專利名稱：一種制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
豬細小病毒病(Porcineparvo viurs,PPV)是因感染豬細小病毒所致,可引起豬的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒和胚胎的感染和死亡，而母體通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。在世界各地的豬群中，該病毒普遍存在，在大多數(shù)豬場一般呈地方性流行或散發(fā)，而且很難根除給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。PPV的感染尚無有效的治療方法，因此，該病的預防免疫就顯得更為重要。公認使用疫苗是預防豬細小病毒病、提高母豬繁殖率的有效方法。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、成本低、產(chǎn)生抗體時間長、不需要低溫保存的優(yōu)點，被廣泛應用。目前中國生物制品行業(yè)生產(chǎn)豬細小病毒大多是采用貼壁依賴性細胞，如豬睪丸傳代細胞ST、豬腎細胞PK-15、豬腎細胞IBRS-2，多采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)，該工藝雖已沿襲數(shù)年，但難以擺脫效價不穩(wěn)定，批間差異大，病毒滴度低等弊病，極大地限制了豬細小病毒病滅活疫苗的質(zhì)量與產(chǎn)量。近幾年，隨著獸用疫苗行業(yè)的發(fā)展，生物反應器被廣泛關注，利用生物反應器替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝已成為行業(yè)發(fā)展的趨勢。生物反應器作為一種新型工具，能有效提高細胞產(chǎn)量，穩(wěn)定疫苗批間差異，也被應用于規(guī)?；a(chǎn)豬細小病毒疫苗。專利《應用生物反應器工業(yè)化生產(chǎn)豬細小病毒疫苗》(專利號ZL 201010282134.9)中公布了一種應用攪拌式生物反應器生產(chǎn)豬細小病毒的方法。專利《一種豬細小病毒滅活疫苗的制備方法》(專利號ZL 201010277502.0)中公布了一種應用美國NBS公司生產(chǎn)的生物反應器生產(chǎn)培養(yǎng)細胞進而生產(chǎn)豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其培養(yǎng)體積達到了 40L。但是，應用激流灌注式生物反應器生產(chǎn)豬細小病毒病滅活疫苗的方法未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術之缺陷提供一種利用激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法。本發(fā)明所述技術問題是由以下技術方案實現(xiàn)的。一種制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反應器為培養(yǎng)系統(tǒng)，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵、第二蠕動泵，第一硅膠管、第二硅膠管、激流罐、灌注袋、有孔硅膠管和聚酯纖維紙片載體；所述灌注袋為內(nèi)含聚酯纖維紙片載體的細胞培養(yǎng)袋，兩個灌注袋結構與功能完全相同，以相同的方式與激流罐連接，通過外源泵實現(xiàn)物質(zhì)交換； 滅活疫苗的制備按以下步驟進行:a.制苗用細胞的培養(yǎng)
將細胞懸液即種子細胞和細胞生長液的混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋(6)，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體(8)上，接種密度為每克載體接種0.8 1.2X IO7個細胞，設定設備參數(shù):溫度Tl:37.5 38°C、T2:43 46°C、T3:35.5 37°C，pH -J.2
7.8, DO:30% 70%、振蕩速度40 55r/min，空氣流量100ml/min 1000ml/min，啟動細胞培養(yǎng)程序，進行細胞培養(yǎng)，得到制苗用細胞；
b.病毒接種與培養(yǎng)
當細胞單日耗糖趨于平穩(wěn)時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內(nèi)液體，將豬細小病毒種毒接種制苗用細胞，設定設備參數(shù):溫度Tl:35 38°C、T2:37 40°C、T3:34 36°C，pH:7.3 7.8，DO:30% 70%,振蕩速度 35 50r/min，空氣流量 400 ml/min 4000ml/min,
