一種鴨細小病毒毒株及其滅活疫苗和制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及動物病毒學領域，提供了一種鴨細小病毒毒株及其滅活疫苗和制備方 法。
【背景技術】
[0002] 鴨細小病毒是細小病毒的一種，主要侵害1~3周齡的維鴨，臨床W腹瀉、呼吸困 難和腳軟為主要癥狀，一年四季均有發(fā)生，給鴨飼養(yǎng)帶來極大的經濟損失，是鴨飼養(yǎng)中主要 的疾病之一，發(fā)病率和死亡率也較高。
[0003] 2015年3月W來，我國山東、江蘇和安徽等地肉鴨群出現(xiàn)了一種疾病，經驗證為鴨 細小病毒，該病W鴨瞭發(fā)育不良，舌頭外伸為特征，本病主要發(fā)生在14日齡W上的商品鴨， 鴨群發(fā)病率為10% -20%，最高可達50%，大群感染率最高可達100%，但該病不造成患鴨 死亡?；鉴啺l(fā)育遲緩，體溫略升高，瞭短，彈性降低，舌腫脹，外伸，感染后期患鴨腔骨和翅骨 易發(fā)生骨折。該病主要導致鴨群料肉比上升，養(yǎng)殖成本升高，鴨出欄合格率降低。對肉鴨養(yǎng) 殖業(yè)造成巨大的經濟損失。
[0004] 眾所周知，疫苗接種是防止疫病爆發(fā)和避免造成巨大經濟損失的主要措施、關鍵 環(huán)節(jié)和最后防線。組織滅活苗和疫苗是鴨飼養(yǎng)行業(yè)中常用的生物制劑，由于該病為新發(fā)疫 病，目前國內外尚無預防該病的疫苗。因此，提供一種針對性的疫苗來防治該病成為亟待解 決的問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種鴨細小病毒毒株及其滅活疫苗和制備 方法，該毒株為鴨細小病毒，具體命名為GT2015株，其生物保藏編號為CCTCCNo:V201527 ; 利用該毒株制備的疫苗有效解決了我國當前該病無法預防的現(xiàn)狀，提高肉鴨的出欄合格 率，降低肉鴨養(yǎng)殖的料肉比，減少了該病造成了經濟損失，制備方法簡單，短時間內可制備 完畢；安全性高，對環(huán)境沒有任何不良影響；使用操作方便，使用時取出組織滅活苗注射即 可；適于規(guī)?；可a和應用；免疫效率高，接種后保護率可至100% ;保質期可達12個 月。
[0006] 發(fā)明人首先對上述病毒進行了分離和鑒定，最終確定上述疾病為鴨細小病毒 值UckParvovirusDPV)感染引起的一種鴨細小病毒病。進而發(fā)明人獲得了一株新鴨細 小病毒毒株，通過毒種的分離培養(yǎng)、碟胚中和試驗、病毒的PCR檢測及病毒的測序檢測實 驗，確定該毒株為一株新的鴨細小病毒，命名為鴨細小病毒GT2015株。本發(fā)明鴨細小病毒 GT2015株的分離結果顯示：本病毒能在鴨胚及其制備的的原代細胞培養(yǎng)物中增殖并形成 病變，且隨著傳代次數(shù)的增加，病變越來越明顯。但是該病毒不能夠在雞胚、碟胚上增殖。鴨 胚盲傳3代可見絨毛尿囊膜水腫、增厚，頸部、胸部、爪、翅尖及瞭旁均有出血，頭及頸部水 腫。收獲的鴨胚尿囊液經紅細胞凝集試驗檢測無血凝活性。
[0007] 發(fā)明人對該毒株進行了生物保藏，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，生物保 藏編號為CCTCCNo:V201527。
[0008] 在分離獲得上述毒株的基礎上，發(fā)明人進一步獲得了該毒株的滅活疫苗，同時提 供了該鴨細小病毒滅活疫苗的制備方法，具體步驟如下：
[0009] (1)病毒增殖程序將GT2015株按照0. 2血/胚接種9日齡健康鴨胚，12化后收獲 病毒尿囊液，-20°C下保存；
[0010] (2)病毒的滅活病毒尿囊液過濾處理，加入甲醒溶液至終濃度（體積分數(shù)嗎？） 為0. 1 %，然后再37°C滅活16h，期間振搖3-4次，保存于4°C;
[0011] (3)滅活疫苗的的制備
[0012] a.油相的制備白油94份、司盤-80 6份，混合后加熱，加入硬脂酸侶2份混合均 勻，即得油相；
[0013]b.水相的制備吐溫-80 4份、滅活濃縮后的病毒抗原液96份，混合均勻，即得水 相；
