免疫調(diào)節(jié)疫苗的制作方法
【專利摘要】一種免疫調(diào)節(jié)疫苗，其包括-導(dǎo)向佐劑，其包括連接至TLR9配體和第一肽α-螺旋的至少抗CD32部分，和-免疫原，其具有至少一個(gè)表位和與第一α-螺旋纏繞的第二肽α-螺旋，一種用于制備疫苗的試劑盒，和一種致敏疫苗，其包括在藥物制劑中的連接至TLR9配體和肽的α-螺旋的至少抗CD32部分。
【專利說明】免疫調(diào)節(jié)疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)疫苗，其包括免疫原和與之連接、由此調(diào)節(jié)對(duì)免疫原的免疫 應(yīng)答的導(dǎo)向佐劑（directedadjuvant)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括免疫原性組合物的疫苗，所 述免疫原性組合物包括
[0002] -導(dǎo)向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體的抗⑶32部分，和
[0003] _免疫原，其結(jié)合至所述導(dǎo)向佐劑；
[0004] 其用于治療受試者以誘發(fā)針對(duì)免疫原的瞬時(shí)IgG免疫應(yīng)答。

【背景技術(shù)】
[0005] 對(duì)于包括變態(tài)反應(yīng)（allergy)、癌癥和自身免疫病等的免疫疾病，由Thl/Th2/ Thl7/Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫平衡調(diào)節(jié)及其在新免疫治療開發(fā)中的應(yīng)用起到重要作用。
[0006] Thl細(xì)胞（1型輔助T細(xì)胞）的特征在于產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子如IFN-y、IL-2和 TNF-0。Thl細(xì)胞參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。由Thl細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子刺激微生物病原體的 吞噬和破壞。幾種慢性炎性疾病已描述為Thl主導(dǎo)的疾病，即多發(fā)性硬化癥、糖尿病和類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎。
[0007] Th2細(xì)胞（2型輔助T細(xì)胞）的特征在于產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。 Th2細(xì)胞被認(rèn)為在變態(tài)反應(yīng)響應(yīng)中起作用。細(xì)胞因子如IL-4通常刺激抗體的產(chǎn)生。IL-5刺 激嗜酸性細(xì)胞應(yīng)答，也是免疫應(yīng)答的一部分。特應(yīng)性（atopy)和變態(tài)反應(yīng)被認(rèn)為是Th2主 導(dǎo)病況。
[0008] Thl/Th2或Thl7/Treg免疫失衡成為各種免疫疾病的原因。
[0009] 變態(tài)反應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)環(huán)境中的蛋白質(zhì)的超敏反應(yīng)。變應(yīng)原（allergen)為特應(yīng) 性患者在IgE抗體應(yīng)答隨后導(dǎo)致變態(tài)性反應(yīng)下應(yīng)答的抗原。復(fù)合體或融合蛋白中的抗原 可為環(huán)境變應(yīng)原（如室塵螨（housedustmite)、樺樹花粉（birchpollen)、草的花粉 (grasspollen)、貓抗原、蟑螂抗原），或食品變應(yīng)原（如牛奶、花生、蝦、大豆），或二者的 組合。IgE分子因其在效應(yīng)細(xì)胞（肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞（basophiles)和嗜酸性粒細(xì)胞 (eosinophiles))激活中的作用而是重要的。普遍接受的是，IgE還通過上調(diào)B細(xì)胞和樹突 細(xì)胞（DC)的抗原捕獲潛能（二者借助于低親和性受體（CD23)和高親和性受體（FeeRI)) 而在變態(tài)反應(yīng)性疾病的誘導(dǎo)階段起到重要作用。IgE抗體的消極作用可由變應(yīng)原特異性 IgG抗體抵消，例如因?yàn)樗鼈円龑?dǎo)免疫應(yīng)答遠(yuǎn)離B細(xì)胞轉(zhuǎn)向單核細(xì)胞和DC，且它們能夠通過 這些細(xì)胞上的FeeRI與FeyRIIb(⑶32b)共交聯(lián)來下調(diào)IgE受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的活化。 另外，它們與IgE分子競(jìng)爭(zhēng)變應(yīng)原結(jié)合位點(diǎn)。由此，可通過變應(yīng)原特異性IgG分子（特別是 IgGl)的誘導(dǎo)而治療、治愈和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。
[0010] 與IgE分子的大致3天的血清半衰期相比，IgG分子具有大約3周的血清半衰期。 IgE分子通過(nalfve)B細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間的相互作用誘導(dǎo)，這提供IL-4和IL-13并伴隨 ⑶40L表達(dá)，這在記憶B細(xì)胞和衆(zhòng)細(xì)胞中是將類別開關(guān)（classswitch)誘導(dǎo)為IgE所必需 的。相反，產(chǎn)生IFN-Y和IL-2的Thl細(xì)胞將類別開關(guān)誘導(dǎo)為IgG。因此，Thl而不是Th2 輔助T細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原應(yīng)答的誘導(dǎo)有益于預(yù)防、治療和治愈變態(tài)反應(yīng)性疾病。
