一種番鴨細小病毒vp3基因重組雞痘病毒轉移載體及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載 體及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 雛番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV)引起的 一種急性、敗血性傳染病，其特點是具有高度傳染性和死亡率，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最 嚴重的傳染病之一。MDPV主要侵害3周齡以內雛鴨，又稱為"三周病"。雛番鴨發(fā)病率為 20 %~60 %，病死率為20 %~40 %不等；30日齡以上的番鴨發(fā)病率和死亡率較低，病鴨往 往成為僵鴨。本病的發(fā)生無季節(jié)性，一年四季均可發(fā)病，重在預防。目前已有預防該病的弱 毒疫苗，免疫原性和遺傳穩(wěn)定性較好，對預防該病的發(fā)生有一定的幫助。但實際生產中，我 國MDPV的免疫程序比較混亂，無簡便實用的母源抗體監(jiān)測手段。弱毒疫苗易受母源抗體水 平的干擾，影響雛番鴨的免疫預防效果，且弱毒疫苗還存在毒力返強的危險。因此，需要研 究更安全有效的新型疫苗用于MDPV的防控。

【發(fā)明內容】

[0003] 為了解決上述存在問題，本發(fā)明構建了一種新型的番鴨細小病毒VP3基因重組雞 痘病毒轉移載體，可用于篩選獲得重組雞痘病毒，并在動物體內表達重組VP3蛋白，實現較 好的免疫保護效果，為研制高效的番鴨細小病毒重組雞痘病毒活載體疫苗奠定了基礎，也 為快速有效預防番鴨細小病毒病提供一種新方法。
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體 的構建方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體，該轉移載體為在pBluescriptII SK(+)骨架中插入了如SEQIDN0:15所示的核苷酸序列，該序列插入在pBluescriptII SK(+)骨架中Kpnl、SacI的兩個酶切位點間。
[0007] -種番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體的構建方法，包括以下步驟： 1) 擴增重組臂：以雞痘病毒FPV的基因組為模板，擴增左右同源臂TKL片段和TKR片 段，其中TKL片段的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，TKR片段的核苷酸序列如SEQIDN0:2 所示； 2) 重疊延伸PCR:以上述獲得的TKL和TKR片段為模板進行重疊延伸PCR，獲得核苷酸 序列如SEQIDN0:3所示的TK片段； 3) 構建質粒pTK:將TK片段連入pBluescriptIISK(+)質粒中，獲得pTK質粒； 4) 人工合成反向串聯表達盒片段S，其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示，依次含有早期 啟動子P7. 5、多克隆位點MCS1、終止子SV40、反向多克隆位點MCS2、晚期啟動子Pll; 5) 構建質粒pTKS:表達盒片段S連入質粒pTK中，獲得pTKS質粒； 6) PCR擴增VP3片段，其核苷酸序列如SEQIDNO: 5所示； 7) 構建載體pTKS-VP3-EGFP:將VP3 片段（SEQIDN0:5)、EGFPBGHpA片段（SEQID N0:6)分別插入pTKS質粒的多克隆位點MCS1、反向多克隆位點MCS2中，即可獲得載體 PTKS-VP3-EGFP，即為番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體。
[0008] 進一步的，上述步驟1)中擴增TKL片段和TKR片段的引物分別為： TKL擴增引物 TKL-F：5'-tagggcgaattgGGTACCACGATGAAAAAACATTTGTC-3,(SEQIDNO:7)； TKL-R：5'-AAGTTAGACCCCGGGaattGCGGCCGCATTTAAATCTGCAGGTTCTTTTCCT CTTAGCGAT-3'（SEQIDN0:8); TKR擴增引物 TKR-F：5,-GAAAAGAACCTGCAGATTTAAATGCGGCCGCaattCCCGGGGTCTAACTTA CAACACGGTC-3'（SEQIDN0:9); TKR-R：5, -gaacaaaagctgGAGCTCAATGCGTATTACTTCGCTTA-3,(SEQIDNO:10)； 進一步的，上述步驟2)中重疊延伸PCR的引物為： TKL-F：5'-tagggcgaattgGGTACCACGATGAAAAAACATTTGTC-3,(SEQIDNO:7)； TKR-R:5'-gaacaaaagctgGAGCTCAATGCGTATTACTTCGCTTA-3'（SEQIDN0:10)〇
