水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株及其在制備水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株及其在制備水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗中的用途。所述水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株，命名為MEVB-F61，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC NO.9560。試驗表明該疫苗株作為疫苗使用時，安全、有效，可有效預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎的發(fā)生，且經(jīng)過連續(xù)5代動物接種實驗，證明該疫苗株無毒力返強(qiáng)。因此，本發(fā)明在防治水貂細(xì)小病毒性腸炎領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。CGMCC NO 956020140813
【專利說明】水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株及其在制備水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株及其應(yīng)用，本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】

【背景技術(shù)】
[0002]水貂細(xì)小病毒性腸炎是由細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬水貂細(xì)小病毒引起的急性、高度接觸性傳染病，同水貂犬瘟熱、水貂阿留申病一起被稱為水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病。該病最早于1949年由Schofield報道發(fā)現(xiàn)于加拿大，1952年由Wills分離并鑒定，命名為水貂腸炎病毒，目前水貂細(xì)小病毒性腸炎廣泛存在于世界各個養(yǎng)貂國家。不同年齡和品種的水貂均有易感性，但尤以50?60日齡的仔貂和幼貂最為易感，幼貂的發(fā)病率為70%以上，死亡率高達(dá)90% ;成年貂的發(fā)病率為30%左右，死亡率在30%以下?；疾∷鹾湍瓦^貂是該病的主要傳染源，病毒通過糞、尿、唾液等排出體外，經(jīng)消化道和呼吸道傳染給易感的健康貂。該病全年都可發(fā)生，常呈地方性流行。一旦傳入貂場，如獸醫(yī)防疫衛(wèi)生措施不完善，常常導(dǎo)致長期存在和周期性發(fā)生流行，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)從上世紀(jì)50年代起步，90年代獲得蓬勃發(fā)展，現(xiàn)已成為畜牧業(yè)養(yǎng)殖的重要組成部分。目前，我國毛皮動物存欄數(shù)可達(dá)1億只，其中水貂占一半以上，主要集中在山東、河北、吉林、遼寧、黑龍江等省份地區(qū)。對推動當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展，增加農(nóng)民就業(yè)和收入起到了重要的作用。水貂細(xì)小病毒性腸炎是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的最重要傳染病之一，由于缺乏特效的治療方法，目前仍以疫苗接種為主要防控手段。因此，研制出安全、有效的水貂細(xì)小病毒性腸炎的疫苗是控制水貂細(xì)小病毒性腸炎的有效方法。
[0004]目前國內(nèi)市場上現(xiàn)有的水貂細(xì)小病毒性腸炎疫苗多為未凍干的滅活疫苗，滅活疫苗在生產(chǎn)過程中往往存在滅活不徹底或滅活劑(多數(shù)為甲醛)使用量超標(biāo)的現(xiàn)象，給疫苗的下一步使用帶來了極大的隱患。同時甲醛具有較大毒性，因此使用甲醛作為滅活劑對水貂具有一定毒性，往往在接種部位造成局部炎癥反應(yīng)，甚至是化膿、潰瘍，影響水貂皮張質(zhì)量，造成經(jīng)濟(jì)損失。同時，滅活疫苗只能調(diào)動起機(jī)體的體液免疫，無法刺激機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
[0005]因此，開發(fā)安全、有效、能夠同時刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的活疫苗是行業(yè)和市場的迫切需求，具有廣闊的市場前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問題，本發(fā)明利用連續(xù)傳代的方法，將細(xì)小病毒疫苗株MEVB在貓腎細(xì)胞CRFK上連續(xù)傳代，并且每10?20代進(jìn)行一次噬斑克隆純化。經(jīng)過61次傳代，最終獲得了一株對水貂安全、免疫原性良好的細(xì)小病毒致弱株MEVB-F61，用于作為制備水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗的候選毒株。
[0007]所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61，命名為MEVB-F61，分類命名為水貂細(xì)小病毒(Mink Enteritis Virus),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為:CGMCC N0.9560，保藏時間為:2014年8月13日。
[0008]同原始毒株MEVB (GenBank登陸號FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列發(fā)生了一定的突變，表現(xiàn)在于結(jié)構(gòu)蛋白VP2第145位氨基酸由I突變?yōu)長 ;第300位氨基酸(主要抗原決定簇位點之一)由V突變?yōu)锳 ;第411位氨基酸由A突變?yōu)镋 ;第562位氨基酸由V突變?yōu)長。
[0009]將第61代病毒MEVB-F61連續(xù)5代灌胃接種抗體陰性水貂，每代連續(xù)觀察14天。結(jié)果顯示每代接種水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)均表現(xiàn)正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種水貂腸道無病變，說明疫苗株MEVB-F61無毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，可用于疫苗研究。
[0010]因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株在制備預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎藥物中的應(yīng)用。
[0011]其中，優(yōu)選的，所述的藥物為水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗。
