一種用于激活乳腺癌特異性免疫反應(yīng)的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種增強(qiáng)抗癌免疫的試劑盒，尤其設(shè)及一種用于激活乳腺癌特異性免 疫反應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 女性乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上 皮組織的惡性腫瘤。乳腺癌中99%發(fā)生在女性，男性僅占1%。
[0003] 乳腺并不是維持人體生命活動(dòng)的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌 細(xì)胞喪失了正常細(xì)胞的特性，細(xì)胞之間連接松散，容易脫落。癌細(xì)胞一旦脫落，游離的癌細(xì) 胞可W隨血液或淋己液播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危及生命。目前乳腺癌已成為威脅女性身屯、健 康的常見腫瘤。
[0004] 全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生 中就會(huì)有1人患乳腺癌。中國不是乳腺癌的高發(fā)國家，但不宜樂觀，近年我國乳腺癌發(fā)病 率的增長速度卻高出高發(fā)國家1~2個(gè)百分點(diǎn)。據(jù)國家癌癥中屯、和衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制 局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示：全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性 惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率（粗率）全國合計(jì)為42. 55/10萬，城市為51. 91/10 萬，農(nóng)村為23. 12/10萬。
[0005] 自進(jìn)入二十一世紀(jì)W來，分子生物學(xué)與免疫學(xué)的長足進(jìn)步為臨床腫瘤治療提供了 新的策略。通過分子生物學(xué)的手段已鑒定出大量的腫瘤細(xì)胞特異性的抗原，并通過生物信 息學(xué)的手段分析出其被免疫細(xì)胞識(shí)別的位點(diǎn)，運(yùn)為重建患者的腫瘤特異性免疫反應(yīng)帶來的 可能。但是最近十年W來的一系列臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，W腫瘤特異性抗原膚為基礎(chǔ)的腫瘤 疫苗的臨床效果令人失望，其中一個(gè)重要的原因是抗原提呈過程的缺陷。
[0006]XiZhao等人用慢病毒感染的DC細(xì)胞使其持續(xù)性高表達(dá)外源性IL12,發(fā)現(xiàn) DC.IL12細(xì)胞能夠高效的誘導(dǎo)抗原特異性CTL細(xì)胞的產(chǎn)生，將DC.IL12與腫瘤抗原膚回輸至 小鼠體內(nèi)可顯著性的縮小腫瘤腫塊。感染空載病毒的DC細(xì)胞并不能有效的激發(fā)相應(yīng)的免 疫反應(yīng)，回輸后對(duì)小鼠的腫瘤大小無顯著性的影響。該研究提示了高表達(dá)IL12的DC細(xì)胞 對(duì)于腫瘤疫苗發(fā)揮其抗癌臨床作用的重要性。
[0007]DC細(xì)胞是哺乳類動(dòng)物體內(nèi)具有抗原提呈能力的一類細(xì)胞，其主要功能是攝取、加 工處理和遞呈抗原，激活或調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。T細(xì)胞因此被激活而生成MHC-I類限制性 CD8陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（切totoxicTIympho巧te，CTL)和MHC-II類限制性的CD4陽性的 一型T輔助細(xì)胞（typelThelper,Thl)。一型極化樹突狀細(xì)胞（Typel化IarizedDen^itic cell,DC1)是成熟DC細(xì)胞的一類亞群，具有強(qiáng)有力的免疫激活能力。DCl細(xì)胞的重要的特 征是高表達(dá)IL12P70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特異性的CD8+T細(xì)胞和 CD4+Thl細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)。Ro化ieB.Mailliard等證實(shí)了DCl體外誘導(dǎo)黑色素瘤抗原 特異性的CTL細(xì)胞的能力可達(dá)到正常的成熟DC細(xì)胞的40倍W上。A化ianaTLarregina 等人還發(fā)現(xiàn)DCl細(xì)胞誘導(dǎo)B16黑色素瘤抗原特異性CD4+輔助性T細(xì)胞，并且促進(jìn)CD4+輔 助性T細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的浸潤。因此，高表達(dá)IL12的DCl細(xì)胞負(fù)載腫瘤特異性抗原膚可W 為增強(qiáng)抗原膚為基礎(chǔ)的腫瘤治療療效提供了一種策略，但現(xiàn)有技術(shù)中還沒有能夠相應(yīng)的、 成熟的并適用于激活乳腺癌病人特異性免疫反應(yīng)的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出一種試劑盒用于乳腺癌的臨床治療。體 外誘導(dǎo)腫瘤患者自體的DC細(xì)胞，獲得富集DCl細(xì)胞的產(chǎn)物；DCl細(xì)胞負(fù)載腫瘤特異性膚段 組合，可W用于體外或體內(nèi)的腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的技術(shù)措施為：
