基通常上耐受的，而其它殘基包括大的極性、芳香族和帶電荷殘基一般不能很好耐受(表5a、5b和5c)。L、I、V和M作為錨定殘基在大部分(＞80％)情況下較佳(表5d)。表5d中等位基因/肽組合指與相對(duì)結(jié)合范圍在1-0.1(較佳)或0.1-0.001(耐受)相關(guān)的給定殘基的許多例子。A、T、Q和S較少選為錨定殘基，但＞80％檢測(cè)情況為較佳或耐受。其它檢測(cè)的氨基酸在任何情況下設(shè)有較佳的且罕見耐受。
表5aHCV NS3 590相對(duì)結(jié)合能力

表5bHBV核心18 F6＞Y相對(duì)結(jié)合能力

表5c聚丙氨酸肽ALAKAAAAV相對(duì)結(jié)合能力

表5d總結(jié)等位基因/肽組合

在C末端，發(fā)現(xiàn)V在所有3個(gè)親代肽中是A*0201、A*0206和A*6802的最佳殘基，在3個(gè)親代肽的2個(gè)中是A*0203和A*0205的最佳殘基(表6a、6b和6c)?？偟膩碚f，不管測(cè)試的肽V或L是每個(gè)分子的C末端最佳殘基，。表6d中等位基因/肽組合指與相對(duì)結(jié)合范圍在1-0.1(較佳)或0.1-0.001(耐受)相關(guān)的給定殘基的許多例子。脂肪族/疏水氨基酸V、L和I在超過66.7％MHC-肽情況中是較佳錨定殘基。M、A和T約50％時(shí)間為耐受。其它檢測(cè)的殘基根本沒有接受或罕見耐受。
A*0201的肽結(jié)合特異性的重評(píng)估利用4000多種長(zhǎng)8-11個(gè)殘基的肽的數(shù)據(jù)庫更詳細(xì)地研究了A*0201結(jié)合的精細(xì)特異性。發(fā)現(xiàn)30％wt在2位攜帶L或M的肽以500nM或更高親和力結(jié)合A*0201(圖1a)。5-15％攜帶脂肪族殘基I、V、A、T和Q的肽以500nM或更高IC50結(jié)合。沒有其它殘基包括芳香族(F、W和Y)，帶電荷(R、H、K、D和E)，極性(S和N)及小(C、G和P)殘基，與500nM或更高IC50相關(guān)。
與單個(gè)替換分析一致，發(fā)現(xiàn)V是最佳的A*0201 C末端錨定殘基(圖1b)?？傮w上，31.9％在C末端有V的肽是A*0201結(jié)合劑。I、L、S、M、T和A也耐受，7.1％到28.6％的肽以500nM或更高IC50結(jié)合。
下面分析了肽長(zhǎng)度(8到11個(gè)殘基之間)和結(jié)合能力之間的相互關(guān)系。發(fā)現(xiàn)27.6％的9聚肽以500nM或更低IC50結(jié)合與前面的評(píng)估(Ruppert，J.等，supra)有很好的一致性(表7a)。按最佳大小的一組肽標(biāo)準(zhǔn)化ARB值，并列出作為參考。
更長(zhǎng)的肽也能結(jié)合，盡管程度有所下降；17.8％的10-聚肽和14.5％的11-聚肽親和力為500nM或更高。最后，發(fā)現(xiàn)8-聚肽很少結(jié)合A*0201，3.5％的肽結(jié)合能力超過500nM。
進(jìn)一步分析了A*0201肽結(jié)合數(shù)據(jù)庫以評(píng)估A*0201基序的嚴(yán)謹(jǐn)性。如所預(yù)計(jì)的那樣，在每個(gè)錨定位置有較佳殘基的肽結(jié)合最頻繁(48.7％)，平均相對(duì)結(jié)合能力比文庫中的其它肽高(表7b)。有1個(gè)較佳殘基和1個(gè)耐受殘基的肽結(jié)合也相對(duì)頻繁，頻率范圍為17.6％到28.4％。最后，在兩個(gè)主要錨定位置具有至少1個(gè)非耐受殘基或都為耐受殘基的肽結(jié)合罕見，結(jié)合頻率在0-7.1％范圍。就主要錨定殘基偏愛作為配體大小的函數(shù)，沒有檢測(cè)到顯著不同。
表6aHCV NS3 590相對(duì)結(jié)合能力

