本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及dna片段與含有該片段的重組載體、構(gòu)建重組載體的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性白血病是一種比較常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是人類致死的主要原因之一。近年來，隨著聯(lián)合化療和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展，使得白血病及其它血液系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后不斷改善，然而由于腫瘤的微小殘留病變(mrd)不能被徹底清除，疾病復(fù)發(fā)率及死亡率較高。

研究發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗能夠激發(fā)白血病患者特異性免疫應(yīng)答，清除化療后殘余腫瘤細(xì)胞，是有望克服mrd的方法之一。padua等將人類早幼粒細(xì)胞白血病的pml-rarα融合基因與破傷風(fēng)毒素基因的c片段序列融合，證實(shí)以融合蛋白為特異性靶點(diǎn)的核酸疫苗可以顯著提高患病動物的生存率。mlaa-34基因是與急性單核細(xì)胞白血病(aml-m5)發(fā)生密切相關(guān)的一個新的抗凋亡分子，mlaa-34基因表達(dá)下調(diào)能顯著抑制u937細(xì)胞在體外的增值，同時會誘發(fā)白血病細(xì)胞的凋亡，并與aml-m5的低生存率等不良預(yù)后密切相關(guān)，是急性白血病的新腫瘤標(biāo)志物及基因免疫治療的靶基因。mlaa-34蛋白是胞內(nèi)蛋白，如何有效遞呈mlaa-34蛋白至白血病細(xì)胞膜表面從而持續(xù)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫并成為效應(yīng)細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)的靶向分子，是疫苗能否發(fā)揮抗白血病作用的關(guān)鍵。hsp70與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤免疫和腫瘤的預(yù)后等都有密切關(guān)系，其具有抗原遞呈功能，能將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原信息傳遞至細(xì)胞膜上，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，且其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可不受mhc限制，可以起到很好的抗腫瘤免疫效應(yīng)，從而起到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。

此外，關(guān)于核酸疫苗能否整合到宿主基因組上的安全性問題一直備受關(guān)注。研究表明，免疫方式對dna疫苗的整合安全性有很大影響，電穿孔免疫方式會導(dǎo)致基因組整合現(xiàn)象，而肌肉注射和基因槍(genegun)免疫方式較為安全，核酸疫苗的質(zhì)粒dna是以染色體外附加子的形式存在，而不是整合到宿主染色體dna上。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的之一是提供一組dna片段。

本發(fā)明的發(fā)明目的之二是提供包括上述dna片段的重組載體。

本發(fā)明的發(fā)明目的之三是提供構(gòu)建上述重組載體的方法。

本發(fā)明的發(fā)明目的之四是提供通過上述重組載體進(jìn)行基因疫苗的制備。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

dna片段，由序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成。

含有外源多核苷酸的重組載體，包含原始載體以及hsp70-mlaa34融合基因；

其中，所述融合基因包含序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成的dna片段。

優(yōu)選的是，所述原始載體為pires2-egfp質(zhì)粒。

構(gòu)建含有外源多核苷酸的重組載體的方法，包括：

步驟一、利用序列表中的seqidno.2和seqidno.3所示的引物序列通過pcr擴(kuò)增得到含有seqidno.4所示的堿基序列的hsp-70基因；

利用序列表中的seqidno.5和seqidno.6所示的引物序列通過pcr擴(kuò)增得到含有seqidno.7所示的堿基序列的mlaa-34基因；

步驟二、以hsp-70基因和mlaa-34基因?yàn)槟０?，利用序列表中的seqidno.2和序列表中的seqidno.6所示的引物序列，通過soe-pcr擴(kuò)增得到序列表中的seqidno.1所示的hsp70-mlaa34融合基因，并且使其含有ecori和bamhi酶切位點(diǎn)；

步驟三、將步驟二所述的hsp70-mlaa34融合基因構(gòu)建到原始載體上以得到重組載體。

優(yōu)選的是，所述原始載體為pires2-egfp質(zhì)粒。

優(yōu)選的是，包括如權(quán)利要求3所述的重組載體以及u937細(xì)胞。

優(yōu)選的是，其轉(zhuǎn)染方法包括如下：

取u937細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行接種，另取兩份培養(yǎng)基，在其中一份培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染試劑，在另一份中加入含有hsp70-mlaa34融合基因的重組載體，將兩份培養(yǎng)基混合均勻，將混合均勻后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞中，混合均勻，將細(xì)胞置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～48小時；其中，轉(zhuǎn)染4～6小時后可換新鮮培養(yǎng)基。