啟動病毒培養(yǎng)程序，擴增培養(yǎng)豬細小病毒；
c.病毒液收獲
病毒培養(yǎng)40 42h后，收獲激流罐(5)與灌注袋(6)內(nèi)的病毒液，將灌注袋(6)反復凍融2 3次后收獲上清液，混合后-20°C保存?zhèn)溆茫粰z測病毒液效價和血凝價；
d.病毒液滅活
收獲的病毒液中加入滅活劑，滅活病毒；
e.疫苗制備
滅活的病毒液加入佐 劑，乳化制備成豬細小病毒病滅活疫苗。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟a中，種子細胞為豬腎細胞IBRS-2或豬睪丸傳代細胞ST，均為經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的細胞，應用有限稀釋法將待篩選細胞進行單克隆化，擴大培養(yǎng)建立單克隆化細胞庫，通過血凝和TCID5tl篩選豬細小病毒疫苗株的高適應性單克隆化細胞株。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟a中，細胞培養(yǎng)過程中采用階段流加方式補充細胞生長液，當殘?zhí)橇康陀?g/L時，流加補充細胞生長液，流加量以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準，當培養(yǎng)液體積達到有效培養(yǎng)體積時，進行換液。 上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟a中，逐日增大空氣流量，每24時增加 100ml/min 1000ml/min。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟b中，豬細小病毒種毒是經(jīng)過蝕斑法純化篩選的優(yōu)良種毒。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟b中，病毒接種前將種毒混于細胞維持液中，種毒與細胞維持液按V/ν為1% 3%混合，病毒接種時將混有病毒液的細胞維持液泵入反應器系統(tǒng)中，無需吸附，直接啟動病毒培養(yǎng)程序擴增培養(yǎng)病毒。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟b中，病毒培養(yǎng)12h時開始持續(xù)流加補充含η倍濃縮DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準；所述η等于2 5。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，所述η倍濃縮DMEM液配制方法為:1份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成IXDMEM液后，再加入(η-l)份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解即成；所述η等于2 5。上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟e中，滅活的病毒液中按V/V 6 13%加入吐溫-80制備成水相，在進口白油中按V/V 7 11%加入司本-80制備成油相，將水相與油相按V/V I:2比例混合后乳化，制備成豬細小病毒病滅活疫苗。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
1.在本發(fā)明中，制苗用細胞經(jīng)過純化篩選，提高了細胞對病毒的敏感性，保證了種子細胞的狀態(tài)均一，減小批次間差異，確保生產(chǎn)工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。2.在本發(fā)明中，與常規(guī)激流灌注式生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)相比，增加了一個灌注袋，有效增大了細胞貼壁面積，細胞數(shù)量增加近一倍，大幅提高病毒液產(chǎn)量。3.本發(fā)明細胞培養(yǎng)過程中逐日增大空氣流量，加快系統(tǒng)內(nèi)氣體循環(huán)，有利于培養(yǎng)液內(nèi)CO2的溢出，減少NaHCO3的使用量。4.本發(fā)明接種的豬細小病毒經(jīng)蝕斑法純化篩選，該毒株增殖能力強，免疫原性好，既增加了半成品毒液的滴度，又提升了成品疫苗的免疫效果。 5.本發(fā)明中，豬細小病毒接種時采用同步接種法，無需吸附，簡化操作，節(jié)省人力。6.本發(fā)明使用的濃縮營養(yǎng)液，可以倍增多種氨基酸含量，為病毒繁殖提供了充足的營養(yǎng)，有利于提高 病毒產(chǎn)量。7.本發(fā)明所采用乳化工藝參數(shù)為經(jīng)過篩選摸索的優(yōu)化方案，能保證成品疫苗的最佳乳化粒徑，有利于抗原的提早釋放及長期穩(wěn)定釋放，提升疫苗的免疫效果。