[0009] 進一步的，上述步驟3)構建質粒pTK的具體過程為：將TK片段、pBluescriptII SK(+)質粒分別用Kpnl和SacI雙酶切后，再進行連接反應獲得質粒pTK。
[0010] 進一步的，上述步驟5)構建質粒pTK的具體過程為：將表達盒片段S、pTK質粒分 別用PstI、Not雙酶切后，再進行連接反應獲得質粒pTK。
[0011] 進一步的，上述步驟6)中擴增VP3片段的模板為MDPVFM株(登陸號為： NC_006147)的基因組，引物為： VP3-F：5'-GAAGATCTGCCACCATGGCAGAGGGAGGAAGCGG-3,(SEQIDNO:11)；VP3-R:5'-CTCGAGTTACAGATTCTGAGTCAAAT-3'（SEQIDN0:12)。
[0012] 進一步的，上述步驟7)中VP3片段（SEQIDN0:5)插入多克隆位點MCS1的操 作為：將VP3片段、質粒pTKS分別經BglII、XhoI雙酶切后，再進行連接反應獲得質粒 pTK-VP3〇
[0013] 進一步的，上述EGFPBGHpA片段（SEQIDN0:6)插入反向多克隆位點MCS2的操 作為：將EGFPBGHpA片段與質粒PTK-VP3通過infusion連接，獲得載體PTKS-VP3-EGFP。
[0014] 進一步的，上述EGFPBGHpA片段的PCR擴增模板為pcDNA3. 1-EGFP質粒，PCR擴 增引物為： EGFPBGHpA-F：5'-TCCTTAATTAAGCTAGCATGGCCACAACCATGGTGA-3,(SEQIDNO:13)；EGFPBGHpA-R：5'-AATGTATCTTAGGGCCCTCTTTCCGCCTCAGAAGCCATAGA-3,(SEQID NO:14)〇
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明將番鴨細小病毒（MDPV)的VP3基因重組到雞痘病毒（FPV)中，構建雞痘病毒 轉移載體。構建的載體含有禽痘病毒早晚期啟動子P7. 5控制之下的MDPVVP3基因、P11啟 動下的報告基因EGFP(增強綠色熒光蛋白）以及用于同源重組的雞痘病毒基因組的TK非 復制區(qū)片段。本發(fā)明為研制高效的番鴨細小病毒重組雞痘病毒活載體疫苗奠定了基礎。
[0016] 2)本發(fā)明雞痘病毒轉移載體中用于表達外源基因的啟動子和篩選目的基因的啟 動子均為痘苗病毒自身啟動子，且為避免外源基因和篩選基因表達互相影響，P7. 5和P11 啟動子為反向串聯，且促進了外源基因的穩(wěn)定表達。本發(fā)明還在外源基因VP3基因的5' 端起始密碼子ATG附近加入1個Kozak序列，同時在VP3基因3'端終止密碼子下 游加一T5NT序列，提高了外源基因的表達效率。另外，在本發(fā)明載體構建過程中，使用 overlappingPCR連接左右同源臂，且中間引入酶切位點，合成兩個反向串聯表達盒等操 作，使構建載體的過程中減少了 4步酶切和插入，提高了載體構建的效率。
[0017] 3)本發(fā)明以病毒為載體的基因工程活載體疫苗可以被視為減毒活疫苗和亞單位 疫苗的結合，既可以克服亞單位疫苗需要多次接種注射，誘導的免疫反應不全面、持續(xù)期短 的缺點又可以避免減毒苗易散毒和毒力返強等不足。
[0018] 4)利用本發(fā)明重組雞痘病毒轉移載體構建的重組雞痘疫苗毒株在動物體內可高 效表達重組疫苗，具有較好的免疫保護效果。
【附圖說明】
[0019] 圖1為重組質粒pTKS-VP3-EGFP的構建流程； 圖 2 為TKL、TKR片段的PCR擴增，M:lkbpDNAladderMarker;1:TKR;2:TKL; 圖3為pTK質粒的酶切鑒定結果，M:lkbpDNAladderMarker;1 :質粒pTK;2 :pTK質 粒的酶切產物； 圖4為反向串聯表達盒結構； 圖 5 為pTKS質粒的酶切鑒定結果；M:lkbpDNAladderMarker;1:pTKS質粒；2:pTKS質粒的酶切產物； 圖6為pTKS-VP3質粒的酶切鑒定結果，M:lkbpDNAladderMarker;1 :pTKS-VP3質 粒，2:pTKS-VP3質粒的酶切產物； 圖 7 