本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻rag2基因在提高水稻數(shù)量性狀中的應(yīng)用，所述的數(shù)量性狀指的是水稻產(chǎn)量或稻米品質(zhì)。本發(fā)明通過構(gòu)建rag2基因表達(dá)增強的轉(zhuǎn)基因水稻植株，發(fā)現(xiàn)在rag2超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因t2代植株中，陽性轉(zhuǎn)基因植株的種子增大，產(chǎn)量顯著高于野生型，同時稻米蛋白和脂肪含量也明顯增加，提高了稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。因而該基因在培育優(yōu)良的高產(chǎn)量和高品質(zhì)的植物品種中具有新的用途，從而為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的作物新品種提供了可能。

背景技術(shù)：

水稻不僅是最重要的三大糧食作物(水稻、小麥和玉米)之一，還是目前用于高等植物生命科學(xué)研究的兩個重要模式生物(擬南芥和水稻)之一。水稻是世界上三分之一以上人口的主要糧食，也是我國65％以上人口的主食。在世界人口不斷增加、可耕地面積逐漸減少、環(huán)境不斷惡化的大趨勢下，保證糧食安全成為世界面臨的一個日益突出的大問題和嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，而提高水稻等主要糧食作物的單位面積產(chǎn)量是解決這一問題的重要途徑，20世紀(jì)50年代末至60年代初水稻品種的矮桿化和70年代雜交水稻三系配套的利用是現(xiàn)代水稻遺傳改良?xì)v史上兩個重要的里程碑，這兩次重大突破為水稻增產(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)；而目前，常規(guī)水稻育種手段已變得很有限，基于生物技術(shù)或基因工程的分子育種是目前提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的最有效手段，將是水稻遺傳改良的第三次突破，世界各國尤其是發(fā)達(dá)國家非常重視生物技術(shù)在作物遺傳改良方面的應(yīng)用，大型種業(yè)企業(yè)都競相開展轉(zhuǎn)基因育種和分子標(biāo)記輔助育種研究(mittleretal.,geneticengineeringformodemagriculture:challengesandperspectives,amurevplantbiol,2010)。而分離克隆與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆相關(guān)的功能基因并闡明其作用機理是作物分子改良的前提，對水稻遺傳改良具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

水稻作為生命科學(xué)研究的模式生物和人類的主要食物來源，其高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)是植物基礎(chǔ)研究和品種選育的主要目標(biāo)。影響水稻產(chǎn)量有4個主要因素：有效分蘗數(shù)，穗粒數(shù)，結(jié)實率及千粒重。其中千粒重主要由籽粒大小和充實度所決定，種子大小則由粒長、粒寬、粒厚和谷粒充實度共同決定，這些性狀是谷粒產(chǎn)量決定因素中遺傳力最高的因素(sakamotoetal.,identifyingandexploitinggrainyieldgenesinrice,curr.opin.plantbiol,2008)。同時，稻米的營養(yǎng)品質(zhì)主要取決于精米中的粗蛋白(crudeproteincontent,cpc)、脂肪含量以及維生素和其它微量元素含量的髙低，優(yōu)質(zhì)米育種追求蛋白質(zhì)的較高含量(fitzgeraldetal.,notjustagrainofrice:thequestforquality,trendsplantsci,2009)。因此，克隆控制水稻產(chǎn)量和品質(zhì) 性狀的基因，研究它們在谷粒形成和物質(zhì)合成積累中的功能，將有助于最終揭示水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的分子調(diào)控基礎(chǔ)。