優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染方法包括如下：

步驟a、取u937細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，37℃、5％co2培養(yǎng)，每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)；

步驟b、收集u937細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加u937細(xì)胞100μl；

步驟c、用50μl的opti-mem培養(yǎng)基稀釋0.8μg含有hsp70-mlaa34融合基因重組載體，輕輕吹吸3～5次混勻；

步驟d、輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50μl的opti-mem培養(yǎng)基稀釋2.0μl的lipofectaminetm3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置5分鐘；

步驟e、混合所述步驟c的含有重組載體的培養(yǎng)和所述步驟d的轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20分鐘，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物；

步驟f、將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100μl/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻；

步驟g、將細(xì)胞板置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～48小時；其中，轉(zhuǎn)染4～6小時后可換新鮮培養(yǎng)基。

使用包括所述的重組載體制備基因疫苗，所述重組載體包含序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成的dna片段。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較所具有的有益效果：

1、核酸疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后可被抗原提呈細(xì)胞或機(jī)體組織細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，免疫保護(hù)作用好；

2、通過soe-pcr技術(shù)在設(shè)計引物時，重疊序列可以是基因序列上的任意位點(diǎn)，不需要考慮融合位點(diǎn)及其附近特殊序列，通過特定的重疊互補(bǔ)序列的引物作為橋梁，從而使pcr擴(kuò)增產(chǎn)物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將pcr擴(kuò)增片段拼接起來，從而將兩個目的基因融合在一起，相比于限制性內(nèi)切酶的酶切和連接酶的連接更加簡便快捷。

附圖說明

圖1為soe-pcr法擴(kuò)增hsp70-mlaa34融合基因經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中，1為分子量標(biāo)記，2為hsp70-mlaa34融合基因，3為hsp70基因，4為mlaa34基因。

圖2為pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中，1為分子量標(biāo)記，2為pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒，3為雙酶切鑒定結(jié)果，4為pcr鑒定結(jié)果。

圖3為驗(yàn)證基因凝膠電泳圖像；其中，1為分子量標(biāo)記，2為pires2-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染u937細(xì)胞，3為pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染u937細(xì)胞，4為驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)染u937細(xì)胞。

圖4為目的蛋白在u937細(xì)胞內(nèi)表達(dá)檢測圖。

圖5為目的蛋白在u937細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成像分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明中的“重組載體”是指已連接了基因的表達(dá)載體，可交互使用“重組質(zhì)?！薄ⅰ爸亟M載體”和“核酸疫苗”。

實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1、質(zhì)粒和細(xì)胞

u937細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；pires2-egfp質(zhì)粒購自addgene公司。

2、動物

balb/c鼠[無特定病原體(spf)級，雌性，6～8周齡]購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司

3、試劑、酶與藥品

噻唑藍(lán)(mtt)試劑、限制性內(nèi)切酶(ecorⅰ/bamhⅰ)購自美國neb公司；總rna提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)試劑盒、t4dna連接酶、膠回收純化和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)等試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、rpmi1640(高糖)培養(yǎng)基購自美國hyclone公司；無水乙醇、氯仿等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

實(shí)施例

一、基因重組構(gòu)建pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒：

1、引物設(shè)計：

根據(jù)質(zhì)粒pires2-egfp多克隆位點(diǎn)情況選取ecorⅰ和bamhⅰ酶切位點(diǎn)進(jìn)行基因克隆，mlaa-34基因(genbank：ay288977.2)擴(kuò)增片段理論長度為1014bp，hsp70基因(genbank：nm_005345.5)擴(kuò)增片段理論長度為1927bp，利用序列表中seqidno.3所示的引物和序列表中seqidno.5所示的引物設(shè)計重疊序列g(shù)gcggcggcggcggc，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

步驟一、u937細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，37℃、5％co2，收集u937細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加u937細(xì)胞100μl作為脾淋巴細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。