[0012]一種水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗，其特征在于其有效成分包括本發(fā)明所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株。優(yōu)選的，疫苗成品中細(xì)小病毒滴度(TCID5tl)彡15 5/頭份。
[0013]所述的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗，是通過以下步驟制備得到:
[0014]將本發(fā)明所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株按培養(yǎng)體積的0.1%?2%同步接種于CRFK細(xì)胞上，置35°C轉(zhuǎn)瓶機(jī)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%時通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，進(jìn)行病毒含量、純凈性檢測，將檢驗合格的制苗用病毒液加入適量凍干保護(hù)劑，分裝、凍干，保存于-15?_20°C，即為水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗。
[0015]其中，優(yōu)選的，經(jīng)檢驗合格的制苗用病毒液病毒滴度(TCID5tl) ^ 16 Vml0
[0016]相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0017]作為單苗使用時，安全、有效，接種疫苗后可保護(hù)水貂免于細(xì)小病毒檢驗用強(qiáng)毒的攻擊，一次免疫接種3周和3個月后，水貂對細(xì)小病毒的保護(hù)率均為100%;—次免疫接種6個月和9個月后,水貂對細(xì)小病毒的保護(hù)率分別為95%和85%。因此,該疫苗株可有效預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎的發(fā)生。且經(jīng)過連續(xù)5代動物接種實驗，證明該疫苗株無毒力返強(qiáng)。因此，將該疫苗的免疫期定為6個月，在-8?-10°C的保存期定為12個月，-15?-20°C的保存期定為15個月。
具體實施例
[0018]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0019]實施例1水貂細(xì)小病毒MEVB的傳代致弱
[0020]1、水貂細(xì)小病毒MEVB的傳代致弱
[0021](I)將水貂細(xì)小病毒疫苗株MEVB以同步接毒的方法接種在貓腎細(xì)胞CRFK上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒，標(biāo)記為MEVB-Fl (第I代)。
[0022](2)將第I代病毒MEVB-Fl按照上面所述的方法接種、收獲病毒，標(biāo)記為MEVB-F2 (第2代)。使用同樣的方法，將病毒傳代到61代，標(biāo)記為MEVB-F61。
[0023](3)當(dāng)水貂細(xì)小病毒MEVB連續(xù)傳代到第10代(MEVB-FlO)時，對病毒進(jìn)行克隆噬斑純化。其方法為:將待純化的病毒作10倍比稀釋至10_7，取10_3?10_75個稀釋度病毒懸液0.1ml，與CRFK細(xì)胞同步接種于6孔培養(yǎng)板，并設(shè)未接毒細(xì)胞對照孔。置培養(yǎng)箱(35°C、5% CO2)中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，去掉培養(yǎng)液，用無血清MEM清洗2次，加入預(yù)熱至37°C的低熔點營養(yǎng)瓊脂3mL/孔，室溫冷卻凝固，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)3?5d，每天觀察噬斑。選擇最高稀釋度病毒接種孔，挑取相對獨立的單個噬斑，標(biāo)記為F+1代(即Fll代)。挑出的帶有病毒的低熔點瓊脂噬斑用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，與CRFK細(xì)胞同步接種于6孔培養(yǎng)板，繼續(xù)傳代，標(biāo)記為F+2代(即F12代)。從F+3代(即F13代)開始仍用細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，此后病毒每傳10?20代進(jìn)行一次噬斑克隆純化。
[0024]2、水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61的遺傳變異分析
[0025]同原始毒株MEVB (GenBank登陸號FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列發(fā)生了一定的突變，表現(xiàn)在于結(jié)構(gòu)蛋白VP2第145位氨基酸由I突變?yōu)長 ;第300位氨基酸(主要抗原決定簇位點之一)由V突變?yōu)锳 ;第411位氨基酸由A突變?yōu)镋 ;第562位氨基酸由V突變?yōu)長。
[0026]3.水貂細(xì)小病毒致弱株MEVB-F61毒力返強(qiáng)試驗
[0027](I)第I代毒力返強(qiáng)試驗使用第61代病毒MEVB-F61灌胃接種抗體陰性水貂(1ml/只，107TCID50/ml)，同時設(shè)不接種陰性對照。
[0028](2)將前I代接種動物第4?8天排泄物混合到一起，經(jīng)PBS重懸、氯仿抽提后，取上清作為下一代毒力返強(qiáng)試驗的接種物，灌胃接種量為1ml/只，連續(xù)接種5代。
[0029](3)每次接種病毒后連續(xù)14天觀察水貂的體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)，并剖檢觀察接種水貂腸道病變情況。
[0030](4)結(jié)果表明，連續(xù)5代動物回歸試驗中接種水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)均表現(xiàn)正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種水貂腸道無病變，說明疫苗株MEVB-F61未發(fā)生毒力返強(qiáng)，可用于疫苗研究。
[0031]所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為=CGMCC N0.9560，保藏時間為:2014年8月13日。
[0032]實施例2水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗的制備
[0033](I)將疫苗株MEVB-F61按培養(yǎng)體積的0.1 %?2%同步接種于CRFK細(xì)胞上，置35°C轉(zhuǎn)瓶機(jī)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液。按照上述方法制備5批疫苗，進(jìn)行病毒含量、純凈性檢測。結(jié)果表明，5批疫苗的病毒滴度(TCID5tl)彡106 5/ml，說明疫苗株MEVB-F61生產(chǎn)性能良好，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
[0034](2)制備凍干保護(hù)劑
[0035]將明膠、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照質(zhì)量百分比計，使明膠的終濃度為2?7%，水解乳蛋白的終濃度為10-25%，蔗糖終濃度為15?30%，于116°C、30min高壓滅菌后得到。