[0011] 迄今為止，使用變應(yīng)原的若干種主動(dòng)免疫得到應(yīng)用。最常見的是所謂的"免疫治 療"，其依賴于以相對(duì)高濃度的變應(yīng)原頻繁免疫。該技術(shù)僅在少數(shù)變態(tài)反應(yīng)性疾病如蜂毒變 態(tài)反應(yīng)以及在鼻炎和結(jié)膜炎的某些情況中適度有效，最近某些報(bào)道已顯示在較溫和形式的 哮喘和過敏性皮炎中的有效性。更近一些，已施用其中將增加量的變應(yīng)原在相當(dāng)短的時(shí)間 范圍內(nèi)注射的快速免疫治療，其結(jié)果稍勝一籌。通常，皮下途徑用于變應(yīng)原給藥，但最近該 途徑已與口服或者甚至局部施用進(jìn)行了比較，結(jié)果一般是陽性的，但并不總是一致。不同的 免疫治療技術(shù)為Saint-Remy描述的一種技術(shù)（EP0178085和EP0287361)，其中使用了在體 外與相關(guān)變應(yīng)原復(fù)合的自身IgG抗體。該技術(shù)允許施用相當(dāng)少量的變應(yīng)原，并具有較少的 副作用。
[0012] 這些治療背后的機(jī)理尚未清楚。在傳統(tǒng)治療中，如果該治療誘導(dǎo)特異性IgG抗體 增加，則似乎存在有益效果，盡管不是每種特異性IgG的顯著增加都與成功的免疫治療相 關(guān)。之所以如此的可能觀點(diǎn)是IgG抗體對(duì)B細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的CD32的親和性 相對(duì)低。Saint-Remy法從患者選擇特異性IgG抗體，隨后將其于相關(guān)的變應(yīng)原體外混合。 這樣，它們確保變應(yīng)原不能與細(xì)胞或細(xì)胞上的其它抗體同種型如肥大細(xì)胞上的IgE自由反 應(yīng)。另外，它們聲稱抗獨(dú)特型（anti-idiotypic)抗體相對(duì)于特異性IgG分子升高，其此后 會(huì)防止變態(tài)反應(yīng)。
[0013] 在WO97/07218中記載了變應(yīng)原-抗⑶32融合蛋白。在該公報(bào)中，避免了分離特 異性IgG分子和這些IgG抗體對(duì)CD32的親和性低的問題，并且降低了使用完整的"IgE結(jié) 合"變應(yīng)原的傳統(tǒng)免疫治療的風(fēng)險(xiǎn)因素。然而，所聲稱的由于將含抗CD32的疫苗單獨(dú)導(dǎo)向 到樹突細(xì)胞所造成的Thl記憶應(yīng)答的誘導(dǎo)并沒有被證實(shí)。
[0014] W02007098934A1描述了能夠結(jié)合至TLR9和CD32的包括至少一個(gè)抗原的至少一個(gè) 表位的分子，其生產(chǎn)和其作為藥劑的用途，特別是用于變態(tài)反應(yīng)治療的用途。
[0015] 免疫調(diào)節(jié)不僅可在變態(tài)反應(yīng)性疾病的情況下起作用，而且還可在一系列其它疾病 中起作用。
[0016] 增強(qiáng)對(duì)感染劑（infectiousagents)如微生物病原體的免疫應(yīng)答是預(yù)防性或治療 性抗感染免疫治療的目標(biāo)。
[0017] 在腫瘤免疫治療中，目標(biāo)也是使用除了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)以外的腫瘤抗 原特異性T輔助型I(Thl)細(xì)胞。
[0018] 醫(yī)學(xué)上已知為惡性贅生物的癌癥是一組廣泛的各種疾病，它們?nèi)可婕皼]有調(diào)節(jié) 的細(xì)胞生長。在癌癥中，細(xì)胞不可控制地分裂和生長，形成惡性腫瘤，并侵襲身體的附近部 位。癌癥還可通過淋巴系統(tǒng)或血流擴(kuò)散至身體更遠(yuǎn)的部位。并不是所有的腫瘤都是癌性的。 良性腫瘤不是不可控地生長，不侵襲近旁組織，且不擴(kuò)散至全身。有超過200種折磨人類的 不同已知癌癥。
[0019] 確定癌癥的原因是復(fù)雜的。已知許多東西增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括使用煙草、某些感 染、輻射、缺乏身體運(yùn)動(dòng)、肥胖癥和環(huán)境污染物。這些可直接損傷基因或與細(xì)胞內(nèi)已存在的 遺傳缺陷組合而引起疾病。大約5至10%的癌癥是完全遺傳的。
[0020] 癌癥可以以多種方式檢測(cè)，包括某些體征和癥狀的存在、篩選試驗(yàn)或醫(yī)學(xué)影像。一 旦檢測(cè)到可能的癌癥，通過組織樣品的鏡檢來診斷。癌癥通常用化學(xué)治療、輻射治療和手術(shù) 治療。疾病生存的幾率根據(jù)癌癥的類型和位置以及開始治療時(shí)疾病的程度而大幅變化。雖 然癌癥可影響所有年齡的人群，并且少數(shù)類型的癌癥更常見于兒童中，但癌癥發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn) 通常隨年齡增加。2007年，全球范圍內(nèi)癌癥導(dǎo)致全部人類的約13%死亡（790萬）。比例隨 著更多人群的老齡化和隨著在發(fā)展世界中發(fā)生大眾生活方式的改變而升高。
[0021] 由于免疫系統(tǒng)基于自身與非自身之間的區(qū)別而對(duì)其遭遇的環(huán)境因素應(yīng)答，所以因 癌癥發(fā)病而出現(xiàn)的多種腫瘤細(xì)胞或多或少地耐受患者的自身免疫系統(tǒng)，這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞 本質(zhì)上是在沒有適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)控制下生長、分裂和擴(kuò)散的患者自身的細(xì)胞。