表6bHBV核心18 F6＞Y相對(duì)結(jié)合能力

表6c聚丙氨酸肽ALAKAAAAV相對(duì)結(jié)合能力

表6d總結(jié)等位基因/肽組合

表7a結(jié)合作為肽大小的函數(shù)

表7b結(jié)合作為主要錨定基的序函數(shù)

為鑒定次要錨定殘基的作用，通過測(cè)定在特異的但大小依賴性位置含特殊氨基酸殘基的肽的ARB值進(jìn)一步分析了各組中肽的A*0201結(jié)合能力。8-11-聚序列相應(yīng)殘基/位置對(duì)的ARB值，列于表8a-8d。表8a-8d中所有的肽在主要錨定位置具有至少1個(gè)較佳和1個(gè)耐受殘基。在次要錨定位置對(duì)應(yīng)于結(jié)合能力3倍或更大增加的值以加深的黑體字表示。與結(jié)合親和力減少3倍相關(guān)的負(fù)作用用下劃線和斜體字表示。確定為較佳或耐受錨定的殘基以黑體字表示。錨定位置分析物產(chǎn)生的ARB值的描述見圖1。為使用此表所示的值作為預(yù)測(cè)運(yùn)算法的系數(shù)，將非耐受錨定殘基的值設(shè)為0.001，相當(dāng)于結(jié)合能力減少1000倍，以過濾掉非基序肽。
在表8a、8b、8c和8d中，一組93個(gè)8-聚肽、1389個(gè)9-聚肽、953個(gè)10-聚肽及95個(gè)11-聚肽的分析結(jié)果分別根據(jù)不同病毒、細(xì)菌或致病原的天然產(chǎn)生的序列。所列ARB值的計(jì)算按Sidney等，Human Immunology 621200(2001)和Sidney等，J.Immunology 1573480(1996)中所述進(jìn)行。對(duì)9-聚和10-聚肽，分別考慮了各殘基產(chǎn)生的ARB值。為研究8-聚和11-聚肽(分別見表8a和8d)，ARB值根據(jù)化學(xué)相似殘基分組，如Rvppert等，Cell 74929(1993)中所述。8-聚、9-聚、10-聚及11-聚組的幾何平均結(jié)合能力分別為14420nM、1581nM、3155nM和3793nM。
匯總圖見圖2a-2d。在大部分位置，可檢測(cè)到一些次要影響，多數(shù)(55％)負(fù)影響涉及酸性(D和E)或堿性(R、H和K)殘基。脯氨酸(P)和大極性殘基(Q和N)也經(jīng)常斷裂。盡管每種具體大小與獨(dú)特偏愛相關(guān)，在大部分情況下(79％)優(yōu)選殘基是芳香族殘基(F、W或Y)，或疏水性殘基(L、I、V或M)。多數(shù)肽長(zhǎng)度表現(xiàn)出對(duì)3位F、Y和M的偏愛。類似的，所有大小的肽享有在C-2位芳香族或疏水殘基的偏愛。
表8a8-聚肽位置(ARB)

表8b9-聚肽位置(ARB)

表8c10-聚肽位置(ARB)

表8d11-聚肽位置(ARB)

