專利名稱：單劑基因工程乙肝疫苗緩釋微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物和藥物載體，可用于制備靶向控釋疫苗或藥物，屬于生物醫(yī)用高分子材料及靶向藥物控釋系統(tǒng)領(lǐng)域。
乙型肝炎(Hepatitis B，HB)是一種嚴(yán)重影響人類健康的世界性的傳染性疾病，到目前為止，全世界約有三分之一的人口(約20億)感染了乙肝病毒(HBV)，他們中約有3.5億人為慢性攜帶者，其中又有四分之一的人最終死于乙肝病毒感染引起的肝硬化及原發(fā)性肝癌。中國是亞洲唯一的乙型肝炎高發(fā)流行區(qū)，約有2億人口攜帶乙肝表面抗原(HBsAg)。迄今為止，尚無有效的治療藥物，所以預(yù)防接種尤為重要。安全、高效、價(jià)格低廉的疫苗是目前控制HBV感染的主要手段。1986年，通過基因工程獲得了重組乙肝疫苗，該疫苗具有免疫效果好(達(dá)85％-95％)，副作用更小，可大量獲得，價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。但是目前常用的基因重組乙肝疫苗均是以0、1、6月或0、1、2、12月的方式接種。接種費(fèi)用高，次數(shù)多，所需時(shí)間長、造成操作不方便，兒童和老人不易接受，易導(dǎo)致漏種率高、整體免疫效果差等問題。疫苗在體內(nèi)受到酸、堿及生物酶的作用，蛋白高級結(jié)構(gòu)易受到破壞，發(fā)生降解或排除體外，因此常需加大劑量和增加接種次數(shù)。同時(shí)，某些人群，如年老、肥胖、吸煙及免疫力低下的人等對重組乙肝疫苗反應(yīng)性較低。
本發(fā)明的目的是為了解決以上問題，開發(fā)新一代更方便可靠，免疫原性更強(qiáng)的長效控釋疫苗制劑?？诜忈?、控釋制劑是近代國內(nèi)外醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展的重要方向，由于開發(fā)周期短，投入較少，經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)低，且因產(chǎn)品技術(shù)含量增加而附加值顯著提高等優(yōu)點(diǎn)而被制藥行業(yè)看好。微球技術(shù)已廣泛用于藥物、多肽和蛋白疫苗的研究與開發(fā)?；诳缮锝到饩酆衔锏囊呙缥⑶蚩刂漆尫朋w系不僅能提高藥物的生物利用度，降低藥物的毒副作用，簡化給藥方式，而且藥物的釋放可通過聚合物的降解控制，進(jìn)行緩慢釋放或脈沖釋放，藥物釋放完畢后，載體材料不需取出。本發(fā)明制備的單劑注射或口服的可生物降解基因工程乙肝疫苗微球劑型，將克服普通疫苗制劑需多劑注射方能湊效的缺點(diǎn)，具有重要的意義。完成單劑基因工程乙肝疫苗緩釋微球制劑接種的費(fèi)用只有完成目前使用的重組乙肝疫苗接種費(fèi)用的三分之二，可大大地減輕人民群眾免疫接種的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且通過單劑注射或口服方式接種，兒童和老人更易接受，這可大大提高乙肝疫苗的普種率，從而可降低乙肝發(fā)病率，最終為中國乃至世界根治乙肝奠定基礎(chǔ)。
基因工程藥物和疫苗可生物降解聚合物緩釋微球的優(yōu)越性是十分明顯的，對這類靶向控制釋放體系的載體材料，國內(nèi)外曾采用聚苯乙烯和白蛋白、脂質(zhì)體等作為載體，前者不能生物降解，后者其生物降解周期短；顯然，這些材料用于制備緩釋靶向控釋制劑是不合適的。近年來，國外已著手研究以可生物降解聚合物免疫佐劑材料，如聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)等，來制備靶向藥物控制釋放體系，取得了一些令人滿意的結(jié)果。1984年，Allen(Am.J.Nat.1984，170，483-489)的研究證實(shí)用聚乳酸微粒作為抗原提呈系統(tǒng)的可能性；Eldridge(Molecular Immunology，1991，28，287-292)及O’Hagan(Immunology，1991，73，239)的研究證實(shí)口服具有特定粒徑及分布和表面性質(zhì)的微球，可通過消化道進(jìn)入人體，對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)達(dá)到良好的靶向性，同時(shí)具有緩釋抗原和佐劑效應(yīng)，能在較長時(shí)間內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫效應(yīng)；Singh(Vaccine，1997，15(5)，475)的研究證實(shí)用PLGA包裹乙肝病毒表面抗原(HBsAg)后，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及蛋白印跡法檢測微球中釋放的抗原，發(fā)現(xiàn)抗原幾乎沒有改變；Chang(J.Pharm.Sci，1996，65，129)的研究采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備破傷風(fēng)毒素(TT)PLGA微球，TT包封率超過90％，載藥量為0.48-0.9％；Tabata(Biometerials，1988，9，356-362)用粒徑分布窄、表面疏水的微球經(jīng)注射后發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞對粒徑為1.0-2.0微米的微球吞噬量大。