[0010] 本發(fā)明提供了一種用于激活乳腺癌特異性免疫反應(yīng)的試劑盒，包括有RPMI-1640 培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)上清、GM-CSF、比-4、INF丫W(wǎng)及乳腺癌特異性抗原多膚組合；其中，所述 細(xì)胞培養(yǎng)上清為NK細(xì)胞與K562細(xì)胞共培養(yǎng)上清或者T細(xì)胞培養(yǎng)上清；所述乳腺癌特異性 抗原多膚組合為MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、NY-ES0-1-A2、PLAC1-A2、PIWIL2-A2、CEA-A2、 CEA-A3、Mamag1Obin-A-A3、NY-BR-1-A2、肥R2-A2、肥R2-A3、MTA1-A2，其多膚序列分別如沈Q IDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈QIDNo. 3,沈QIDNo. 4,沈QIDNo. 5,沈QIDNo. 6,沈QID No. 7,SEQIDNo. 8,SEQIDNo. 9,SEQIDNo. 10,沈QIDNo. 11 及沈QIDNo. 12 所示。
[0011] 為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0012] 優(yōu)選地，NK細(xì)胞與K562細(xì)胞共培養(yǎng)上清通過將K562細(xì)胞與NK細(xì)胞按1:2至1:10 比例共培養(yǎng)并加入IFNa，24小時(shí)后收集培養(yǎng)基上清而獲得。
[0013] 優(yōu)選地，所述T細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備過程中，首先分離外周血單核細(xì)胞，淋己 細(xì)胞分離液分理單個(gè)核細(xì)胞，用CD8磁珠分選出CD8+T細(xì)胞后，接種至培養(yǎng)基中，加入 CD3CD28Beads，2地后加入等量培養(yǎng)基，4化后收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清。
[0014] 優(yōu)選地，利用試劑盒激活乳腺癌病人腫瘤特異性免疫反應(yīng)包括W下步驟：
[0015] 步驟一，分離病人外周血中的單核細(xì)胞，細(xì)胞短暫貼壁培養(yǎng)之后，移除懸浮細(xì)胞， 加入誘導(dǎo)劑GM-CSF和IL-4培養(yǎng)兩天，培養(yǎng)第3天，第5天更換一半量的培養(yǎng)基，并加入乳 腺癌特異性抗原多膚組合，獲得負(fù)載有乳腺癌特異性抗原多膚組合的成熟DC細(xì)胞；
[0016] 步驟二，將所述步驟一中制得的成熟DC細(xì)胞用INF丫W(wǎng)及所述的NK細(xì)胞與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)上清進(jìn)一步培養(yǎng)誘導(dǎo)兩天，使所述的成熟DC細(xì)胞分化為DCl細(xì)胞；
[0017] 步驟=，利用步驟二所獲得的DCl細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)主動(dòng)誘導(dǎo)和/或體外被動(dòng)誘導(dǎo)。
[0018] 優(yōu)選地，所述NK細(xì)胞來源于人類廝帶血。
[0019] 優(yōu)選地，所述T細(xì)胞培養(yǎng)上清為利用自體或異體T細(xì)胞獲得。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟=中的體內(nèi)主動(dòng)誘導(dǎo)過程為將所述步驟二所獲得的DCl細(xì)胞回 輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟=中的體外被動(dòng)誘導(dǎo)過程為將所述步驟二所獲得的DCl細(xì)胞與 T細(xì)胞混合培養(yǎng)，并再次負(fù)載乳腺癌特異性抗原多膚，然后收集細(xì)胞，回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
[0022] 優(yōu)選地，試劑盒還可W包括GG巧51培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。
[0023]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果體現(xiàn)在W下幾個(gè) 方面：
[0024] 首先，本發(fā)明提供了一組用于乳腺癌免疫治療的特異性抗原多膚組合，該組合包 含了 12種乳腺癌細(xì)胞的特異性表達(dá)抗原的膚段。運(yùn)些膚段包括了HLA-A2與A3呈遞的序 列區(qū)域，覆蓋了 80%W上的已報(bào)道的乳腺癌細(xì)胞特異性抗原。因此，我們提供了一種新的 乳腺癌特異性抗原多膚組合，有利于激活罹患食管癌病人的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的獲得性免疫反 應(yīng)。
[00巧]其次，本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明的試劑盒，體外制備成熟DCl細(xì)胞，用于負(fù) 載乳腺癌細(xì)胞特異性抗原組合的方法。與常用誘導(dǎo)方案相比，利用本發(fā)明試劑盒所制備的 產(chǎn)物中擁有成熟表型的DC細(xì)胞含量顯著性提高（如CD80,CD86,CD4化等表面抗原高表 達(dá)）；經(jīng)過SCD4化刺激之后，DCl細(xì)胞IL12P70表達(dá)量大大高于通用方案制備細(xì)胞的表達(dá) 量。由此可見，本發(fā)明提供了一個(gè)更有效成熟DCl細(xì)胞制備方案，所得細(xì)胞產(chǎn)物可W用于乳 腺癌細(xì)胞特異性抗原負(fù)載。
[0026] 最后，本發(fā)明提供了一種用于乳腺癌治