圖1為激流灌注式生物反應器的液體循環(huán)系統(tǒng)組成示意 圖2為本發(fā)明的工藝路線 圖3兩種乳化工藝穩(wěn)定性對比(其中,A為本發(fā)明乳化工藝，8000r/min離心20分鐘,無水相析出為常規(guī)乳化工藝，8000r/min離心20分鐘，管底析出的水相約0.2ml)；
圖4為兩種乳化工藝制備的疫苗HI抗體水平曲線圖。附圖或文字中各標號(或符號)清單為:1.第一蠕動泵(灌注出液泵)，2.第二蠕動泵(灌注進液泵)，3.第一硅膠管，4.第二硅膠管，5.激流罐，6.灌注袋，7.有孔硅膠管，8.聚酯纖維紙片載體；
Tl為激流罐內(nèi)液體溫度，T2為激流罐加熱膜的溫度，T3為灌注袋外環(huán)境溫度，pH為激流罐內(nèi)液體PH值，DO為激流罐內(nèi)液體溶氧率，振蕩速度為激流罐的振蕩速度，空氣流量為激流罐內(nèi)空氣流通量。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明，其中各實施例僅用于說明本發(fā)明而并非限定本發(fā)明的專利保護范圍。實施例1有限稀釋法克隆純化篩選制苗用細胞(豬腎細胞IBRS-2)
豬腎細胞IBRS-2購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。豬細小病毒疫苗株為豬細小病毒RP2株，其經(jīng)蝕斑法純化篩選，于2012年11月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)物名稱:豬細小病毒RP2株(Porcineparvovirus，PPV)，保藏號為CCTCC NO:V201250保藏地址為中國武漢大學。所述病毒為本領域常見病毒，故對其特征描述略去。
細胞生長液的配方為體積百分含量為90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.4 ;
細胞維持液為體積百分含量為96%高糖DMEM液，4%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.4 ;
A.單克隆細胞株制備
a.細胞懸液的制備
細胞瓶中培養(yǎng)豬腎細胞IBRS-2，待細胞長滿為致密的單層、輪廓清晰時，用0.025%胰酶進行消化，制成細胞懸液。b.細胞的有限稀釋
對所制備的IBRS-2細胞懸液進行細胞計數(shù)，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細胞懸液，使得細胞密度約為1.0X IO5個/ml ;用無血清DMEM培養(yǎng)液將稀釋后的IBRS-2細胞懸液10倍梯度稀釋至IO3個/ml，再用細胞生長液10倍梯度稀釋到IO1個/ml，即每0.1ml I個細胞。c.細胞的克隆培養(yǎng)
將上述稀釋好的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，顯微鏡下觀察，棄去非單一細胞并且細胞狀態(tài)不佳的細胞孔，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細胞生長狀態(tài)并及時換液，待細胞增殖為克隆群落，選取生長狀態(tài)良好的細胞孔，用0.025%胰酶進行消化，制成懸液，重復上述克隆方法廣2次，直至篩選出單克隆生長孔。d.單克隆化細胞株的擴大培養(yǎng)
選取單克隆生長孔，用0.025%胰酶消化，`以小牛血清中和，以細胞生長液重懸，轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板進行擴大培養(yǎng)，當細胞增殖到匯合度約為80%時，用0.025%胰酶消化，加入細胞生長液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)6 10瓶，進行單克隆細胞的凍存及細胞庫的建立。B.豬細小病毒高適應性細胞株的篩選
a.1BRS-2單克隆細胞株的消化鋪板
將長滿單層的IBRS-2單克隆細胞株用0.025%胰酶消化并計數(shù)，每株單克隆細胞鋪24孔細胞培養(yǎng)板，設復孔，30000個細胞/孔。置于37°C，5% CO2下培養(yǎng)24h。b.1BRS-2單克隆細胞株接種豬細小病毒
棄去24孔細胞培養(yǎng)板中的細胞生長液，加入0.1M PBS,0.8ml/孔，吹洗2 3遍后，按V: V 0.1%接種量接種豬細小病毒疫苗株，1.0ml/孔，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)，72h后-20°C反復3次凍融，并收獲病毒液。c.1BRS-2單克隆細胞株培養(yǎng)豬細小病毒疫苗株的血凝滴度測定