[0036](3)將收獲的病毒液與凍干保護(hù)劑按照體積比為3:1混合，定量分裝于無菌的安瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥。
[0037](4)疫苗成品進(jìn)行病毒滴度、純粹性檢驗，水貂細(xì)小病毒滴度> 105.5/頭份。
[0038]實施例3水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗安全性試驗
[0039]取檢驗合格的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗3批(實施例2方法制備)，后肢肌肉接種抗體陰性水貂，分別進(jìn)行單劑量(105 5/頭份)、單劑量重復(fù)和超劑量(10倍)接種，同時設(shè)不接種疫苗水貂作為對照。疫苗接種后，連續(xù)14天觀察水貂的體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)，并剖檢觀察接種水貂腸道病變情況。試驗結(jié)果表明，疫苗單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量接種后，水貂各項生理指標(biāo)均正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種水貂腸道無病變。說明水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗對水貂安全。
[0040]實施例4水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗效力及免疫期試驗
[0041](1)取檢驗合格的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗3批(實施例2方法制備)，后肢肌肉接種(105 5/頭份)抗體陰性水貂，同時設(shè)接種CRFK細(xì)胞培養(yǎng)液對照組，免疫后每月采血、分離血清，用于血凝抑制試驗。
[0042](2)試驗動物接種3周、3個月、6個月和9個月后，使用細(xì)小病毒檢驗用強(qiáng)毒對水貂進(jìn)行攻擊，劑量為10ml，含100個半數(shù)致死量(LD5CI)，灌胃接種。每天觀察攻毒水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)。
[0043](3)結(jié)果表明，接種后3周、3個月水貂對細(xì)小病毒的保護(hù)率為100%，接種水貂各項生理指標(biāo)均正常，無任何臨床癥狀出現(xiàn)；接種后6個月水貂對細(xì)小病毒的保護(hù)率為95% ；接種后9個月水貂對細(xì)小病毒的保護(hù)率為85%。因此，將該疫苗的免疫期定為6個月。對照組水貂均表現(xiàn)出體溫升高，劇烈腹瀉，排出混有腸粘膜的水樣稀便或管型便，且經(jīng)檢驗血液中白細(xì)胞明顯減少。
[0044]以上結(jié)果表明本發(fā)明的疫苗株及其疫苗對于強(qiáng)毒的攻擊可產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，可有效預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎的發(fā)生，是水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗的良好候選毒株。
[0045]實施例5水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗的保存期測定
[0046]取檢驗合格的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗3批(實施例2方法制備)保存于-8?-10。。和-15?-20。。，分別于保存的第3、6、9、12、15、18和24個月取樣，進(jìn)行性狀、真空度、剩余水分、病毒滴度檢測。結(jié)果表明，3批疫苗在-8?-10°C保存12個月性狀為白色疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范圍內(nèi)，細(xì)小病毒的病毒滴度(TCID50)分別為:105_76/ml、105_65/ml和105 67/ml ;而保存于_15?_20°C 15個月后性狀仍為白色疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范圍內(nèi)，細(xì)小病毒的病毒滴度(TCID5(i)分別為:105_76/ml、105_71/ml、和10 5 58/ml。高于疫苗的免疫要求(細(xì)小病毒滴度彡105.5/頭份)，因此將該疫苗在_8?-10°C的保存期定為12個月，-15?-20°C的保存期定為15個月。
【權(quán)利要求】
1.水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株，命名為MEVB-F61，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC N0.9560。
2.權(quán)利要求1所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株在制備預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗。
4.一種水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗，其特征在于其有效成分包括權(quán)利要求1所述的水紹細(xì)小病毒弱毒疫苗株。
5.如權(quán)利要求4所述的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗，其特征在于疫苗成品中細(xì)小病毒滴度TCID50彡15.5/頭份。
6.一種制備權(quán)利要求4所述的水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: 將權(quán)利要求1所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株按培養(yǎng)體積的0.1%?2%同步接種于CRFK細(xì)胞上，置35°C轉(zhuǎn)瓶機(jī)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%時通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，進(jìn)行病毒含量、純凈性檢測，將檢驗合格的制苗用病毒液加入凍干保護(hù)劑，分裝、凍干，保存于-15?_20°C，即為水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于經(jīng)檢驗合格的制苗用病毒液病毒滴度TCID50 彡 16 Vml0
【文檔編號】C12R1/93GK104388394SQ201410572701
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】閆喜軍, 胡博, 柴秀麗, 張海玲, 張蕾, 趙建軍, 白雪, 劉昊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所