對(duì)給定大小的肽也觀察到幾種不同偏愛模式。例如，8-聚肽在1或3位對(duì)9-、10-和11-聚肽偏愛的疏水或芳香族殘基沒有任何偏愛。11-聚肽在整個(gè)肽中部多個(gè)位置獨(dú)偏愛G。
其它A2-超型分子的主要錨定特異性在下面分析中，評(píng)估四個(gè)靠近A*0201的最普遍A2超型等位基因A*0202、A*0203、A*0206和A*6802的主要錨定特異性。A2超型結(jié)合數(shù)據(jù)庫中的肽常常反映出利用基于A*0201偏性的選擇，如只選擇A*0201結(jié)合肽或選擇A*0201算法得分高的肽。結(jié)果，在大部分情況中，只有其具較佳超型和耐受的殘基的肽可得到非A*0201分子的肽結(jié)合數(shù)據(jù)。盡管有此限制，得到了約400種肽的數(shù)據(jù)庫可供研究。沒有得到足夠大小的數(shù)據(jù)庫來分析A*0205和A*0207，雖然A*0207特異性分析已在先前發(fā)表了(Sidney，J.等，同前)。
2位特異性的分析總體于圖3a-d中。通常，V、T、A、I和M在每個(gè)分子情況下均耐受。也發(fā)現(xiàn)等位基因特異性偏愛。在A*0202例子中Q是最偏愛的殘基。其它殘基(L、I、V、A、T和M)則耐受，大致相當(dāng)于0.08-0.30范圍的ARB。相反，A*0203偏愛L、M和Q。殘基V、A、I和T與較低的總體結(jié)合親和力相關(guān)。對(duì)A*0206發(fā)現(xiàn)了第三種模式，其中Q、V、I、A和T均很好耐受，ARB值在0.47和1.0之間，而L和M沒那么耐受。最后，對(duì)A*6802，V和T是最佳殘基，ARB＞0.45。A也是偏愛的，但ARB較低(0.13)。I和M觀察到結(jié)合顯著下降，ARB在0.050和0.020之間。L和Q不耐受，ARB＜0.010。在C末端，I、V、L、A、M和T為所有測(cè)試的A2超型分子所耐受，ARB＞0.060(圖4a-d)。I和V是各等位基因最偏愛的兩個(gè)殘基；V是A*0203、A*0206和A*6802的最佳殘基。L通常是次最偏愛殘基。T、A和M常與較低ARB值相關(guān)。
總之，為A*0201偏愛或耐受的2位和C末端錨定殘基也為其它A2超型分子良好耐受。盡管每個(gè)等位基因在2位具有某種獨(dú)特的偏愛模式，每個(gè)等位基因在C末端表現(xiàn)出的偏愛模式完全類似。
對(duì)結(jié)合A2超型分子的肽的次要影響分析了相同文庫的肽配基以確定A*0202、A*0203、A*0206和A*6802的配基大小偏愛。對(duì)每個(gè)等位基因，ARB值按最佳大小肽組標(biāo)準(zhǔn)化。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)每個(gè)分子9-11聚肽均很好耐受，ARB＞0.36(表9a-d)。對(duì)A*0203、A*0206和A*6802，9聚肽最佳，但10-聚肽在A*0202中最佳。對(duì)所有等位基因，8-聚肽耐受差得多，每個(gè)均ARB＜0.11。
表9aA*0202

表9bA*0203

表9cA*0206

表9dA*6802

接著檢測(cè)了次要錨定殘基對(duì)肽結(jié)合A*0202、A*0203、A*0206和A*6802能力的影響?？傻玫降碾臄?shù)目?jī)H允許分析9-和10-聚配基。9-和10-聚肽的ARB值作為在特定位置存在特殊殘基的函數(shù)列于表10-13中，匯總圖見圖5-8。如上所述，正和負(fù)作用定義為分別與結(jié)合親和力3倍或更大增加或減少相關(guān)。
在表10a和10b中，對(duì)一組268個(gè)9-聚肽和一組120個(gè)10-聚肽分別測(cè)試了結(jié)合A*0202等位基因。在表11a和11b中，對(duì)一組272個(gè)9-聚肽和一組122個(gè)10-聚肽分別測(cè)試了結(jié)合A*0203等位基因。在表12a和12b中，對(duì)一組268個(gè)9-聚肽和一組120個(gè)10-聚肽分別測(cè)試了結(jié)合A*0206等位基因。在表13a和13b中，對(duì)一組268個(gè)9-聚肽和一組120個(gè)10-聚肽分別測(cè)試了結(jié)合A*6802等位基因。所有肽根據(jù)不同病毒、細(xì)菌或致病原的天然產(chǎn)生序列并在主要錨定位置具有至少1個(gè)較佳或耐受殘基。ARB值根據(jù)化學(xué)相似殘基分組，一般如Roppert等，Cell74929(1993)中所述。在次要錨定位置對(duì)應(yīng)于結(jié)合能力3倍或更大增加的值以黑體字表示。與結(jié)合親和力減少3倍的負(fù)作用用下劃線和斜體字表示。確定為較佳或耐受的錨定殘基以黑體字表示。為利用此表中所示值作為預(yù)測(cè)算法的系數(shù)，將非耐受錨定殘基的值設(shè)為0.001，相當(dāng)于結(jié)合能力降低1000倍，以過濾掉非基序肽。在表10a、10b、11a、11b、12a、12b、13a和13b中各組的平均幾何結(jié)合能力分別為401nM、342nM、85nM、95nM、387nM、643nM、838nM和1055nM。
一般，有害作用經(jīng)常與帶電荷殘基(D、E、R、H或K)相關(guān)。另外35％有害影響可歸因于G或P。正影響相對(duì)平均來源于堿性(R、H、K)，酸性(D和E)，疏水性(F、W、Y、L、I、V、M)或小(A、P)殘基。
雖然每個(gè)分子有獨(dú)特的偏愛和厭惡模式，一些共同傾向可見于10-聚肽例子中。例如，對(duì)所有分子，Q和N在1位較佳，R、H和K在8位較佳。D、E和G對(duì)10-聚肽在3位都是有害的。對(duì)9-聚肽中沒有發(fā)現(xiàn)共有序列的偏愛或厭惡。
表10a9-聚肽位置(ARB)