[0022] 免疫耐受或免疫學(xué)耐受為免疫系統(tǒng)不攻擊抗原的過程。在天然耐受或自身耐受 中，身體不增加對(duì)自體抗原（self-antigen)的免疫應(yīng)答。其以三種形式出現(xiàn)：中樞耐受、夕卜 周耐受和獲得的耐受。
[0023] 中樞耐夸1:
[0024] 中樞耐受發(fā)生在淋巴細(xì)胞發(fā)育期間并在胸腺和骨髓中運(yùn)行。這里，識(shí)別自體抗原 的T和B淋巴細(xì)胞在它們發(fā)育成完全免疫活性細(xì)胞之前被刪除，防止自身免疫。該過程在 胎兒生命中最活躍，但隨著不成熟淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生而貫穿整個(gè)生命繼續(xù)進(jìn)行。
[0025] 外周耐
[0026] 外周耐受為在T和B細(xì)胞成熟后發(fā)展并進(jìn)入外周的免疫學(xué)耐受。離開胸腺的T細(xì) 胞相對(duì)但不是完全安全。某些將具有可對(duì)自體抗原響應(yīng)的受體（TCRs)，所述自體抗原以足 夠高的濃度存在，以致它們能夠結(jié)合至在胸腺中T細(xì)胞不會(huì)遇到的"弱"受體（例如，組織 特異性分子，諸如朗格罕氏島（isletsofLangerhans)、腦或脊髓中的那些）。胸腺中逃脫 胸腺內(nèi)陰性選擇的那些自身反應(yīng)性T細(xì)胞可造成細(xì)胞損傷，除非它們被刪除或被有效地控 制在外周組織中。已知存在沉默此類潛在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的幾種反饋機(jī)制。它們包括下 述：無變態(tài)反應(yīng)性（anergy)、活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、外周抑制。
[0027] 獲得的或誘導(dǎo)的耐
[0028] 獲得的或誘導(dǎo)的耐受是指免疫系統(tǒng)對(duì)外部抗原的適應(yīng)，其特征在于胸腺組織對(duì)在 其它環(huán)境中會(huì)很可能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或體液免疫的給定抗原的特異的非反應(yīng)性。最重 要的天然類型的獲得的耐受之一為妊娠免疫耐受，此時(shí)胎兒和胎盤必須被母體免疫系統(tǒng)耐 受。
[0029] 靶向腫瘤相關(guān)抗原的免痔治療:
[0030] 癌癥免疫治療是使用免疫系統(tǒng)來排斥癌癥。主要的前提是刺激患者的免疫系統(tǒng) 來攻擊引起疾病的惡性腫瘤細(xì)胞。這可通過患者的主動(dòng)免疫（例如，通過給藥細(xì)胞癌癥疫 苗，如普羅文奇（Provenge)，Dendreon，西雅圖，華盛頓，US)4來進(jìn)行，在該情況中患者的自 身免疫系統(tǒng)訓(xùn)練為識(shí)別腫瘤細(xì)胞作為要摧毀的靶標(biāo)，或者通過給藥治療性抗體作為藥物來 進(jìn)行，在該情況中患者的免疫系統(tǒng)被招募來通過治療性抗體來破壞腫瘤細(xì)胞?；罨颊呙?疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的另一方法為使用所謂的腫瘤相關(guān)抗原（TAA's)，該腫瘤相關(guān)抗原為自身 蛋白質(zhì)，其在健康正常細(xì)胞中在一定程度上表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，或者它們包括使 腫瘤細(xì)胞增殖的細(xì)胞激素/生長因子 5。這些TAAs制成制劑并以免疫原性的方式呈遞至體 內(nèi)，以使免疫系統(tǒng)將建立應(yīng)答，盡管事實(shí)是這些蛋白質(zhì)是自身的。很明顯，該方法僅對(duì)患者 已發(fā)育外周或獲得的耐受所對(duì)抗的TAAs有用。當(dāng)識(shí)別TAA的T和B細(xì)胞已從免疫學(xué)組庫 (immunologicalrepertoire)中刪除時(shí)，主動(dòng)癌癥免疫治療并不是一個(gè)選項(xiàng)。
[0031] 胃泌素:
[0032] 可用作治療消化系統(tǒng)癌癥（gastrointestinalcancers)如胰腺癌的祀標(biāo)的自 身抗原（autoantigen)(激素/生長因子）的實(shí)例為小胃泌素（littlegastrin) (G17)6A 另外，G17的中和還可有益于任意胃泌素相關(guān)的病況，包括胃潰瘍、胃食管反流?。℅astro EsophagealRefluxDiseas,GERD)1(1，這是由于胃的pH受胃泌素調(diào)控，而對(duì)于終末期腎衰竭 (EndStageRenalFailure,ESRF)n，貝丨」是由于在ESRF患者中胃泌素在高于正常濃度下循 環(huán)。
[0033] US5023077描述了免疫原性組合物和用于治療和預(yù)防胃和十二指腸潰瘍病的方 法，該免疫原性組合物基于胃泌素肽，該胃泌素肽偶聯(lián)至免疫原性載體，例如白喉類毒素、 破傷風(fēng)類毒素、鑰孔戚血藍(lán)蛋白（keyholelimpethemocyanin)或牛血清白蛋白。
[0034] 胃泌素在胃腸道具有一些重要的功能，兩個(gè)最重要的是刺激胃腸道 中的酸分泌和刺激胃腸道中的細(xì)胞生長。激素以至少兩種分子形式存在， 十七胃泌素（heptadecagastrin)，所謂的小胃泌素（〃G17〃），和三十四胃泌素 (tetratriacontagastrin) (〃G34〃），其根據(jù)每個(gè)分子中的氨基酸殘基（〃AA〃）數(shù)命名，其中 G17構(gòu)成G34的17個(gè)氨基末端（"N-末端〃）。
[0035] US5609870描述了抗-G17免疫原的制備，這在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗其自身G17的不 與G34反應(yīng)的抗體，所述制備包括使由對(duì)應(yīng)于G17的N末端氨基酸序列直至其C末端的氨 基酸殘基數(shù)為12的片段序列組成的肽綴合至間隔子肽，所述間隔子肽綴合于免疫原性載 體如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、鑰孔戚血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。