[0014]C.混合與乳化6份油相放入膠體磨中，開動機器慢速攬拌，同時緩慢加入3份水 相，加完后W8000-10000r/min乳化3分鐘，然后加入1份水相，繼續(xù)攬拌30秒，在終止 攬拌前加入w/v1 %硫柳隸水溶液，使其終濃度w/v為萬分之一即得。
[0015] 獲得滅活疫苗之后即可通過各種手段檢驗疫苗的效果，結果表明制備的鴨細小病 毒滅活疫苗具有穩(wěn)定的物理性狀和安全性，種鴨免疫后可W使子代維鴨獲得抵抗鴨細小病 毒感染，特別是針對GT2015株的抗感染能力。
[0016] 綜上所述，本發(fā)明首次提出了利用鴨細小病毒GT2015株制備鴨細小病毒滅活疫 苗，該疫苗的研制有效解決了我國當前該病無法預防的現(xiàn)狀，提高肉鴨的出欄合格率，降低 肉鴨養(yǎng)殖的料肉比，減少了該病造成了經濟損失。用GT2015株制備滅活疫苗，方法簡單，短 時間內可制備完畢；安全性高，對環(huán)境沒有任何不良影響；使用操作方便，使用時取出組織 滅活苗注射即可；適于規(guī)模化批量生產和應用；免疫效率高，接種后保護率可至100% ;保 質期長（可達12個月）；滅活苗的病毒株可W通過本發(fā)明的制備方法長期保存，循環(huán)利用。 目前該病在我國南方地區(qū)的番鴨、半番鴨群和北方地區(qū)的肉鴨群中均有流行，該疫苗的制 備為我國有效防控該病提供了技術保障。
[0017] 發(fā)明人對本發(fā)明所公開的鴨細小病毒GT2015進行了生物保藏，保藏單位為中國 典型培養(yǎng)物保藏中屯、，具體保藏信息如下：
[0018] 保藏信息
[0019] 保藏時間：2015年8月28日
[0020] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC
[0021] 保藏編號：CCTCCNO:V201527
[0022] 保藏單位地址：中國武漢大學
[0023] 分類命名：鴨細小病毒GT2015
【附圖說明】
[0024] 圖1為鴨細小病毒GT2015株的PCR檢測結果，其中M為DL2000DNAmarker, 1 : 組織樣本PCR擴增結果；2、3、4、5分別為第2-5代病毒液PCR擴增結果；
[002引圖2為不同水禽細小病毒的VP3基因序列比較分析圖。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1
[0027] 病毒的分離和鑒定
[0028] 2015年4月，對采集自山東高唐地區(qū)的患鴨，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，上下瞭萎縮 等，取肝臟經研磨、凍融、過濾除菌后，接種于9日齡鴨胚，進行病毒分離，并對分離株進行 PCR、EID50毒價測定、動物回歸試驗等鑒定。結果顯示，成功擴增得到目的片段；病毒毒力 為10& 7EID50/0. 2mL;動物感染試驗的接種鴨出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和病理變化，與臨床發(fā)病 鴨一致。由此確定分離株為鴨細小病毒，命名為GT2015株，發(fā)明人對其進行生物保藏，保藏 編號（CCTCCNo:V201528)。具體過程如下：
[0029] 1.病料的處理取短瞭長舌癥狀患鴨的肝臟，按常規(guī)方法勻漿、反復凍融3次， 4°C，12000r/min離屯、lOmin，取上清液，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0030] 2.病毒鴨胚分離傳代將上清過濾后，按照0. 2血/胚尿囊膜接種9日齡健康鴨胚， 12化后收獲尿囊液，盲傳S代?？梢婙喤吣蚰夷啙帷⒃龊?，分離的毒株命名為GT2015株， 將該毒株繼續(xù)傳代，至第五代時病毒增殖狀況良好，提取2-5代病毒尿囊液DNA，進行PCR檢 ，檢測結果均為陽性（如圖1所示）。
[0031] 3.GT2015株的鑒定分別采用禽流感病毒、新城疫病毒、鴨攝病毒、坦布蘇病毒、禽 腺病毒、I型