表10b10-聚肽位置(ARB)

表11a9-聚肽位置(ARB)

表11b10-聚肽位置(ARB)

表12a9-聚肽位置(ARB)

表12b10-聚肽位置(ARB)

表13a9-聚肽位置(ARB)

表13b10-聚肽位置(ARB)

概括起來，此章節(jié)中的數(shù)據(jù)詳細(xì)描述了9-和10-聚肽結(jié)合A*0202、A*0203、A*0206和A*6802的基序。與肽結(jié)合，每個(gè)基序具有特殊的與好或弱相關(guān)的特征。
共有的A2-超基序上述A2超型分子的基序非常類似并且有很大程度重疊。在此方面，可鑒定出分子-特異性基序普遍共有的特征性的一個(gè)共有超基序(圖9)。該共有基序特征是在肽配基的2位存在疏水和脂肪族殘基。在此位置，V、L和M優(yōu)選，而T、Q、A和T都耐受。根據(jù)每個(gè)A2超型分子中各殘基的偏愛等級(jí)，V是最優(yōu)先的殘基。在C末端該共有基序特征是存在疏水和脂肪族殘基L、I、V、M、A和T。V是最常見的最佳殘基，而L和T也認(rèn)為是優(yōu)選的，通常是次最佳殘基。M、A和T認(rèn)為是耐受殘基。
用A*0201、A*0202、A*0203、A*0206和A*6802的次要錨定圖產(chǎn)生了9-和10-聚肽的超型共有次要錨定基序(圖9)。認(rèn)為對(duì)3種或多種A2超型分子優(yōu)選且對(duì)任何分子無害的殘基為該超偏愛的共有基序。相反，鑒定為對(duì)3種或多種分子有害的殘基在共有基序中稱為有害殘基。該共有基序與詳細(xì)的A*0201基序明顯重疊，包括對(duì)1和/或3位芳香族殘基的偏愛和對(duì)3位帶電荷殘基的厭惡。
A*0201結(jié)合親和力和A2超型交叉反應(yīng)之間的相互關(guān)系由于與其它A2超型等位基因相比較四個(gè)主要民族A*0201占優(yōu)勢(shì)(如見表3)，確定A*0201結(jié)合肽也結(jié)合其它A2超型分子的程度令人感興趣。發(fā)現(xiàn)以良好親和力(IC50＜500nM)結(jié)合A*0201的肽常常結(jié)合其它A2超型分子(表14a)。36.1％到73.6％的A*0201結(jié)合肽能結(jié)合其它A2超型分子。分析A2超型簡(jiǎn)并性作為A*0201親和力的函數(shù)也產(chǎn)生了有趣的結(jié)果。72.8％的以IC50＜500nM結(jié)合A*0201的肽能結(jié)合3種或多種A2超型分子(表14b)。作為普遍規(guī)律，某肽對(duì)A*0201的結(jié)合親和力越高，該肽也能結(jié)合3種或多種超型分子的可能性越大。超過96％以20nM或更高親和力結(jié)合A*0201的肽，也結(jié)合3種或多種A2超型分子。相反，不能以大于500nM親和力結(jié)合A*0201的A2-超基序肽很少(10％)結(jié)合3種或多種A2超基序分子，并且從不結(jié)合4種以上分子。
概括起來，分析肽對(duì)A*0201和其它A2超型分子的交叉反應(yīng)性結(jié)合證實(shí)了該HLA分子家族能識(shí)別它們肽配基中的相似結(jié)構(gòu)特征。也證明了A*0201結(jié)合親和力與結(jié)合多種A2超型等位基因的傾向相關(guān)。
表14aA2超型分子之間的交叉反應(yīng)性