在96孔血凝板中，從第I孔至12孔加入生理鹽水25 μ I/孔,取收獲病毒液25 μ I,從第I孔起，依次做2倍梯度倍比稀釋，至最后一個倍數(shù)孔，最后一個倍數(shù)孔中棄去25μ I液體；
每孔加入1%豚鼠紅血球25 μ 1，并設不加病毒液的紅細胞對照孔，振蕩后，置室溫下30 40min，觀察結果。方法參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版。d.豬細小病毒疫苗株感染IBRS-2單克隆細胞株的TCID5tl檢測
按常規(guī)方法將收獲的病毒液用無血清DMEM 10倍梯度倍比稀釋，稀釋度為KT1 10_1Q，稀釋好的病毒液依次對應的加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排，共8個復孔，每孔100 μ I病毒液，其中96孔細胞板的最后兩縱排作為對照，不加病毒液，只加無血清DMEM，每孔100μ I。然后向每孔加入細胞數(shù)為2Χ IO5個/ml的細胞懸液100 μ I。置于370C，5% CO2培養(yǎng)5d，5d后觀察細胞病變，結果計算按照Reed-Muench法。C.結果
a.1BRS-2單克隆細胞株的培養(yǎng)及豬細小病毒疫苗株高適應性IBRS-2單克隆細胞株的篩選。通過有限稀釋法擴大培養(yǎng)獲得IBRS-2單克隆細胞株58株。液氮冷凍保存，每株單克隆細胞凍存5支，每支1.5ml，密度約為5X IO6個/ml。通過豬細小病毒疫苗株感染IBRS-2單克隆細胞株72h后的血凝滴度檢測，篩選出2株IBRS-2單克隆細胞:第16株和第34株，在58株中血凝滴度最高，分別為1: 2048和I: 4096。由此，篩選獲得第16株和第34株為豬細小病毒疫苗株高適應性IBRS-2單克隆細胞株，并分別標號為116和134。b.豬細小病毒疫苗株感染IBRS-2單克隆細胞株的TCID5tl滴度
通過TCID5tl方法檢測·豬細小病毒疫苗株感染116和134單克隆細胞株的TCID5tl結果分別為IO7 5 TCID5ciAil和IO7 7 TCID50/mL.與豬細小病毒疫苗株感染普通IBRS-2細胞的TCID5tl(106 5 107_°TCID5Q/ml)相比，提高約10倍。由此可見，篩選獲得的IBRS-2單克隆細胞株感染豬細小病毒疫苗株的TCID5tl滴度有明顯提高。134號豬腎細胞IBRS-2于2012年11月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C2012178，保藏地址為中國武漢大學；所述細胞較常見，其特征描述省略。應用同樣的方法純化篩選出一株豬睪丸傳代細胞ST，于2012年11月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C2012180，保藏地址為中國武漢大學；所述細胞較常見，其特征描述省略。實施例2 AP20C型激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗
本實施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反應器，灌注袋6體積為8L (兩個灌注袋的體積均為4L)，激流罐5體積為13L，灌注袋6內(nèi)含有300g聚酯纖維紙片載體8 (兩灌注袋各含150g載體)；理論有效培養(yǎng)體積為21L。細胞同實施例1中菌種保藏的豬腎細胞IBRS-2 ；
種毒同實施例1中豬細小病毒RP2株；
細胞生長液的配方為體積百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，調(diào)整PH值為
7.4 ；
細胞維持液為體積百分含量98%高糖DMEM液，2%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.5 ;
無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基為不含有NaCl和酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)基，由InvitrogenCorporation生產(chǎn)銷售。A、準備工作:
檢驗系統(tǒng)氣密性，校準電極，PBS處理紙片載體8，連接灌注袋6與激流罐5，用細胞生長液浸泡紙片載體8，平衡系統(tǒng)。B、制備工作，具體步驟如下:
a.制苗用細胞的復蘇與前期培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的IBRS-2細胞復蘇后，用細胞生長液于37°C培養(yǎng)，長成良好單層后消化轉(zhuǎn)至IOL轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)、備用。b.制苗用細胞在生物反應器中的接種、培養(yǎng)