為pTKS_VP3_EGFP質粒的酶切鑒定結果Ml:lkbpladdermarker;1 :PTKS-VP3-EGFP質粒Nhel單酶切產物，2 :pTKS-VP3-EGFP質粒Mfel單酶切產物（Mfel酶切 位點位于SV40 中)，3 :pTKS-VP3-EGFP質粒Nhel/Mfel雙酶切產物，4 :pTKS-VP3-EGFP質粒 Notl單酶切產物，5 :pTKS-VP3-EGFP質粒BglII單酶切產物，6 :pTKS-VP3-EGFP質粒Notl、 BglII雙酶切產物，M2 :500bpDNAladdermarker; 圖8為重組病毒的PCR擴增，M:DL 2000 DNAMarker;1 :VP3基因；2 :疫苗毒對照； 圖9為重組質粒pTKS-VP3-EGFP轉染CEF細胞72h的熒光觀察。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0021] 實施例1 1材料 1. 1病毒株和細胞 番鴨細小病毒MDPV分離株由本實驗室保存，雞痘病毒FPV弱毒疫苗購自廣東永順生物 制藥有限公司；雞胚成纖維細胞用購自廣東大華農動物保健品股份有限公司9日齡SPF雞 胚制備。
[0022] 菌種和質粒 宿主菌DH5a購自北京天根生物工程技術服務有限公司，PMD18-T購自TAKARA公司， 質粒pBluescriptIISK(+)和pcDNA3.1-EGFP為本實驗室保存，質粒pMD18-VP3由本實 驗室構建。痘苗病毒早晚期啟動子P7. 5和晚期啟動子P11序列由香港大學陳志偉教授惠 贈。
[0023] 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶購自TAKARA公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶BglII、KpnI、Mfe I、NheI、NotI、PstI、SacI、XhoI購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒 為AXYGEN公司產品。胎牛血清（FCS)和DMEM培養(yǎng)基為ThermoScientific公司產品。熒 光顯微鏡為Olympus公司產品。轉染試劑Lipofectamine3000購自LIFE公司。
[0024] 方法 番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體pTKS-VP3-EGFP的構建流程見圖1。
[0025] 下面結合流程圖1，對番鴨細小病毒VP3基因重組雞痘病毒轉移載體的構建方法 作進一步具體的描述。
[0026] 基因組的提取 制備CEF細胞(雞胚成纖維細胞)，待細胞貼壁>80%以上，加入用未加血清的DMEM培養(yǎng) 基稀釋的FPV弱毒疫苗毒株，37°C5%C02培養(yǎng)30min后，棄去培養(yǎng)液，加入含2%FCS的 DMEM培養(yǎng)基，37°C5%C02培養(yǎng)72h，收獲病毒，反復凍融3次，低速離心取上清保存。制備 CEF細胞，將上述收獲的病毒液再接入細胞中，以此類推，盲傳至10代，保存每代病毒液，并 進行PCR檢測。按基因組AxyPrep小量提取試劑盒說明提取FPV弱毒疫苗毒株的基因組， 保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 重組臂的擴增 應用PrimerPremier5.0引物設計軟件，根據GenBank上登錄的FPV疫苗毒株(登 陸號為：DD211553)和FPV109株(登陸號為：1486657)TK基因設計左右同源臂引物TKL-F/ R和TKR-F/R(見表1)，送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0028] 以提取的雞痘病毒FPV基因組為模板，分別PCR擴增TKL序列（核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示)、TKR序列（核苷酸序列如SEQID勵"所示^擴增的孤匕了狀片斷如圖之所 示，片段大小分別為1386 bp、1061 bp，將TKL、TKR片斷分別連入pMD18-T載體，轉化DH5a 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，并進行酶切和測序鑒定，選用鑒定正確的陽性克隆。
[0029] 表1PCR擴增所用引物信息 z.J里罝5UE1 甲rLK
取上述鑒定正確的含TKL的陽性質粒和含TKR片段的陽性質粒為模板