專利名稱：一種仿生物特異性免疫吸附材料及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種仿生物特異性免疫吸附材料，特別是涉及ー種可用于血液浄化的仿生物特異性免疫吸附材料及其制備方法。本發(fā)明涉及采用點擊化學(click chemistry)的方法實現(xiàn)載體與配基的偶聯(lián)，制備仿生物特異性免疫吸附材料，。
背景技術：
免疫吸附(immunoadsorption)療法是ー種基于親和層析原理以實現(xiàn)血液凈化的ー種新技術，用于治療一些傳統(tǒng)方法難以奏效的疾病。它是將對某些具有專一而可逆親和力的生物活性分子作為配基與載體結合，制成吸附柱，利用其特異吸附性能，特異性地清除患者血液中的致病因子，從而達到凈化血液，預防及治療疾病的目的。自1979年Terman首次報道用DNA免疫吸附劑血液灌流治療一例重度系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者獲得成功后，免疫吸附療法日益受到臨床醫(yī)學的重視。·
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對免疫吸附療法的療效起決定性作用的是免疫吸附材料(也稱為免疫吸附劑)。目前，國外臨床應用的免疫吸附材料主要是以蛋白A為配基的吸附材料，它可以清除患者體內(nèi)的IgG等致病因子。蛋白A吸附材料自從上世紀80年代應用于自身免疫性疾病治療以來，它對多種疾病的治療有效性已經(jīng)得到證實，并獲得美國FDA批準，成為多種自身免疫性疾病的推薦療法。但是，蛋白A吸附材料也存在一些缺陷，限制了它的廣泛使用。首先，蛋白A價格高昂，占蛋白A免疫吸附材料成本的80%左右，給普通患者帶來了極其沉重的經(jīng)濟負擔；其次，蛋白A作為ー種蛋白質(zhì)配基，穩(wěn)定性不高，容易變性，為吸附材料的生產(chǎn)、運輸、保存和使用帶來不便；其三，蛋白A是ー種蛋白質(zhì)大分子，如果治療過程中出現(xiàn)脫落則會給患者安全帶來風險。因此，如何克服蛋白A吸附材料的這些缺陷，設計和制備既具有與蛋白A吸附材料相當?shù)拿庖呶叫剩志哂蟹€(wěn)定的物理化學性質(zhì)和相對低廉的成本的新型免疫吸附材料，具有重要的研究價值和現(xiàn)實意義。與蛋白A類生物大分子相比，化學合成的小分子化合物在成本和物理化學穩(wěn)定性上都具有顯著優(yōu)勢，故很多研究著眼于篩選和設計具有仿生物親和作用的小分子配基，即模擬生物特異性配基或仿生配基(pseudobiospecific ligand),進而研究以這類小分子物質(zhì)為配基的IgG吸附材料。在這些仿生配基中，氨基酸由于其無毒，價廉和對IgG的高選擇性已代替蛋白質(zhì)用于親和色譜方面。有報道證明氨基酸能高效地從人血漿或血清中分離出IgG。然而，目前所研究的這類非蛋白A類的免疫吸附材料在實際應用中還不能達到與蛋白A吸附材料相當?shù)姆蛛x或治療效果。其主要原因在于吸附材料與抗體的結合力和選擇性上還不夠理想。因此，如何在降低成本的同時，提高吸附材料與抗體的結合能力和選擇性對于設計和制備吸附性能與蛋白A吸附劑相當?shù)男滦兔庖呶讲牧鲜签`個非常重要的問題。作為免疫吸附材料的載體-配基復合物，其制備過程一般包括兩個基本過程載體活化以及活性載體與配基的偶聯(lián)。在免疫吸附材料的制備過程中，多糖基載體活化最通常的方法是先將其羥基氧化后，接上ニ胺類間隔臂，再經(jīng)醛化(一般用戊ニ醛)生成希夫堿；然后，還原成烷胺鍵化合物。經(jīng)活化的活性載體直接與未經(jīng)修飾的配基通過烷胺鍵偶聯(lián)。該制備方法中，活化步驟繁瑣，且經(jīng)過多步活化反應后，載體的總活化率大大降低。而且烷胺鍵對蛋白A的反應選擇性并不高。因此，活性載體與配基之間的反應不具有高選擇性和高效性，從而極大地影響了免疫吸附材料的吸附性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的g在提供ー種安全、有效、成本低廉，性能穩(wěn)定可靠的仿生物特異性免疫吸附材料。本發(fā)明第二目的是提供上述仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法。本發(fā)明第三個目的在于提供上述仿生物特異性免疫吸附材料在IgG分離中的應用。本發(fā)明以含有豐富羥基，血液相容性和機械性能良好的瓊脂糖凝膠為載體，以廉價、穩(wěn)定、易于保存和消毒的氨基酸為仿生配基，采用ー種高效、高選擇性的方法-點擊化學設計和制備ー種對IgG具有高選擇性，且成本低廉，性能穩(wěn)定可靠，效果與蛋白A吸附材料相當?shù)姆律锾禺愋悦庖呶讲牧稀｜c擊化學(Click Chemistry)于2001年由諾貝爾化學獎獲得者美國化學家Sharpless提出，指那些最佳的化學反應。這些反應的活性組件衍生于烯烴和炔烴，絕大部分反應涉及碳-雜原子鍵的形成；反應易于操作，對空氣和水不敏感，井能高產(chǎn)率生成目標產(chǎn)物，很少甚至沒有副產(chǎn)物，而且不會受相連在一起的其他官能團影響，即反應具有選擇性。最廣泛使用的點擊反應是Cu ( I )催化的Huisgen 1，3-偶極環(huán)加成反應，即疊氮化合物和炔基化合物反應都能生成含有三唑的化合物。由于點擊化學可以在不同的分子和材料間有效地實現(xiàn)共價連接，疊氮基和端基炔彼此間有非常高的選擇性，因而能高產(chǎn)率地生成目標產(chǎn)物。所生成的反應物在生理條件下的惰性及溫和的反應條件為體內(nèi)、體外生物的應用提供了極大的便利，如其在生物耦聯(lián)方面的應用越來越廣泛。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)ー種仿生物特異性免疫吸附材料，具有如下的化學結構