取8個長滿單層細胞的轉(zhuǎn)瓶，用0.025%胰酶消化細胞，制備細胞懸液IOL (含細胞和細胞生長液)，細胞總數(shù)約3.3 X IO9個。細胞接種采用兩步接種法，第一步:兩灌注袋中各從下部打入細胞懸液4.0L，靜置吸附Ih ;第二步:將兩灌注袋中的液體各打出1L，再從兩灌注袋上部深層管各打入IL剩余細胞懸液，靜置吸附0.5h ;同時在激流罐5內(nèi)補充5L細胞生長液預熱；細胞接種密度為:每克載體接種1.1 X IO7個細胞。吸附過程完成后，設置設備參數(shù)如下:T1:37.5°C, T2:44°C, T3:36.5°C, PH:7.3，DO:40 70%，振蕩速度45r/min，循環(huán)速度400ml/min，空氣流量100ml/min。啟動細胞培養(yǎng)程序，進行細胞培養(yǎng)。逐日增大空氣流量,每24時增加100ml/min。細胞生長液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內(nèi)液體顏色保持基本一致。每日取樣2次測殘?zhí)橇?，計算單日耗糖量，細胞培養(yǎng)48h培養(yǎng)液殘?zhí)橇康陀?g/L，開始流加補充細胞生長液，流加速度為llml/min ；
細胞培養(yǎng)60h時，泵出培養(yǎng)液13L，補入細胞生長液4L后流加補充細胞生長液，流加速度為 llml/min。 細胞培養(yǎng)72h時，培養(yǎng)液體積接近有效體積21L，將培養(yǎng)液全部打出，換入20L新鮮細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)。c.豬細小病毒接種制苗用細胞，繼續(xù)培養(yǎng)
細胞接種后第4日(96h)單日耗糖量達到3.42g/L/24h，且趨于平穩(wěn)，確定細胞密度達到了接毒要求。排空反應器內(nèi)液體，將含細胞維持液14L和病毒液420ml(血凝價為1:4096，效價為107_7TCID5(l/ml)的 種毒懸液打入系統(tǒng)中，設置設備參數(shù)如下:T1:37°C,T2:39°C,T3:36°C, pH:7.5，DO:40 70%，振蕩速度 45r/min，循環(huán)速度 500ml/min，空氣流量 400 ml/min,啟動病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)。病毒接種12h后開始流加補充200g/L葡萄糖和3倍濃縮DMEM液(I份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入2份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解而成)，3倍濃縮DMEM液流加速度為3.14ml/min, 200g/L葡萄糖流加速度為
0.lml/min。d.收獲病毒液，滅活病毒
病毒培養(yǎng)41h后，收獲激流罐5和灌注袋6內(nèi)的病毒液，灌注袋6凍融3次后收獲上清液，將收獲的全部病毒液混勻，共得20.9L病毒液，備用。收獲的病毒液測定效價和血凝價，每Iml含病毒IO8 3TCID5tl，對豚鼠紅細胞凝集價為 I:4096o收獲的20.9L病毒液內(nèi)加入21mL 二乙烯亞胺滅活劑，37°C滅活24h終止。滅活完成后取樣進行滅活檢驗，置于4°C保存?zhèn)溆?。e.疫苗制備
滅活的病毒液中加入1.8L吐溫-80制備成水相，43L進口白油中按加入4L司本-80熬制成油相，將水相與油相按V/V I:2比例混合后乳化，制備成豬小病毒病滅活疫苗。
f.安全檢驗
仔豬安檢:用4 6周齡健康易感仔豬(血清HI抗體效價應不高于1:8) 2頭，各頸部肌肉注射疫苗4ml，連續(xù)觀察21日，免疫后仔豬精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應，仔豬安檢合格。乳鼠安檢:用3 5日齡乳鼠5只，各皮下注射疫苗0.1ml,觀察10日，免疫后乳鼠精神狀態(tài)良好，無異常反應，乳鼠安檢合格。以上試驗證明疫苗安全性檢驗合格。g.疫苗效力檢驗