[0036] 免痔平衡:
[0037] 受Thl/Th2/Thl7/Treg細(xì)胞調(diào)控的免疫平衡在免疫治療開發(fā)中扮演重要作用。
[0038] 自身免疫病中需要調(diào)控Thl/Th2/Thl7/Treg失衡，g卩，在免疫系統(tǒng)攻擊自身組織 的情況下。
[0039] TLR9 的作用：
[0040]Toll-樣受體（TLRs)是一類在固有免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。它們是單 鏈、跨膜的非催化性受體，通常在細(xì)胞表面上和崗哨細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的內(nèi)吞小 泡中表達(dá)。TLR識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs)(其為結(jié)構(gòu)上保守的分子，源自微生物）， 并且起始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以誘導(dǎo)固有免疫和隨后的適應(yīng)性免疫所需的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
[0041] 各種TLR顯示不同的表達(dá)模式。該基因傾向于在免疫細(xì)胞富集的組織中表達(dá)，例 如腎臟、淋巴結(jié)、骨髓和外周血白細(xì)胞。
[0042]已在人類和小鼠中共鑒定出了十三種TLR(簡(jiǎn)單命名為TLRl至TLR13，并且已經(jīng)在 其它哺乳動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)了這些中的許多的TLR的等同形式。然而，不是小鼠中的每個(gè)TLR 受體也都發(fā)現(xiàn)于人類中，反之亦然。另外，不是每個(gè)TLR受體的配體和功能是已知的，例如 TLR10為具有未知功能的孤兒受體（orphanreceptor)。
[0043] TLR受體的活化已用于治療各種疾病，例如TLR9被藥劑活化已顯示有益于治療變 態(tài)反應(yīng)和腫瘤。小鼠和人類中的研宄表明，TLR9的天然配體是DNA分子中未甲基化的CpG 序列。與細(xì)菌基因組或病毒DNA相比，CpG位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物基因組中相對(duì)稀少（?1% )。 TLR9由多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞例如樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷（NK)細(xì)胞表達(dá)。 然而，在健康人中，TLR9的表達(dá)僅限于漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDCs)和B細(xì)胞。該表達(dá)是細(xì)胞 內(nèi)的，位于核內(nèi)體小泡（endosomalcompartments)內(nèi)，通過結(jié)合至CpG基序富集的DNA來 起到警告免疫系統(tǒng)的病毒和細(xì)菌感染的作用。然而，在病理學(xué)狀態(tài)下，TLR9表達(dá)已報(bào)道還 位于細(xì)胞的細(xì)胞表面上12_14。
[0044] 已報(bào)道了許多不同的合成的TLR9激動(dòng)劑分子。激動(dòng)配體（TLR9活化）已分類成 二組：
[0045] 由CpGA類組成的組，特別是CpG-A⑶15寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"D"-型0DN。 此類TLR9激動(dòng)劑誘導(dǎo)強(qiáng)IFNa誘導(dǎo)和樹突細(xì)胞的最低成熟，且在本文中稱為"組1"TLR9配 體。實(shí)例為0DN221616:
[0046]GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQID48)
[0047] 由CpGB類組成的組，特別是CpG-B⑷17寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"K"-型0DN。 此類TLR9激動(dòng)劑誘導(dǎo)弱IFNa誘導(dǎo)和樹突細(xì)胞成熟，且在本文中稱為"組2"TLR9配體。實(shí) 例為 0DN200618;19:
[0048]TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQID49)
[0049] 由CpGC類組成的組，也稱作CpG-C2tl寡脫氧核苷酸（ODN)。此類TLR9激動(dòng)劑誘 導(dǎo)IFNa和未成熟樹突細(xì)胞的成熟，且在本文中稱為"組3"TLR9配體。實(shí)例為0_M36221:
[0050] TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQID69)
[0051] 迄今為止記載的TLR9的所有配體基于核苷酸。盡管TLR9特異性抗體已報(bào)道并用 于闡明受體的存在和位置，但這些分子還未描述為TLR9的配體，沒有任何TLR9活化或抑制 活性的報(bào)道。
[0052]⑶32的作用：