步驟二、hsp-70基因擴(kuò)增以及基因提取

收集培養(yǎng)的u927細(xì)胞，trizol法抽提總rna，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)rna(crna)，使用下述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到序列表中seqidno.4所示的堿基序列的dna片段，即為hsp-70基因：

上游端引物：

5′-gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt-3′(序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-ggcggcggcggcggctcaaggggccgttttcttcaag-3′(序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列)；

pcr反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s，共30個循環(huán)；最后72℃，5min；pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物；

步驟三、mlaa-34基因擴(kuò)增以及基因提取

收集培養(yǎng)的u927細(xì)胞，trizol法抽提總rna，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)rna(crna)，使用下述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到序列表中seqidno.7所示的堿基序列的dna片段，即為mlaa-34基因：

上游端引物：

5′-ggcggcggcggcggcatggccaaagccgcggcgatc-3′(序列表中seqidno.5所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-cgggatccctaatctacctcctcaatggtg-3′(序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列)；

pcr反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s，共30個循環(huán)；最后72℃，5min；pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物。

步驟四、soe-pcr法擴(kuò)增hsp70-mlaa34融合基因：

將回收純化的pcr產(chǎn)物，以mlaa-34基因和hsp-70基因?yàn)槟０澹孟率鲆镞M(jìn)行soe-pcr擴(kuò)增得到序列表中seqidno.1所示的堿基序列的dna片段，即為hsp70-mlaa34融合基因：

上游端引物：

5′-gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt-3′(序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-cgggatccctaatctacctcctcaatggtg-3′(序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列)；

soe-pcr反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，60s，共30個循環(huán)；最后72℃，5min；soe-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化soe-pcr產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示；

步驟五、真核表達(dá)載體pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

提取質(zhì)粒pires2-egfp，與回收的hsp70-mlaa34融合基因片段分別進(jìn)行ecorⅰ/bamhⅰ雙酶切，37℃，1.5h，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收純化，利用t4dna連接酶將hsp70-mlaa34融合基因亞克隆至pires2-egfp質(zhì)粒中，16℃連接過夜，構(gòu)建pires2-hsp70-mlaa34重組質(zhì)粒；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(e.coli)dh5α感受態(tài)細(xì)胞，并在卡那霉素抗性lb培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)；將卡那霉素抗性lb培養(yǎng)基上生長的陽性轉(zhuǎn)化克隆子編號，用接種環(huán)挑取克隆子(不要完全挑完)于3ml的lb液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，次日提取pires2-hsp70-mlaa34質(zhì)粒并進(jìn)行pcr擴(kuò)增和酶切鑒定，挑取陽性克隆菌，擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行pcr及ecorⅰ/bamhⅰ雙酶切鑒定，經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

二、細(xì)胞水平檢測

步驟一、細(xì)胞培養(yǎng)

取u937細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，37℃，5％co2培養(yǎng)，每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

步驟二、重組載體轉(zhuǎn)染u937細(xì)胞

(1)收集u937細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加u937細(xì)胞100μl作為脾淋巴細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞；

(2)用50μl的opti-mem稀釋0.8μg重組載體，輕輕吹吸3～5次混勻；

(3)輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50μl的opti-mem稀釋2.0μl的lipofectaminetm3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置5min；

(4)混合(2)和(3)，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20min；

(5)轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100μl/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻；

(6)將細(xì)胞板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～48hrs，轉(zhuǎn)染4～6hrs后可換新鮮培養(yǎng)基。

步驟三、目的基因mrna在u937細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平檢測

分別取轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染兩天后的u937細(xì)胞1×10⁷，加入1ml的trizol試劑，0.2ml氯仿抽提，吸取上清液后用0.5ml異丙醇沉淀rna，再用75％乙醇洗滌沉淀，自然涼干后用depc水溶解并定量；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總mrna反轉(zhuǎn)錄為cdna，紫外分光光度計測定其濃度；設(shè)計引物為上游引物：5′-ccccatcatcagcggactg-3′(序列表中的seqidno.8所示)，下游引物：5′-cttctgttgggggttcttt-3′(序列表中的seqidno.9所示)，以cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到驗(yàn)證基因(序列表中的seqidno.10所示)以確定目的基因在u937細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，驗(yàn)證基因?yàn)槟康幕蛑械囊徊糠?，pcr反應(yīng)體系包括2.5μl10×buffer，2.5μldntps，1.0μgcdna模板，0.1μltaq酶(5u/μl)，上下游引物各1μl，加ddh2o至25μl；