表14bA*0201結(jié)合肽的簡(jiǎn)并性

分析本分析的結(jié)果可詳細(xì)描述能結(jié)合HLA-A*0201和其它A2超型分子的肽的特性。A2超型分子不僅共有很大程度重疊的肽結(jié)合特異性，而且共有明顯重疊的肽結(jié)合組成成分。鑒定與簡(jiǎn)并性A2超型分子結(jié)合能力相關(guān)的肽配基的特征，為超型關(guān)系提供了合理解釋。
在先前研究中，分析了A*0201的肽結(jié)合特異性，構(gòu)建了詳細(xì)的基序包括次要錨定特征的鑒定。在本分析中，采用大10倍的數(shù)據(jù)庫，我們證實(shí)了數(shù)據(jù)并將分析延伸到包括8-和11-聚肽。總體上，A*0201對(duì)8-和11-聚肽的特異性與對(duì)9-和10-聚肽的很相似。例如，不論肽的大小，大部分對(duì)結(jié)合能力的負(fù)影響與次要錨定位置中存在帶電荷殘基相關(guān)，而大部分正影響與存在疏水殘基相關(guān)。確定對(duì)8-和11-聚肽的詳細(xì)基序應(yīng)能更完全的鑒定抗原表位。使用基于ARB值的算法大大促進(jìn)了A*0201結(jié)合肽的鑒定。在本分析中，采用了比以前大許多的數(shù)據(jù)庫，使算法系數(shù)精確。由于該較新的系數(shù)基于大許多的數(shù)據(jù)，它們?cè)诮y(tǒng)計(jì)學(xué)上更精確并且應(yīng)提供更有效確切的抗原表位預(yù)測(cè)。確實(shí)，近來的分析表明基于更大數(shù)據(jù)庫的修訂的A*0201 9-聚體多項(xiàng)式運(yùn)算法則，比基于小數(shù)據(jù)庫的舊運(yùn)算法則和中性網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)方法都更精確。除了提高抗原表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性(Ruppert，J.等，同前；Sidney，J.等，同前；Kondo，A.等，同前；Gulukota，K.等同前；Parker，K.C.等，“結(jié)合人MHC I類分子HLA-A2的肽的重要序列基序”，J.Immunol.1493580-3587(1992)和Milik，M.等，“預(yù)測(cè)特異性I型MHC結(jié)合肽序列的人造中性網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用”，Nature(Biotech)16753-756(1998))，明確主要和次要錨定位置的詳細(xì)的肽結(jié)合基序可合理設(shè)計(jì)最佳配基。例如，可鑒定在主要和/或次要位置攜帶亞最適殘基的天然順序。亞最適殘基可用最佳錨定殘基替換，產(chǎn)生結(jié)合親和力提高的抗原表位(Sidney，J.等，同前；Pogue，R.R.等，“HLA- A*0201-限制的人免疫缺陷病毒Pol肽氨基末端的改變提高了復(fù)合物的穩(wěn)定性和體外免疫原性”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，928166-8170(1995)和Bakker，A.B.等，“MHC I類結(jié)合能力提高的CTL表位的類似物誘導(dǎo)了識(shí)別野生型表位的抗黑色素瘤CTL”，Int.J.Cancer，70302-309(1997))。這種類型修飾后，不能誘導(dǎo)應(yīng)答的野生型肽或弱免疫原，可能成為高度免疫原性Pogue，R.R.等，同前；Bakker，A.B.，等，同前；Parkhurst，M.R.，等，“在HLA-A*0201-結(jié)合肽中經(jīng)修飾的黑色素瘤抗原gp100的肽促進(jìn)了黑色素瘤反應(yīng)性CTL的誘導(dǎo)”，J.Immunol.1572539-2548(1996)；Rosenberg，S.A.等，“用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人的合成肽疫苗的免疫學(xué)和治療評(píng)價(jià)”，Nature(Med)4321-327(1998)；Sarobe，P.等，“在次要HLA-A2.1結(jié)合位置氨基酸替代后提高了丙型肝炎病毒核心蛋白的CTL表位的體外能力和體內(nèi)免疫原性”，J.Clin.Invest.1021239-1248(1998)和Ahlers，J.D.等“通過修飾天然肽序列提高了HIV-1疫苗構(gòu)建物的免疫原性”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9410856-10861(1997))。這些類似物肽誘導(dǎo)的CTL已顯示在大部分情況下能識(shí)別表達(dá)野生型抗原序列的靶細(xì)胞。這個(gè)現(xiàn)象可能反映靶細(xì)胞識(shí)別表位結(jié)合所需的要求比激活原初T細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為效應(yīng)物所需的嚴(yán)謹(jǐn)性低(Cho，B.K.