選用4月齡PPV抗體陰性初產(chǎn)母豬(血清HI抗體效價應不高于1: 8) 8頭，同時設對照4頭，每頭頸部肌肉注射疫苗2ml，28日后，采血，分離血清，測定HI抗體。對照豬抗體均為陰性，免疫豬HI效價分別為1:4096、1: 4096、1:4096、1:2048。與轉(zhuǎn)瓶工藝比較:轉(zhuǎn) 瓶培養(yǎng)工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價一般為107_° TCID50/ml左右；本次實驗病毒總產(chǎn)量與400個IOL轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)量持平。實施例3 AP200型激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗 本實施例中所用的激流灌注式生物反應器包括AP20C型和AP200型兩種。AP20C型激流灌注式生物反應器同實施例2。AP200型灌注袋6體積為80L(兩個灌注袋的體積均為40L)，激流罐5體積為130L，灌注袋6內(nèi)含有3000g聚酯纖維紙片載體8 (兩灌注袋各含1500g載體)；理論有效培養(yǎng)體積為210L。制苗用細胞、種毒均同實施例2。A、準備工作:
選用AP20C型和AP200型兩種激流灌注式生物反應器，做培養(yǎng)細胞前準備工作。B、制備工作，具體步驟如下:
a.制苗用細胞的培養(yǎng)
按照實施例2方法，在AP20C型生物反應器內(nèi)培養(yǎng)制苗用細胞96h，至細胞耗糖量增至
3.3g/L/24h且趨于平穩(wěn)時，用0.025%胰酶消化一個灌注袋6內(nèi)細胞，制得細胞懸液100L，內(nèi)含豬腎細胞IBRS-2約2.9X 101°個。將制得的細胞懸液分兩步接種于AP200型生物反應器灌注袋6內(nèi):第一步:兩灌注袋中各從下部打入細胞懸液40L，靜置吸附Ih ;第二步:將兩灌注袋中的液體各打出10L，再從兩灌注袋上部深層管各打入IOL剩余細胞懸液，靜置吸附0.5h ;同時在激流罐5內(nèi)補充50L細胞生長液預熱；細胞接種密度為:每克載體接種
0.97 X IO7個細胞。吸附過程完成后，設置設備參數(shù)如下:T1:37.5°C, T2:43°C, T3:36.5°C, PH:7.3，DO:50 70%，振蕩速度43r/min，循環(huán)速度4000ml/min，空氣流量1000ml/min。啟動細胞培養(yǎng)程序，進行細胞培養(yǎng)。逐日增大空氣流量，每24時增加1000ml/min。細胞生長液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內(nèi)液體顏色保持基本一致。每日取樣2次測殘?zhí)橇浚嬎銌稳蘸奶橇?，細胞培養(yǎng)48h培養(yǎng)液殘?zhí)橇康陀?g/L，開始流加補充細胞生長液，流加速度為105ml/min ；
細胞培養(yǎng)60h時，泵出培養(yǎng)液130L，補入細胞生長液30L后流加補充細胞生長液，流加速度改為115ml/min。細胞培養(yǎng)72h時，培養(yǎng)液體積接近有效體積210L，將培養(yǎng)液全部打出，換入200L新鮮細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)。b.豬細小病毒接種制苗用細胞，繼續(xù)培養(yǎng)
細胞接種后第4日(96h)單日耗糖量達到3.4g/L/24h，且趨于平穩(wěn)，確定細胞密度達到了接毒要求。排空反應器內(nèi)液體，將含細胞維持液140L和病毒液4.2L (血凝價為1:4096，效價為107 7TCID5Q/ml)的種毒懸液打入系統(tǒng)中，設置設備參數(shù)如下:T1:37°C,T2:39°C,T3:36。。，pH:7.5，DO:50 70%,振蕩速度 45r/min,循環(huán)速度 5000ml/min,空氣流量 4000 ml/min,啟動病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)。病毒接種12h后開始流加補充200g/L葡萄糖和3倍濃縮DMEM液，流加速度為32ml/min,葡萄糖流加速度為lml/min。c.收獲病毒液,滅活病毒
病毒培養(yǎng)40h后，收獲激流罐5和灌注袋6內(nèi)的病毒液，灌注袋6凍融3次后收獲上清液，將收獲的全部病毒液混勻，共得208L病毒液，備用。收獲的病毒液測定效價和血凝價，每Iml含病毒IO8 2TCID5tl，對豚鼠紅細胞凝集價為 I:2048o 收獲的病毒液內(nèi)加入滅活劑二乙烯亞胺208mL，37°C滅活24h終止。滅活完成后取樣進行滅活檢驗，置于4°C保存?zhèn)溆?。d.疫苗制備
滅活的208L病毒液中加入17L吐溫-80制備成水相，425L進口白油中按加入39L司本-80熬制成油相，將水相與油相按V/V I:2比例混合后乳化，制備成豬小病毒病滅活疫苗。e.安全檢驗
仔豬安檢:用4 6周齡健康易感仔豬(血清HI抗體效價應不高于1: 8) 2頭，各頸部肌肉注射疫苗4ml，連續(xù)觀察21日，免疫后仔豬精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應，仔豬安檢合格。乳鼠安檢:用3 5日齡乳鼠5只，各皮下注射疫苗0.lml，觀察10日，免疫后乳鼠精神狀態(tài)良好，無異常反應，乳鼠安檢合格。以上試驗證明疫苗安全性檢驗合格。f.疫苗效力檢驗