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃，30s；62℃，30s,；72℃，30s；循環(huán)30次，再72℃延伸10min，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物以1％瓊脂糖電泳，genius凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

步驟四、目的蛋白在u937細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平及蛋白活性檢測(western-blot)

轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，加入裂解液150μlripa(1％pmsf)，吹打細(xì)胞，收集到離心管中，冰浴30min，12000r/min離心10min，提取總蛋白，取上清加入2xsds上樣緩沖液，煮沸5min，離心后取上清做sds-page電泳，電轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，用mlaa-34單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠igg作為二抗，ecl顯色后在生物分子成像儀內(nèi)成像分析，結(jié)果如圖4、圖5所示。

三、整體水平進(jìn)行檢測

步驟一、重組載體免疫balb/c小鼠

質(zhì)粒dna大量制備和純化(按試劑盒說明書進(jìn)行)并用生理鹽水調(diào)整至1.0g/l；balb/c鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只；對照組a組、實(shí)驗(yàn)組b、c、d組分別在小鼠兩側(cè)股四頭肌內(nèi)肌內(nèi)注射空質(zhì)粒pires2、pires2-mlaa34、pires2-hsp70和pires2-mlaa34-hsp70，每只100μg；小鼠每次接種前24h，均用0.25％布比卡因100μl預(yù)處理；在0、2、4周進(jìn)行3次同樣劑量免疫。

步驟二、脾淋巴細(xì)胞懸液的制備

末次免疫后第7天，處死小鼠，置70％乙醇浸泡3～5min，無菌取脾臟，置于不含胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，剪去脂肪及筋膜組織，于200目不銹鋼網(wǎng)篩上研碎，重懸于含5％胎牛血清的hank′s液中，2000r/min離心5min，低滲裂解紅細(xì)胞，用含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基清洗3次，并調(diào)整濃度為1×10⁷/ml。

步驟三、脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的檢測與結(jié)果

取步驟二中制備的脾淋巴細(xì)胞懸液，倍比稀釋；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各反應(yīng)孔中加脾淋巴細(xì)胞100μl，使效靶比分別為50：1、25：1、12.5：1和6.25：1(各設(shè)3個復(fù)孔)，在37℃，5％co2中孵育24h，測定每組小鼠特異性淋巴細(xì)胞殺傷活性；反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入20μlmtt工作液，37℃反應(yīng)4h，棄去mtt反應(yīng)液，每孔加入二甲基亞楓(dmso)200μl，室溫振蕩10min，酶標(biāo)儀測定570nm處吸光度值(a570)。脾淋巴細(xì)胞殺傷活性(％)＝[1-(反應(yīng)孔a570-效應(yīng)細(xì)胞對照孔a570)/靶細(xì)胞對照孔a570]×100％。

將核酸疫苗分組免疫小鼠后，檢測致敏脾淋巴細(xì)胞對u937細(xì)胞的殺傷效率，結(jié)果見表1；其中，核酸疫苗d組的殺傷效率明顯高于a、b、c組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)；而a、b、c組殺傷效率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。

表1小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷活性(％)

*：p＜0.01，與d組比較。

步驟四、細(xì)胞因子水平的檢測與結(jié)果

將步驟二的脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl(各設(shè)3個復(fù)孔)，37℃，5％co2培養(yǎng)72h，以純化的mlaa-34蛋白(20μg/ml)刺激抗原；以刀豆蛋白a(cona，10μg/ml)為陽性對照，未用抗原刺激孔為陰性對照，培養(yǎng)48h后收集上清，elisa法檢測細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素(il)-2、il-4和干擾素-γ(ifn-γ)水平(嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作)。

脾淋巴細(xì)胞懸液經(jīng)純化的mlaa-34蛋白刺激后，elisa法檢測脾細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平，結(jié)果見表2；其中，核酸疫苗d組的細(xì)胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平明顯高于a、b、c組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。b組和c組上述各細(xì)胞因子水平明顯高于a組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。b組和c組間上述各細(xì)胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。