等，“記憶和原初CD8T細(xì)胞之間的功能差異”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962976-2981(1999)；Sykulev，Y.等，“靶細(xì)胞上的一種肽-MHC復(fù)合物可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的證據(jù)”，Immunity 4565-571(1996))。因此，本文描述的詳細(xì)基序不僅促進(jìn)對(duì)天然產(chǎn)生的CTL表位的鑒定，而且有利于設(shè)計(jì)結(jié)合能力和/或免疫原特性提高的基因工程表位。
也用單一替換類似物肽和肽文庫研究了其它A2超型分子的肽結(jié)合特異性。與前面報(bào)導(dǎo)一致(del Guercio，M-F，等，“肽抗原與多種HLA等位基因的結(jié)合得的明確A2-類超型”，J.Immunol.154685-693(1995)和(Sidney，J.等，“發(fā)現(xiàn)HLA I型超基序的實(shí)際、生化和進(jìn)化意義”，Immunol Today 17261-266(1996))；見NIH-NIAID合同NO1-AI-45241案卷的報(bào)告)，我們發(fā)現(xiàn)A2-超型分子的主要錨定基序非常相似。利用肽文庫得以詳細(xì)特征歸鑒定每個(gè)分子的次要錨定殘基的偏愛和厭惡。盡管每種A2-超型分子具有獨(dú)特的特異性，但可能鑒定到以共有序列模式為基礎(chǔ)的超基序。由于超基序描述了A2-超型分子中共有的肽配基的特征，預(yù)期可有效鑒定高到交度叉反應(yīng)的肽并顯示錨著固定的適當(dāng)策略，可調(diào)節(jié)肽配基的超型簡(jiǎn)并性。本分析進(jìn)一步的結(jié)果是產(chǎn)生了可在預(yù)測(cè)結(jié)合A*0202、A*0203、A*0206和A*6802肽的算法中用的系數(shù)。
由于迄今HLA A*0201在一般人群中和主要民族中都是最普遍的A2-超型等位基因，故所用的肽篩選策略首先集中在鑒定A*0201結(jié)合肽上。已確定超過70％的結(jié)合A*0201的肽也結(jié)合至少2種另外的A2-超型分子，結(jié)合其它A2-超型等位基因的傾向與A*0201結(jié)合親和力相關(guān)。
總之，本文所述數(shù)據(jù)提供了命名為A2-超型的一組HLA-A分子共有的肽結(jié)合特異性的正式證據(jù)。不僅這些分子識(shí)別它們肽配基的主要和次要錨定位置上的類似特征，而且它們享有很大程度的重疊性肽結(jié)合組成成分。證明這些分子享有很大程度的重疊性肽組成成分對(duì)設(shè)計(jì)潛在的疫苗構(gòu)建物有重要意義。確實(shí)，A2-超型在肽結(jié)合水平上的交叉反應(yīng)性也許有免疫相關(guān)性的想法已在許多研究中得到證明，感染性疾病(Khanna R.等“在EB病毒(EBV)致癌基因潛在膜蛋白1(LMP1)中細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的鑒定LMP1-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)EBV感染細(xì)胞的HLA A2超型-限制的免疫識(shí)別的證據(jù)”，Eur J Immunol，28451-458(1998)；Bertoletti，A.等，“乙型肝炎病毒核衣膜T細(xì)胞表位18-27的分子特征與HLAT細(xì)胞受體相互作用”，Hepatology261027-1034(1997)；Livingston，B.D.等，“用HBV核心18-27表位免疫在表達(dá)不同HLA-A2超型分子的人體中誘導(dǎo)了CTL應(yīng)答”，Hum Immunol 601013-1017，(1999)；Bertoni，R.等，“人組織相容性白血球抗原結(jié)合超基序預(yù)測(cè)在急性肝炎病人中廣泛交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)”，JClin Invest 100503-513(1997)；Doolan，D.L.等，“受多種HLA-A和HLA-B超型等位基因限制的P.falciparum的簡(jiǎn)并性細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位”，Immunity 797-112(1997))和癌癥(Fleischhauer，K.等，“多種HLA-A等位基因可呈遞人黑色素瘤抗原Melan-A/MART-1的免疫優(yōu)勢(shì)肽給肽特異性HLA-A*0201+細(xì)胞毒性細(xì)胞系”，JImmunol，157787-797(1996)；Rivoltini，L.等，“通過HLA-A2亞型結(jié)合和呈遞產(chǎn)生于黑色素瘤抗原MART-1和糖蛋白-100的肽對(duì)于以肽為基礎(chǔ)的免疫治療的意義”，J Immunol，1563882-3891(1996)；Kawashima，I.“癌癥免疫治療的多表位方法突體上皮腫瘤上表達(dá)的各種腫瘤相關(guān)抗原的幾種CTL表位的鑒定”，Hum Immunol591-14，(1998))。