[0053] ⑶32強(qiáng)表達(dá)于單核細(xì)胞/樹突細(xì)胞以及B細(xì)胞上，因而此類分子被設(shè)計(jì)為將免疫 應(yīng)答導(dǎo)向重要的免疫細(xì)胞，意欲防止B細(xì)胞的抗原呈遞，而促進(jìn)尤其是樹突細(xì)胞（DCs)的抗 原呈遞，當(dāng)充分刺激時(shí)后者導(dǎo)致Thl對(duì)抗原應(yīng)答的誘導(dǎo)。有至少兩種類型的DC:骨髓樣樹 突細(xì)胞（mDC)和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDC)，已導(dǎo)致DCl和DC2細(xì)胞的新理念。在該理念下， DCl細(xì)胞在抗原特異性刺激之后促進(jìn)Thl細(xì)胞發(fā)育的誘導(dǎo)，DC2細(xì)胞支持Th2細(xì)胞的發(fā)育。 單核細(xì)胞衍生的DC(或mDC)通常被認(rèn)為是DCl類型，而pDC被認(rèn)為是DC2型。兩種類型的 DC表達(dá)⑶32a并將誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答；然而，并不保證結(jié)果將是Thl類型。事實(shí) 上，在變態(tài)反應(yīng)性供體中，Th2應(yīng)答是更有可能的。重要的是，pDC表達(dá)TLR9受體，TLR9受 體結(jié)合CpG-ODN(含有未甲基化的CpG基序的寡脫氧核苷酸（ODN))。該受體在pDC中的活 化導(dǎo)致非常強(qiáng)的IFN-a和IL-12生產(chǎn)，這促進(jìn)Thl誘導(dǎo)并因而將潛在的DC2轉(zhuǎn)化成DCl細(xì) 胞。
[0054] 因此，此類分子可將TLR9受體在pDC中的活化與抗原特異性Thl細(xì)胞的特異性刺 激和誘導(dǎo)相結(jié)合。
[0055] 在腫瘤免疫治療中，特定的目標(biāo)是使用除細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞（CTL)以外的腫瘤 抗原特異性T輔助型I(Thl)細(xì)胞。
[0056]卷曲螺方定（Coiledcoils)：
[0057] 卷曲螺旋由蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)基序構(gòu)成，其中2-7個(gè)a-螺旋纏繞在一起類似于繩 索的股線；二聚體和三聚體是最常見的類型。卷曲螺旋螺旋體已用于使產(chǎn)生異二聚體的卷 曲螺旋結(jié)構(gòu)域的Fv抗體片段穩(wěn)定化22。
[0058] 復(fù)合蛋白質(zhì)分子（proteinaceousmolecules)的穩(wěn)定性和折疊結(jié)構(gòu)在設(shè)計(jì)免疫原 時(shí)是至關(guān)重要的。因此，本發(fā)明的目的為提供具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)用于調(diào)節(jié)對(duì)特定免 疫原的免疫應(yīng)答的疫苗。
[0059] 進(jìn)一步需要提供改進(jìn)的靶向胃泌素和胃泌素依賴的病況的免疫治療。因而，本發(fā) 明的目的為提供具有改進(jìn)的免疫原性、穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)以調(diào)節(jié)對(duì)特定胃泌素表位的免疫應(yīng)答 的疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0060] 本發(fā)明通過所要求保護(hù)的主題解決。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明，提供有免疫調(diào)節(jié)疫苗，所述免疫調(diào)節(jié)疫苗包括
[0062] -導(dǎo)向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a-螺旋的抗⑶32部分，和
[0063] -免疫原，其具有至少一個(gè)表位和與第一肽a-螺旋纏繞的第二肽a-螺旋。
[0064] 具體地，所述表位為T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的具體方面，所述第一和第二肽a_螺旋各自包括3-5個(gè)氨基酸重復(fù) 的氨基酸基序，以小于KT6M的KcU優(yōu)選小于KT7M的KcU更優(yōu)選小于KT8M或KT9M的Kd彼 此特異性結(jié)合。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的另外的具體方面，所述抗CD32部分選自由抗CD32抗體、優(yōu)選靶 向⑶32a的抗體片段和肽組成的組?？贵w片段具體可例如為Fab、Fv、scFv、dAb、F(ab)2 或Fcab片段，或任何其它可能的實(shí)體，只要其特異性結(jié)合至受體并在結(jié)合后內(nèi)在化 (internalized)艮P可。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，TLR9配體為選自由CpGA類組成的組的TLR9激動(dòng)劑，特 別是CpG-A⑶23寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"D" -型0DN。此類TLR9激動(dòng)劑誘導(dǎo)強(qiáng)IFNa 誘導(dǎo)和最低樹突細(xì)胞成熟，且在本文中稱為"組1"TLR9配體。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，TLR9配體為由CpGB類組成的組的TLR9激動(dòng)劑，特別是 CpG-B(K)24寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"K" -型0DN。此類TLR9激動(dòng)劑誘導(dǎo)弱IFNa誘導(dǎo) 和樹突細(xì)胞成熟，且在本文中稱為"組2"TLR9配體。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，TLR9配體具體為由CpGC類組成的組的TLR9激動(dòng)劑，也 稱作CpG-C25 ;26寡脫氧核苷酸（ODN)。此類TLR9激動(dòng)劑誘導(dǎo)IFNa和未成熟樹突細(xì)胞的成 熟，且在本文中稱為"組3 "TLR9配體。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述TLR9配體具體為模擬任意CpGA、B或C類寡脫氧核 苷酸的免疫刺激肽，即特異性結(jié)合至TLR9具有活化、激動(dòng)功能的肽。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，TLR9配體為選自由抑制性O(shè)DNs27 ;28寡脫氧核苷酸（有時(shí) 稱為抑制性CPGs)組成的組的TLR9拮抗劑，例如，包含由CCx(非-C)(非-C)xxGGG(X=任 意堿基）29組成的組的抑制性基序的那些。特異性抑制性O(shè)DNs已被證實(shí)不誘導(dǎo)IFNa，也不 誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟，還阻礙通過TLR9的激動(dòng)劑的活化。