但是，研究表明目前用于制備微球的可生物降解聚合物載體仍存在一些不足，如蛋白包裹量低(約1％左右)，口服后持續(xù)作用時(shí)間短，且免疫效果增強(qiáng)不明顯等。為了提高聚合物與抗原的親合性，本發(fā)明將親水性的聚乙二醇引入疏水性的聚乳酸鏈段中，制備出了雙親性聚-D，L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)。該材料已經(jīng)四川省工業(yè)衛(wèi)生研究所進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)評價(jià)，證明其具有無毒、安全和良好的生物相容性。鄧先模(J.Control.Release，1999，58，123-131)及李孝紅(J.Int.Pharm.1999，178，245-255)用PELA制備的微球蛋白包裹量可達(dá)3～5％，包裹效率在80％左右。
國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的用聚乳酸及其共聚物制備的微球，主要存在以下不足(1)作為藥物載體材料的聚乳酸及其共聚物是疏水性材料，對親水性的疫苗或藥物親合性不強(qiáng)，導(dǎo)致包裹量和包裹效率低；(2)工藝條件不穩(wěn)定；(3)具有生物活性的疫苗或藥物經(jīng)包裹后易喪失活性；(4)微球制備技術(shù)不穩(wěn)定，難于放大。
本發(fā)明的目的在于提供一種以雙親性的聚-DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)為載體材料，粒徑在5微米以下，表面光滑無粘連，疫苗攜載量為3％以上，不但能誘導(dǎo)比鋁佐劑乙肝疫苗持續(xù)時(shí)間更長，抗體水平更高的免疫效果，而且能誘導(dǎo)淋巴T細(xì)胞增殖的緩釋乙肝疫苗微球的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容(1)聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)載體材料的合成摒棄了以辛酸亞錫為催化劑制備PELA的傳統(tǒng)方法，而采用無毒的非錫催化劑，通過常壓溶液聚合法制備醫(yī)用PELA，載體材料的國產(chǎn)化可大大降低微球制劑的生產(chǎn)成本；(2)微球的制備采用乳液溶劑抽提法制備出了包裹量3～5％，包裹效率80％左右，動(dòng)物免疫增強(qiáng)效果明顯且具有良好靶向性基因工程乙肝疫苗緩釋制劑。
本發(fā)明微球基質(zhì)材料選用粘均分子量40,000，聚乙二醇(PEG)嵌段為10％(W/W)的PELA共聚物。與目前的其它可生物降解聚合物載體相比，它有更多優(yōu)點(diǎn)可提高微球中蛋白疫苗包裹量及包裹效率，提高微球中包裹蛋白的比活性及制備過程蛋白活性收率等。此方法對其它乳酸類共聚物也適用。但對本發(fā)明，選擇的乳酸類共聚物分子量應(yīng)在8×103～9×104范圍內(nèi)。
本發(fā)明的水相分散介質(zhì)，采用水解度為80％～95％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，PVA的重均分子量為10,000～100,000，其濃度范圍是1％～50％。
作為本發(fā)明基質(zhì)材料的有機(jī)溶劑是丙酮，甲醇和二氯甲烷或它們的混合溶劑。
作為本發(fā)明的功能輸入裝置采用電子恒速攪拌器，其攪拌速度為200～2000轉(zhuǎn)/分。
作為本發(fā)明的前期乳化時(shí)間為1～30分鐘。
采用本發(fā)明可制得具有良好生物相容性，可生物降解，疫苗結(jié)構(gòu)保持完整，通過單劑注射或口服就能獲得良好免疫效果，且在一定程度上還能治療乙肝的緩釋高分子微球。該微球粒徑在5微米以下，表面光滑無粘連(

圖1)，粒徑分布在0.5～5微米(圖2)，符合口服或注射靶向給藥的要求。
本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明由于采用雙親性的聚乳酸-聚醚嵌段共聚物(PELA)作為基因工程乙肝疫苗的載體，保證了載體中抗原的活性。采用改進(jìn)性雙乳液體系溶劑揮發(fā)法制備出了包裹量3～5％，包裹效率80％左右，動(dòng)物免疫增強(qiáng)效果明顯且具有良好靶向性基因工程乙肝疫苗緩釋微球制劑。本發(fā)明的微球勢必成為新一代給藥更方便，預(yù)防接種費(fèi)用更低，兒童和老人更易接受，免疫性更強(qiáng)的藥物制劑。它將對我國醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用，將促進(jìn)我國化學(xué)合成藥物、激素、疫苗、多肽和基因控制釋放劑型的研究開發(fā)。
下面為