實(shí)施例6預(yù)防性應(yīng)用的肽組合物本發(fā)明的疫苗組合物可用于防止人感染或治療癌癥。例如，可將含多種CTL和HTL表位的多表位肽表位組合物給予有感染HCV危險(xiǎn)的個(gè)體。該組合物可作為含多種表位的一種脂化多肽提供。此疫苗可包含弗氏不完全佐劑的含水載體中使用。初次免疫的肽劑量對(duì)70kg病人是約1至50,000μg每人劑量。初次使用疫苗后4周給予加強(qiáng)劑量，然后評(píng)估病人免疫應(yīng)答強(qiáng)度，采用的技術(shù)可測(cè)定PBMC樣品中表位特異性CTL細(xì)胞群的存在。其它加強(qiáng)劑量按所需給予。發(fā)現(xiàn)此組合物作為抗HCV感染預(yù)防注射即安全又有效。
另外，該多表位肽的組合物可按照本領(lǐng)域已知的方法和本文所述方法作為核酸給予。
上述討論旨在闡明本發(fā)明而不是限制其范圍。本發(fā)明的其它變化對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯然懂得的并包括在附加權(quán)利要求書中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)包括在參考文獻(xiàn)中。
權(quán)利要求
1.一種鑒定HLA-A2超基序限制肽的方法，其特征在于，所述方法包括使由8-11個(gè)氨基酸組成的肽與A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802和A*6901等位基因編碼的3種或多種HLA分子接觸；所述肽中從該肽N末端算起的第2位氨基酸是L、I、V、M、A、T或Q，C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T，測(cè)定IC50值；鑒定能結(jié)合至少3種HLA分子且IC50值小于500nM的肽，作為HLA-A2超基序限制肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是V、A、T或Q。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是L、I、M或Q。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是I或Q。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述C末端氨基酸是T。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肽衍生自HIV抗原、HBV抗原、HCV抗原、HPV抗原、PSA抗原、EB病毒抗原、KSHV抗原、拉沙病毒抗原、MT抗原、p53抗原、CEA抗原、TSA抗原、MAGE抗原或Her2/neu抗原。
8.一種鑒定免疫原HLA-A2超基序限制肽的方法，其特征在于，所述方法包括使由8-11個(gè)氨基酸組成的肽與A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802和A*6901等位基因編碼的3種或多種HLA分子接觸以形成肽/HLA-A2復(fù)合物；所述肽中從該肽N末端算起的第2位氨基酸是L、I、V、M、A、T或Q，C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T，測(cè)定所述肽/HLA-A2復(fù)合物是否能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答；鑒定在含有至少3種HLA分子的復(fù)合體中能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽，作為HLA-A2超基序限制肽。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是V、A、T或Q。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是L、I、M或Q。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是I或Q。
12.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。
13.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述C末端氨基酸是T。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述肽衍生自HIV抗原、HBV抗原、HCV抗原、HPV抗原、PSA抗原、EB病毒抗原、KSHV抗原、拉沙病毒抗原、MT抗原、p53抗原、CEA抗原、TSA抗原、MAGE抗原或Her2/neu抗原。