選用4月齡PPV抗體陰性初產(chǎn)母豬(血清HI抗體效價應不高于1: 8) 8頭，同時設對照4頭，每頭頸部肌肉注射疫苗2ml，28日后，采血，分離血清，測定HI抗體。對照豬抗體均為陰性，免疫豬HI效價分別為1:4096、1: 4096、1:2048、1:2048。與轉(zhuǎn)瓶工藝比較:轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價一般為107_° TCID50/ml左右；本次實驗病毒總產(chǎn)量與3000個IOL轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)量持平。實施例4本發(fā)明乳化工藝與常規(guī)乳化工藝比較
某一批豬細小病毒液半成品，其效價為108_°TCID5(l/ml，對豚鼠紅細胞凝集價為1:4096。A.本發(fā)明乳化工藝
a水相制備將3.6L吐溫加入到36.4L豬細小病毒滅活毒液中，攪拌均勻，即為水
相；
b油相制備將7L司班-80加入到74L進口白油中，升高溫度至126°C，加熱15min后，待溫度降至室溫后，高壓滅菌(12rC，20min)備用；
c疫苗制備將80L油相加入至乳化罐中，緩慢加入40L水相，水相與油相V/V 1:2，乳化制備成豬細小病毒病滅活疫苗；
d穩(wěn)定性檢測3000r/min離心15分鐘，8000r/min離心20分鐘,均無水相析出，；e效力檢測選用4月齡PPV抗體陰性初產(chǎn)母豬(血清HI抗體效價應不高于1:8)8頭，同時設對照4頭，每頭頸部肌肉注射疫苗2ml，分別于免疫后7d、15d、30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d后，采血，分離血清,測定HI抗體。B.常規(guī)乳化工藝
a水相制備將1.8L吐溫80加入到43.2L豬細小病毒滅活毒液(32°C )中，攪拌均勻，即為水相；
b油相制備將1080g硬質(zhì)酸鋁加入到85.5L進口白油中，加熱至90°C左右，待硬脂酸鋁全部溶解后，加入4.5L司班80 ;升高溫度至126°C，加熱2h后，待溫度降至室溫后，高壓滅菌(121°C, 30min)備用；
c疫苗制備將90L油相加入至乳化罐中，緩慢加入45L水相，水相與油相V/V 1:2，乳化制備成豬細小病毒病滅活疫苗；
d穩(wěn)定性檢測3000r/min離心15分鐘,無水相析出；8000r/min離心20分鐘,管底析出的水相約0.2ml ；
e效力檢測選用4月齡PPV抗體陰性初產(chǎn)母豬(血清HI抗體效價應不高于1: 8)8頭，同時設對照4頭，每頭頸部肌肉注射疫苗2ml，分別于免疫后7d、15d、30d、60d、90d、120d、150d、180d 、210d后，采血，分離血清，測定HI抗體。C 結論
a穩(wěn)定性檢測:本發(fā)明乳化工藝制備的疫苗比常規(guī)乳化工藝制備的疫苗穩(wěn)定性更好(兩種乳化工藝穩(wěn)定性對比見圖3)。b效力檢測:本發(fā)明乳化工藝制備的疫苗比常規(guī)乳化工藝制備的疫苗產(chǎn)生的抗體水平高，且持續(xù)時間長，免疫效果更好(效力檢測結果見圖4)。
權利要求
1.一種制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，它利用激流灌注式生物反應器為培養(yǎng)系統(tǒng)，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵(I )、第二蠕動泵(2)，第一硅膠管(3)、第二硅膠管(4)、激流罐(5)、灌注袋(6)、有孔硅膠管(7)和聚酯纖維紙片載體(8);所述灌注袋(6)為內(nèi)含聚酯纖維紙片載體的細胞培養(yǎng)袋，兩個灌注袋結構與功能完全相同，以相同的方式與激流罐(5)連接，通過外源泵實現(xiàn)物質(zhì)交換； 滅活疫苗的制備按以下步驟進行: a.制苗用細胞的培養(yǎng) 將細胞懸液即種子細胞和細胞生長液的混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋(6)，使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體(8)上，接種密度為每克載體接種0.8 1.2X IO7個細胞，設定設備參數(shù):溫度Tl:37.5 38°C、T2:43 46°C、T3:35.5 37°C，pH -J.2 7.8, DO:30% 70%、振蕩速度40 55r/min，空氣流量100ml/min 1000ml/min，啟動細胞培養(yǎng)程序，進行細胞培養(yǎng)，得到制苗用細胞； b.