表2小鼠脾淋巴懸液細(xì)胞因子含量(pg/ml)

*：p＜0.01，與a組比較；#：p＜0.01，與d組比較。

5、統(tǒng)計學(xué)處理

采用spss19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料±s以表示，組間比較采用方差分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、結(jié)果分析

核酸疫苗制作簡單、應(yīng)用安全，是白血病免疫治療的策略之一。核酸疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后可被抗原提呈細(xì)胞或機(jī)體組織細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，免疫保護(hù)作用好。在構(gòu)建核酸疫苗時作者使用了soe-pcr技術(shù)，將mlaa-34基因和hsp70基因融合在一起，形成mlaa34-hsp70融合基因。mlaa-34基因與急性單核細(xì)胞白血病的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)能顯著抑制u937細(xì)胞在體外的增殖，同時會誘發(fā)白血病細(xì)胞的凋亡，是理想的急性白血病免疫治療的靶基因。hsp70參與腫瘤基因調(diào)控及細(xì)胞增殖，具有抗原遞呈功能，能強(qiáng)烈刺激免疫系統(tǒng)針對腫瘤抗原的免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，以hsp為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是目前腫瘤疫苗研究中的熱點(diǎn)。

soe-pcr技術(shù)的關(guān)鍵主要在于引物的設(shè)計，在設(shè)計引物時，重疊序列可以是基因序列上的任意位點(diǎn)，不需要考慮融合位點(diǎn)及其附近特殊序列。通過特定的重疊互補(bǔ)序列的引物作為橋梁，從而使pcr擴(kuò)增產(chǎn)物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將pcr擴(kuò)增片段拼接起來，從而將兩個目的基因融合在一起，相比于限制性內(nèi)切酶的酶切和連接酶的連接更加簡便快捷。因此，在融合基因、突變體分子的構(gòu)建過程中，特別是在人類體細(xì)胞敲除、疫苗的研究、多克隆抗體的產(chǎn)生，以及在植物基因工程中具有廣泛的應(yīng)用。本研究設(shè)計引物時采用柔性肽基因ggcggcggcggcggc作為重疊序列，融合蛋白mlaa-34和hsp70之間以柔性肽相連接，保證了兩個蛋白融合表達(dá)且正確折疊，mlaa-34和hsp70皆能發(fā)揮其獨(dú)特功能，從而保證了核酸疫苗的免疫活性。實(shí)驗(yàn)表明，核酸疫苗pires2-mlaa34-hsp70免疫balb/c小鼠后，致敏脾淋巴細(xì)胞對白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷效率，明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組和對照組，說明核酸疫苗pires2-mlaa34-hsp70能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對u937細(xì)胞的特異性殺傷作用；此外，致敏小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平明顯增高，說明該核酸疫苗能誘發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，增強(qiáng)了機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有明顯的免疫保護(hù)作用。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。

sequencelisting

<110>吉林醫(yī)藥學(xué)院

<120>dna片段與含有該片段的重組載體、構(gòu)建重組載體的方法及其應(yīng)用

<130>1

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2994

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaattcatggccaaagcagcggcgatcggcatcgacctgggcaccacctactcctgcgtg60

ggggtgttccaacacggcaaggtggagatcatcgccaacgaccagggcaaccgcaccacc120

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cgggataaaagtcccaacatccagtttgaagcctttcatgtttttaaggtgtttgtggcc2820

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aactacttgattaaacagatccgagacttgaagaaaacggccccttgaggatcc2994

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到hsp-70基因的編碼序列的上游引物

<400>2

gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt32

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到hsp-70基因的編碼序列的下游引物

<400>3

ggcggcggcggcggctcaaggggccgttttcttcaag37

<210>4

<211>1938

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>hsp-70基因的編碼序列

<400>4

gaattcatggccaaagcagcggcgatcggcatcgacctgggcaccacctactcctgcgtg60

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gtgaaggccacggccggggacacccacctgggtggggaggactttgacaacaggctggtg720

aaccacttcgtggaggagttcaagagaaaacacaagaaggacatcagccagaacaagcga780

gccgtgaggcggctgcgcaccgcctgcgagagggccaagaggaccctgtcgtccagcacc840

caggccagcctggagatcgactccctgtttgagggcatcgacttctacacgtccatcacc900

agggcgaggttcgaggagctgtgctccgacctgttccgaagcaccctggagcccgtggag960

aaggctctgcgcgacgccaagctggacaaggcccagattcacgacctggtcctggtcggg1020

ggctccacccgcatccccaaggtgcagaagctgctgcaggacttcttcaacgggcgcgac1080

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ctgtcgctggggctggagacggccggaggcgtgatgactgccctgatcaagcgcaactcc1260