15.一種制造HLA-A2超基序限制肽的方法，其特征在于，所述方法包括提供感興趣抗原的氨基酸序列；鑒定所述序列中推定的T細(xì)胞抗原表位，其中推定的抗原表位由8-11個(gè)氨基酸組成，其中從該表位N未端算起的第2位氨基酸是L、I、V、M、A、T或Q，C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。制備感興趣抗原的包含該抗原表位的一個(gè)或多個(gè)肽片斷；使該肽與A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802和A*6901等位基因編碼的3種或多種HLA分子接觸；測(cè)定IC50值；和選擇能結(jié)合至少3種的HLA分子，IC50值小于500nM的肽，作為HLA-A2超基序限制肽。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是V、A、T或Q。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是L、I、M或Q。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是I或Q。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述C末端氨基酸是T。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其中抗原是HIV、HBV、HCV、HPV、PSA、EB病毒、KSHV、拉沙病毒、MT、p53、CEA、TSA、MAGE或Her2/neu。
22.一種制造免疫原HLA-A2超基序限制肽的方法，其特征在于，所述方法包括提供感興趣抗原的氨基酸序列；鑒定所述序列中推定的T細(xì)胞抗原表位，其中推定的抗原表位由8-11個(gè)氨基酸組成，其中從該表位N未端算起的第2位氨基酸是L、I、V、M、A、T或Q，C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。制備所述感興趣抗原的包括該抗原表位的一個(gè)或多個(gè)肽片斷；測(cè)定肽/HLA-A2復(fù)合物是否能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，選擇含有至少有3種HLA分子的復(fù)合物中能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽，作為HLA-A2超基序限制肽。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是V、A、T或Q。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是L、I、M或Q。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述肽的第2位氨基酸是I或Q。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述C末端氨基酸是L、I、V、M、A或T。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述C末端氨基酸是T。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抗原是HIV、HBV、HCV、HPV、PSA、EB病毒、KSHV、拉沙病毒、MT、p53、CEA、TSA、MAGE或Her2/neu。
全文摘要
描述了在攜帶A2超型等位基因的個(gè)體中有效的疫苗設(shè)計(jì)的方法。采用已知的A2－超型結(jié)合肽的單一氨基酸替換類似物和大的肽文庫大致地明確了A2－超型分子的肽結(jié)合特導(dǎo)性。雖然注意到每個(gè)分子具有獨(dú)特的偏愛性，但發(fā)現(xiàn)特異性有很大的重疊。在肽配基2位存在的疏水和脂肪族殘基L、I、V、M、A、T和Q通?？蔀锳2超型分子耐受。C－末端對(duì)L、I、V、M、A和T耐受。對(duì)肽結(jié)合有次要影響的檢驗(yàn)揭示存在等位基因的特異性偏愛，還鑒定到共有的特征，并用于明確A2超基序。共有的特征也與交叉反應(yīng)性相關(guān)；發(fā)現(xiàn)超過70％高親和力結(jié)合A*0201的肽能結(jié)合至少2種其它A2超型分子。最后，提供了在預(yù)測(cè)結(jié)合于A2超型分子的肽的算法中使用的系數(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1653337SQ02804248
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月29日
發(fā)明者J·悉尼, A·塞特, H·M·格雷, S·索斯伍德 申請(qǐng)人:埃皮繆納股份有限公司