[0072] 此類TLR9激動(dòng)劑或詰抗劑可在以適當(dāng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)中確定，該試驗(yàn)測(cè)定 IFNa或者標(biāo)記物⑶80、⑶83和⑶86至少之一的穩(wěn)定表達(dá)，反映了未成熟樹突細(xì)胞（DC)的 成熟。為此，如Tel等人3(1所述將漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDCs)從健康供體的血液中純化，并 隨后用適當(dāng)濃度的TLR9配體溫育。24h后，使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA實(shí)驗(yàn)方案在上清液中測(cè)定IFNa。 為了確定細(xì)胞的成熟狀態(tài)，在與TLR9配體溫育前后使用標(biāo)準(zhǔn)FACS步驟用商購可得的特異 性抗體染色表達(dá)CD80、CD83或CD86的pDC。
[0073]IFNa的誘導(dǎo)可由IFNa表達(dá)水平和相對(duì)于參考水平的相應(yīng)增加來確定。相對(duì)于非 刺激細(xì)胞的增加可與由已確定的針對(duì)如由組1、2或3TLR9配體所定義的各類型CpG的參考 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)水平相比較，并典型地在相應(yīng)參考的30%和300%之間，優(yōu)選至少100%，更優(yōu) 選至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0074] 未成熟的樹突細(xì)胞的成熟可通過⑶80、⑶83和⑶86的任意標(biāo)記物的表達(dá)水平來 確定。相對(duì)于非刺激細(xì)胞的相應(yīng)增加可與由已確定的針對(duì)如由組1、2或3TLR9配體所定義 的各類型CpG的參考誘導(dǎo)的誘導(dǎo)水平相比較，且典型地在相應(yīng)參考的30%和300%之間，優(yōu) 選至少100%，更優(yōu)選至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0075] 具體地，組1和3的TLR9激動(dòng)劑將導(dǎo)致IFNa表達(dá)增加，組2和3的TRL9激動(dòng)劑 將導(dǎo)致任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表達(dá)增加。甚至在組1-3各自的TLR9激動(dòng)劑 的存在下，TLR9拮抗劑將導(dǎo)致IFNa表達(dá)降低和任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表達(dá) 降低。
[0076] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，免疫原源自
[0077] _用于癌癥疾病的免疫治療的腫瘤相關(guān)抗原，或者
[0078]-用于傳染病的免疫治療的病原體，或者
[0079] _用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療的變應(yīng)原。
[0080] 此類疫苗典型地為免疫刺激疫苗，例如，刺激體液和T-細(xì)胞（Thl)免疫應(yīng)答。
[0081] 免疫刺激疫苗的該實(shí)施方案具體采用為TLR9激動(dòng)劑的TLR9配體。在該情況下疫 苗主要誘導(dǎo)Thl對(duì)免疫原的應(yīng)答。
[0082] 具體地，所述抗CD32部分靶向CD32a，優(yōu)選具有Kd彡KT6M,更優(yōu)選小于KT7M或小 于KT8M的高親和性。
[0083] 更具體地，所述抗⑶32部分為特異性或選擇性的⑶32a結(jié)合劑，S卩，不靶向⑶32b 或以Kd>10_6M，優(yōu)選高于10_5M，，更優(yōu)選高于KT4M的低親和性靶向⑶32b。結(jié)合至⑶32a和 Q)32b的差別親和性（differentialaffinity)優(yōu)選至少llog，更優(yōu)選至少21ogs或至少 31ogs，或者較高的Kd值差別。
[0084] 在進(jìn)一步采用TLR9激動(dòng)劑的免疫刺激疫苗中典型地使用與⑶32a而不是⑶32b 結(jié)合為特別優(yōu)選高親和性或高差別親和性的抗CD32部分。進(jìn)一步優(yōu)選此類疫苗采用選自 一系列腫瘤靶標(biāo)或病原體靶標(biāo)的免疫原，其中Thl應(yīng)答和特異性IgG抗體對(duì)于與疾病有效 斗爭(zhēng)是必須的。
[0085] 根據(jù)可選的實(shí)施方案，所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b二者，具有Kd彡KT6M 的高親和性，優(yōu)選高于KT7M的親和性，更優(yōu)選高于KT8M的親和性。在進(jìn)一步采用TLR9激 動(dòng)劑的疫苗中典型地使用與CD32a和CD32b二者的結(jié)合為特別優(yōu)選的高親和性的抗CD32 部分。進(jìn)一步優(yōu)選此類疫苗采用選自一系列變態(tài)反應(yīng)靶標(biāo)的免疫原，其中獲得了Th2應(yīng)答 的重新導(dǎo)向以得到Thl應(yīng)答。典型地，不優(yōu)選對(duì)疫苗自身的抗體。另外，特異性疫苗優(yōu)選以 與結(jié)合至⑶32a大致相同的親和性結(jié)合至⑶32b。