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1粒徑小于5微米的共聚物微球的制備。準(zhǔn)確稱量PELA10g，溶于100ml二氯甲烷中。量取PVA水溶液(12％)150ml，裝入500ml的三頸瓶。開動(dòng)電子恒速攪拌，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分。將完全溶解的PELA溶液慢慢滴加入水相分散介質(zhì)。加料完畢后，轉(zhuǎn)速增至800轉(zhuǎn)/分，維持此攪拌速度25分鐘，然后將轉(zhuǎn)速降至200轉(zhuǎn)/分，持續(xù)攪拌8小時(shí)。待溶劑揮發(fā)完畢，將乳液離心分離，離心速度7000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間10分鐘，倒去上層清液，用蒸餾水洗滌沉淀。重復(fù)四次，收集白色沉淀，冷凍干燥，產(chǎn)率95％。
實(shí)施例2包裹量為3％，粒徑小于5微米的基因工程乙肝疫苗緩釋微球的制備。準(zhǔn)確量取4ml乙肝疫苗水溶液(3.0mg/ml)。準(zhǔn)確稱量PELA0.8g，溶于8ml二氯甲烷中。將共聚物有機(jī)溶液放入超聲分散裝置中，在超聲分散條件下，慢慢加入乙肝疫苗水溶液，超聲分散20分鐘得到油包水乳液。量取PVA水溶液(12％)15ml，裝入100ml的三頸瓶。開動(dòng)電子恒速攪拌，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分。按實(shí)施例1將油包水乳液滴加入水相分散介質(zhì)，轉(zhuǎn)速增至800轉(zhuǎn)/分，維持此攪拌速度25分鐘，然后將轉(zhuǎn)速降至200轉(zhuǎn)/分，持續(xù)攪拌8小時(shí)，然后按實(shí)施例1洗滌處理。冷凍干燥，產(chǎn)率95％。
附圖及說明圖1.采用本發(fā)明制備的PELA微球的掃描電子顯微鏡照片。用掃描電子顯微鏡(SEM美國AMRAY)觀察表面形態(tài)。圖2.采用本發(fā)明制備的PELA微球的粒徑分布圖。用激光粒度散射儀(島津SALD-2009)測定粒徑大小及分布。
權(quán)利要求
1.一種單劑基因工程乙肝疫苗緩釋微球的制備方法，其特征在于微球基質(zhì)為新型的聚-DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)，PELA的粘均分子量為8×103～9×104，基因工程乙肝疫苗為包裹對象，包裹量可達(dá)3％以上，包裹效率在80％左右，微球粒徑分布在5微米以下，微球作為攜載疫苗的載體，可用于對生物的靶向給藥及控制釋放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微球制備方法，其特征按以下步驟制備(1)PELA共聚物溶于有機(jī)溶劑中形成有機(jī)溶液；(2)在攪拌下將乙肝疫苗加入有機(jī)溶液；(3)在攪拌下將上溶液加入到水相分散介質(zhì)中；(4)在攪拌下待有機(jī)溶劑揮發(fā)完；(5)用水在離心條件下洗去水相分散介質(zhì)；(6)冷凍干燥得到基因工程乙肝疫苗緩釋微球粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的微球，其特征是聚乙二醇(PEG)在微球基質(zhì)中的重量百分比為5％～50％，PEG的分子量為4×102～2×104。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是有機(jī)溶劑為丙酮，甲醇和二氯甲烷或它們的混合溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是PELA有機(jī)溶液的濃度為1％～50％(W/W)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是水相分散介質(zhì)為聚乙烯醇(PVA)水溶液，PVA的水解度為80～95％，重均分子量為10,000～100,000，濃度為1％～50％。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是攪拌速度為200～2000RPM。
8.根據(jù)權(quán)利要求1制備的微球，其特征是通過單劑注射或口服該乙肝疫苗緩釋微球不但能獲得良好的免疫效果，且在一定程度上能達(dá)到治療乙肝的效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1制備的微球，其特征是該微球劑型具有能降低鋁佐劑的毒副作用，簡化給藥方式，提高疫苗的生物利用度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1制備的微球，其特征是該乙肝疫苗微球體系可用于多肽藥物、其它疫苗和基因藥物等控制釋放劑型的制備。
全文摘要
本發(fā)明用可生物降解的聚－DL－乳酸－聚乙二醇嵌段共聚物(Poly－dl－lactide－b－polyethylene glycol,PELA)作為疫苗載體材料。以雙乳液體系溶劑抽提法,在機(jī)械攪拌下制備微球。微球外觀規(guī)整、光滑,粒徑大小和分布可控?？乖靠蛇_(dá)3%以上,包裹效率在80%左右。該發(fā)明可提供給藥方便,安全,接種一次就能奏效的長效緩釋乙肝疫苗微球劑型。
文檔編號A61K47/32GK1370601SQ01107158
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月22日
發(fā)明者周紹兵, 李孝紅, 鄧先模 申請人:中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所