權利要求
1.一種仿生物特異性免疫吸附材料，其特征在于具有如下的化學結構
2.權利要求I所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件 Ca)疊氮化瓊脂糖凝膠的制備 向環(huán)氧化瓊脂糖中加入疊氮化鈉的水溶液，每克環(huán)氧化瓊脂糖中加入疊氮化鈉3 15mmol，20 60° C反應6 60h后，洗滌抽干得產(chǎn)物； (b)炔酸的合成 將丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇于一 10 10° C下混合，丁二酸酐與炔丙醇的摩爾比為I 3 I ;然后加入催化劑4-二甲氨基吡啶及縛酸劑三乙胺或吡啶，催化劑、縛酸劑與炔丙醇的摩爾比為0.01 O. I O. I I. O 1，保溫反應O. 5 3h后回流12 72h，洗滌干燥得炔酸； (c)制備炔酸的活性酯 將所述炔酸和N-羥基丁二酰亞胺溶于1，4- 二氧六環(huán)后，加入縮合劑N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺并于一 10 10° C下保溫反應0.5 3h后，升溫至20 60° C反應12 72h，過濾、旋蒸，并進行柱層析純化得炔酸的活性酯；其中N-羥基丁二酰亞胺、N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺與炔酸的摩爾比為I 3 : I 3 : I; (d)炔化氨基酸的合成 將炔酸的活性酯溶于1，4-二氧六環(huán)后與配基的水溶液混合；用碳酸鈉溶液或三乙胺調(diào)pH至9. O 12. O,然后于20 80° C反應12 72h ;反應完畢以鹽酸或飽和檸檬酸水溶液調(diào)混合液的pH至2. O 5. 0，再用乙酸乙酯及水萃取后進行柱層析純化得產(chǎn)物；其中氨基酸與炔酸的活性酯的摩爾比為I 3 : I ;所述配基為L-組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸； Ce)點擊反應制備免疫吸附材料 將炔化氨基酸的溶液加入疊氮化瓊脂糖中，每克疊氮化瓊脂糖加入3 IOmmol炔化氨基酸，然后依次加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉作催化劑，五水硫酸銅、抗壞血酸鈉與炔化氨基酸的摩爾比為O. 01 O. 05 O. 02 O. I I;混合物于20 80。C反應12 72h后，洗滌抽干得產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求2所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于所述環(huán)氧化瓊脂糖通過如下方法制備按每克瓊脂糖凝膠加入2mL環(huán)氧氯丙烷和I 2mL氫氧化鈉溶液的比例，將瓊脂糖凝膠、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液混合后室溫下攪拌反應3 4h，以水洗滌，抽干直到在洗滌液中加入I. 3M硫代硫酸鈉后酚酞不變紅為止，即得環(huán)氧化瓊脂糖；所述氫氧化鈉溶液的濃度為I. 5 3M。
4.根據(jù)權利要求2所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于所述丁二酸酐溶于二氯甲烷中，每Immol 丁二酸酐中二氯甲烷加入量為O. 5^2. 5mL。
5.根據(jù)權利要求2所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于所述炔酸和N-羥基丁二酰亞胺溶于1，4- 二氧六環(huán)中，每Immol炔酸中1，4- 二氧六環(huán)的加入量為 O. 2 I. OmL。
6.根據(jù)權利要求2所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于所述炔酸的活性酯溶于1，4_ 二氧六環(huán)中，每Immol炔酸的活性酯中1，4-二氧六環(huán)的加入量為O.5 2. 5mL0
7.根據(jù)權利要求2所述的仿生物特異性免疫吸附材料的制備方法，其特征在于所述炔化氨基酸溶于DMF或1，4- 二氧六環(huán)中，每Immol炔化氨基酸中DMF或1，4- 二氧六環(huán)的加入量為I. 0 3. OmL。
8.權利要求I所述的仿生物特異性免疫吸附材料在IgG分離中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種仿生物特異性免疫吸附材料及其制備方法與應用。制備時，先通過環(huán)氧化瓊脂糖與疊氮化鈉反應得疊氮化瓊脂糖凝膠；將丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇，加入催化劑，制得炔酸；將炔酸和N-羥基丁二酰亞胺溶于1，4-二氧六環(huán)后，加入縮合劑，制得炔酸的活性酯，將炔酸的活性酯溶于1，4-二氧六環(huán)后與配基的水溶液混合，制得炔化氨基酸，將炔化氨基酸的溶液加入疊氮化瓊脂糖中，加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉作催化劑，制得產(chǎn)物。本發(fā)明以含有豐富羥基，血液相容性和機械性能良好的瓊脂糖凝膠為載體，合成步驟簡單、制備安全；產(chǎn)品具有特異性強、對IgG的吸附效率高、再生性能好的特性，可用于IgG分離和臨床上免疫吸附治療。
文檔編號B01J20/26GK102671638SQ20121015239
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者李光吉, 胡小艷 申請人:華南理工大學