[0086] 與特異性靶向任意⑶32a或⑶32b或⑶32a和⑶32b二者的抗⑶32部分的結(jié)合 親和性可以適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)確定，例如典型的ELISA，其使用商購可得的HIS標(biāo)記的重組形式的 CD32a和CD32b，涂布至Ni-NTAELISA板，例如Ni-NTAHisSorbPlates(Qiagen,Austria)。 抗CD32部分可生物素化并由此可使用鏈霉親和素-HRP或鏈霉親和素AP和適當(dāng)?shù)牡孜?來檢測(cè)?？蛇x地，該部分可在FACS試驗(yàn)中使用表達(dá)⑶32a而不是⑶32b的U937細(xì)胞（如 ATCC:CRL1593)，和表達(dá)CD32b而不是CD32a的EBV轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞，如vanReijsen等人31 記載的CFB4:2來檢測(cè)。
[0087] 根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，免疫原源自
[0088] -用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療的變應(yīng)原，或者
[0089] -用于自身免疫病的免疫治療的人自身抗原。
[0090] 用于自身免疫病的此類疫苗典型地為免疫耐受疫苗，例如包括通過調(diào)控T細(xì)胞并 下調(diào)體液免疫應(yīng)答誘導(dǎo)針對(duì)免疫原的T細(xì)胞耐受。
[0091] 免疫耐受的該實(shí)施方案具體采用為1組TLR9激動(dòng)劑或?yàn)門LR9拮抗劑的TLR9配 體。在該情況下，疫苗將主要下調(diào)針對(duì)免疫原的Thl/2/17應(yīng)答，除了活化Treg細(xì)胞外。
[0092] 用于變態(tài)反應(yīng)的此類疫苗可為：
[0093] -例如通過采用為1組TLR9激動(dòng)劑或?yàn)門LR9拮抗劑的TLR9配體，調(diào)控T細(xì)胞并 下調(diào)體液免疫應(yīng)答來誘導(dǎo)針對(duì)免疫原的免疫耐受疫苗。在該情況下，疫苗將主要下調(diào)針對(duì) 免疫原的Thl/2/17應(yīng)答，除了活化Treg細(xì)胞外；
[0094] 或者
[0095] -免疫刺激疫苗，采用為組3TLR9激動(dòng)劑的TLR9配體誘導(dǎo)針對(duì)免疫原的Thl應(yīng)答， 同時(shí)防止針對(duì)疫苗的體液免疫應(yīng)答。
[0096] 根據(jù)免疫耐受疫苗的該實(shí)施方案，所述抗⑶32部分特異性靶向⑶32b或者⑶32a 和⑶32b二者，具有Kd<KT6M的高親和性，優(yōu)選具有Kd<KT7M的較高親和性，更優(yōu)選 Kd< 1(T8M。優(yōu)選抗⑶32部分特異性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0097] 同樣，對(duì)于用于變態(tài)反應(yīng)的免疫刺激疫苗，所述抗CD32部分特異性靶向CD32a 和CD32b，具有Kd<KT6M的高親和性，優(yōu)選具有更高的親和性，例如，Kd< 10_7M，更優(yōu)選 Kd< 1(T8M。優(yōu)選抗⑶32部分特異性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0098] 具體地，根據(jù)本發(fā)明提供疫苗，其中所述免疫原源自變應(yīng)原，用于變態(tài)反應(yīng)疾病的 免疫治療，和其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
[0099] 本發(fā)明的具體實(shí)施方案可由下表描述，表明根據(jù)結(jié)合CD32a和/或CD32b的特異 性和親和性的抗CD32部分的選擇、TLR9配體的類型和免疫原的類型。
[0100] 表1:具體實(shí)施方案：
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種免疫調(diào)節(jié)疫苗，其包括 -導(dǎo)向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 _免疫原，其具有至少一個(gè)表位和與所述第一肽螺旋纏繞的第二肽螺旋。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述第一和第二肽a -螺旋各自包括氨基酸基序 的3-5個(gè)氨基酸重復(fù)，以小于1(T6M的Kd彼此特異性結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其中所述抗CD32部分選自由抗CD32抗體、抗體片 段和肽組成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由CpG寡脫氧核 苷酸A、B和C類或者模擬任意所述CpG寡脫氧核苷酸的免疫刺激肽組成的組的TLR9激動(dòng) 劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用于癌癥疾病的免疫治療的腫瘤相關(guān)抗原，或者 -用于傳染病的免疫治療的病原體，或者 -用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療的變應(yīng)原。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述抗CD32部分靶向CD32a。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自變應(yīng)原，用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免 疫治療，且其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由抑制性O(shè)DN組 成的組的TLR9拮抗劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療的變應(yīng)原，或者 -用于自身免疫病的免疫治療的人自身抗原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述抗⑶32部分靶向⑶32b，或者⑶32a和 CD32b〇