病毒接種與培養(yǎng) 當細胞單日耗糖趨于平穩(wěn)時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內(nèi)液體，將豬細小病毒種毒接種制苗用細胞，設定設備參數(shù):溫度Tl:35 38°C、T2:37 40°C、T3:34 36°C，pH:7.3 7.8，DO:30% 70%,振蕩速度 35 50r/min，空氣流量 400 ml/min 4000ml/min,啟動病毒培養(yǎng)程序，擴增培養(yǎng)豬細小病毒； c.病毒液收獲 病毒培養(yǎng)40 42h 后，收獲激流罐(5)與灌注袋(6)內(nèi)的病毒液，將灌注袋(6)反復凍融2 3次后收獲上清液，混合后-20°C保存?zhèn)溆?；檢測病毒液效價和血凝價； d.病毒液滅活 收獲的病毒液中加入滅活劑，滅活病毒； e.疫苗制備 滅活的病毒液加入佐劑，乳化制備成豬細小病毒病滅活疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，種子細胞為豬腎細胞IBRS-2或豬睪丸傳代細胞ST，均為經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的細胞，應用有限稀釋法將待篩選細胞進行單克隆化，擴大培養(yǎng)建立單克隆化細胞庫，通過血凝和TCID5tl篩選豬細小病毒疫苗株的高適應性單克隆化細胞株。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，細胞培養(yǎng)過程中采用階段流加方式補充細胞生長液，當殘?zhí)橇康陀?g/L時，流加補充細胞生長液，流加量以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準，當培養(yǎng)液體積達到有效培養(yǎng)體積時，進行換液。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，逐日增大空氣流量，每24時增加100ml/min 1000ml/min。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，豬細小病毒種毒是經(jīng)過蝕斑法純化篩選的優(yōu)良種毒。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒接種前將種毒混于細胞維持液中，種毒與細胞維持液按V/ν為1% 3%混合，病毒接種時將混有病毒液的細胞維持液泵入反應器系統(tǒng)中，無需吸附，直接啟動病毒培養(yǎng)程序擴增培養(yǎng)病毒。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒培養(yǎng)12h時開始持續(xù)流加補充含η倍濃縮DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準；所述η等于2 5。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，所述η倍濃縮DMEM液配制方法為:1份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入(η-1)份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解即成；所述η等于2 5。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟e中，滅活的病毒液中按V/V 6 13%加入吐溫-80制備成水相，在進口白油中按V/V 7 11%加入司本-80制備成油相，將水相與油相按V/V 1:2比例混合后乳化，制備成豬細小病毒病滅活疫 苗。
全文摘要
一種制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，屬于生物技術領域。所述方法包括以下步驟a.制苗用細胞的培養(yǎng)；b.病毒接種與培養(yǎng)；c.病毒液收獲；d.病毒液滅活；e.疫苗制備。本發(fā)明對制苗用種毒及細胞進行了篩選，加強了病毒與細胞的匹配性；采用激流灌注式生物反應器培養(yǎng)體系提高了病毒的增殖滴度及收獲量；對于乳化工藝的改進提升了免疫效果；而且整個生產(chǎn)工藝不涉及其他生物安全和公共衛(wèi)生問題，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/20GK103157106SQ20121057818
公開日2013年6月19日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權日2012年12月27日
發(fā)明者鄭朝朝, 李曉艷, 劉濤, 劉超, 郁宏偉, 李建麗, 楊保收, 梁武, 柳珊 申請人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司