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ctgatccaggtgtacgagggcgagagggccatgacgaaagacaacaatctgttggggcgc1380

ttcgagctgagcggcatccctccggcccccaggggcgtgccccagatcgaggtgaccttc1440

gacatcgatgccaacggcatcctgaacgtcacggccacggacaagagcaccggcaaggcc1500

aacaagatcaccatcaccaacgacaagggccgcctgagcaaggaggagatcgagcgcatg1560

gtgcaggaggcggagaagtacaaagcggaggacgaggtgcagcgcgagagggtgtcagcc1620

aagaacgccctggagtcctacgccttcaacatgaagagcgccgtggaggatgaggggctc1680

aagggcaagatcagcgaggcggacaagaagaaggtgctggacaagtgtcaagaggtcatc1740

tcgtggctggacgccaacaccttggccgagaaggacgagtttgagcacaagaggaaggag1800

ctggagcaggtgtgtaaccccatcatcagcggactgtaccagggtgccggtggtcccggg1860

cctgggggcttcggggctcagggtcccaagggagggtctgggtcaggccccaccattgag1920

gaggtagattgaggatcc1938

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到mlaa-34基因的編碼序列的上游引物

<400>5

ggcggcggcggcggcatggccaaagccgcggcgatc36

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到mlaa-34基因的編碼序列的下游引物

<400>6

cgggatccctaatctacctcctcaatggtg30

<210>7

<211>1026

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>mlaa-34基因的編碼序列

<400>7

gaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagtaaatcacacaaaaatccagcagaaattgtg60

aaaatcctgaaagacaatttggccattttggaaaagcaagacaaaaagacagacaaggct120

tcagaagaagtgtctaaatcactgcaagcaatgaaagaaattctgtgtggtacaaacgag180

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ctagtgacactgatagctgacctgcagctgatagactttgagggaaaaaaagatgtgacc300

cagatatttaacaacatcttgagaagacagataggcactcggagtcctactgtggagtat360

attagtgctcatcctcatatcctgtttatgctcctcaaaggatatgaagccccacagatt420

gccttacgttgtgggattatgctgagagaatgtattcgacatgaaccacttgccaaaatc480

atcctcttttctaatcaattcagagatttctttaagtacgtggagttgtcaacatttgat540

attgcttcagatgcctttgctactttcaaggatttactaaccagacataaagtgttggta600

gcagacttcttagaacaaaattacgacactatttttgaagactatgagaaattgcttcag660

tctgagaattatgttactaagagacagtctttaaagctgctaggggagctgatcctggac720

cgtcacaactttgccatcatgacaaagtatatcagcaagccggagaacctgaaactcatg780

atgaacctccttcgggataaaagtcccaacatccagtttgaagcctttcatgtttttaag840

gtgtttgtggccagtcctcacaaaacacagcctattgtggagatcctgttaaaaaatcag900

cccaaactcattgagtttctgagcagcttccaaaaagaaaggacggatgatgagcagttc960

gctgacgagaagaactacttgattaaacagatccgagacttgaagaaaacggccccttga1020

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<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>人工合成，以用作得到驗(yàn)證基因的編碼序列的下游引物

<400>8

ccccatcatcagcggactg19

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>人工合成，以用作得到驗(yàn)證基因的編碼序列的下游引物

<400>9

cttctgttgggggttcttt19

<210>10

<211>350

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>驗(yàn)證基因的編碼序列

<400>10

ccccatcatcagcggactgtaccagggtgccggtggtcccgggcctgggggcttcggggc60

tcagggtcccaagggagggtctgggtcaggccccaccattgaggaggtagatgggggcgg120

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