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的疫苗，其用于變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療，其中所述抗 CD32部分靶向CD32a和CD32b。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的疫苗，其包括 -導(dǎo)向佐劑，其由包括SEQ ID 70的序列或由SEQ ID 70的序列組成的連接至所述第 一肽a -螺旋的抗⑶32部分組成，偶聯(lián)至SEQ ID 69的TLR9配體，優(yōu)選以1:1-18 (分子/ 分子）的比例；和 -免疫原，其包括連接至第二肽a-螺旋的SEQ ID 30的免疫原，優(yōu)選SEQ ID 75,或其 功能性活性變體，優(yōu)選其中除去Cys379的變體；或者所述免疫原由上述組成； 其中所述導(dǎo)向佐劑和所述免疫原通過第一和第二肽a _螺旋的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)彼此結(jié) 合。
13. -種試劑盒，其用于制備根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的疫苗，所述試劑盒包括 下列組分 -導(dǎo)向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 -免疫原，其具有至少一個(gè)T細(xì)胞表位和與所述第一肽a-螺旋匹配的第二肽a-螺 旋。
14. 一種致敏疫苗，其至少包括藥物制劑中的連接至TLR9配體和肽a -螺旋的抗⑶32 部分。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗，其中所述a -螺旋為卷曲螺旋雙鏈螺旋。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由CpG寡脫氧核苷 酸A、B和C類，或者模擬任意CpG寡脫氧核苷酸的免疫刺激肽組成的組的TLR9激動(dòng)劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的疫苗，其用于在利用根據(jù)權(quán)利要求1至10任 一項(xiàng)所述的免疫調(diào)節(jié)疫苗免疫治療患者之前預(yù)先免疫所述患者。
18. -種包括免疫原性組合物的疫苗，所述免疫原性組合物包括 -導(dǎo)向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體的抗⑶32部分，和 _免疫原，其結(jié)合至所述導(dǎo)向佐劑，優(yōu)選通過連接或親和結(jié)合； 其用于治療受試者以瞬時(shí)誘發(fā)導(dǎo)向免疫原的IgG免疫應(yīng)答，優(yōu)選具有接種時(shí)誘導(dǎo)的 特異性最大IgG滴度，接著在接種時(shí)6個(gè)月內(nèi)滴度減少至少30%、優(yōu)選至少40%、或至少 50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或多至100%。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的疫苗，其中所述滴度減少為在一系列接種中的最后接種 時(shí)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的疫苗，其中所述免疫原為或包括自體抗原的抗原或表 位。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中所述自體抗原選自由腫瘤相關(guān)抗原（TAA)、前激 素和激素組成的組，所述腫瘤相關(guān)抗原優(yōu)選由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞表面受體或可溶性 抗原，例如Her2/neu、干擾素 a (INFa)、表皮生長因子（EGF)、EGF受體（EGF-R)、表皮細(xì)胞 粘附分子（EpCAM)、a-甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、MUC-1或路易斯Y，所述前激素和 激素例如消化性激素、甲狀腺激或性激素中任一種，所述消化性激素包括胃泌素、胰泌素或 膜島素。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的疫苗，其中所述受試者為人類且所述自體抗原為人 源。
23. 根據(jù)權(quán)利要求18至22任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述IgG免疫應(yīng)答可逆。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104487083SQ201380037510
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月13日
【發(fā)明者】G·穆德 申請(qǐng)人:S-目標(biāo)療法有限公司