水稻的rag2基因編碼種子儲藏蛋白中的可溶性蛋白，屬于α淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑家族(adachietal.,genestructureandexpressionofriceseedallergenicproteinsbelongingtothealphaamylase/trypsininhibitorfamily,plantmolbiol,1993)，在水稻種子發(fā)育的中后期特異表達(dá)(gang-hualangetal.,immunologicalcharacterizationofpolyclonalantiserapreparedagainstrecombinantricerag2anditsapplicationindetectionof14-16kdaα-amylase/trypsininhibitorsfromprocessedfoods,foodsci.technol.res,2010)。通過比對rag2的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它與植物脂轉(zhuǎn)運蛋白也具有同源性(alvarezetal.,classificationofriceallergenicproteincdnasbelongingtothealpha-amylase/trypsininhibitorgenefamily,biochimbiophysacta,1995)，但rag2在水稻種子形成中的生物學(xué)功能尚不清楚。本發(fā)明通過將seqidno.1所示序列(rag2基因)通過轉(zhuǎn)基因方式轉(zhuǎn)入水稻粳稻品種中花11(或稱zh11)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的大小和千粒重顯著高于野生型，同時稻米中的總蛋白含量和粗脂仿含量也明顯增加。因而該基因在培育高產(chǎn)量和高品質(zhì)的水稻品種中具有新的用途，從而為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻新品種提供了可能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了水稻rag2基因在提高水稻數(shù)量性狀中的應(yīng)用，所述的數(shù)量性狀指的是水稻產(chǎn)量或水稻稻米品質(zhì)。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

水稻rag2基因(基因登錄號loc_os07g11380)在提高水稻數(shù)量性狀中的應(yīng)用，包括水稻rag2基因在提高水稻種子千粒重中的應(yīng)用；或提高水稻稻米品質(zhì)中的應(yīng)用，所述的提高品質(zhì)包括提高稻米的蛋白含量或/和提高稻米的脂肪含量、降低水稻稻米淀粉含量。

通過將水稻rag2基因編碼區(qū)在水稻中進(jìn)行超表達(dá)即可達(dá)到上述目的。

優(yōu)選的，所述的水稻品種為中花11號；

優(yōu)選的，增強表達(dá)載體通過將包含有水稻rag2基因cds的序列插入表達(dá)載體質(zhì)粒pu2301–cflag的kpni和bamhi酶切位點之間得到。

優(yōu)選的，所述rag2基因通過引物rag2-f：5'-atggcttccaacaaggtagt-3'；rag2-r：5'-gtgaccagttctcggggtccta-3擴(kuò)增得到。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：

水稻是全世界最重要的糧食作物之一，對緩解糧食短缺，尤其是保障我國的糧食安全有著重要的意義，如何提高水稻產(chǎn)量已經(jīng)成為一項具有重要意義的科學(xué)問題。水稻過敏原蛋白rag2是水稻種子儲藏蛋白中的一類可溶性蛋白，前人的研究主要將它作為關(guān)鍵的水稻過敏原進(jìn)行檢測，但對其生理功能的研究還未開展，它在水稻的生長發(fā)育過程起著怎樣的作用也未見有報道。申請人通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11(zh11)，得到的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株的種子增大，產(chǎn)量顯著高于野生型，同時稻米蛋白和脂肪含量明顯增加，提高了稻米的品質(zhì)。因而該基因在培育優(yōu)良的高產(chǎn)量和高品質(zhì)的植物品種中具有新的用途，從而為培育新的增產(chǎn)增質(zhì)的作物新品種提供了新的可能。

附圖說明

圖1：超表達(dá)載體pu2301-cflag及pu2301-rag2-cflag示意圖。

該圖的上半部分為表達(dá)載體質(zhì)粒pu2301-cflag圖，下半部分為本發(fā)明構(gòu)建的pu2301-rag2-cflag增強表達(dá)載體圖。

圖2：rag2基因在t0代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量示意圖。圖中：wt代表陰性對照(水稻品種中花11號)；從ox-1到ox-10代表超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株t0代。

圖3：rag2基因在t2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量示意圖。圖中：wt代表陰性對照(水稻品種中花11)；從ox-1到ox-3代表t2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖4：在rag2的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子的形態(tài)表型及統(tǒng)計學(xué)分析示意圖。圖中：wt代表陰性對照；ox-1到ox-3代表t2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖5：在rag2的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子中蛋白、脂肪和淀粉含量測定示意圖。圖中：wt代表陰性對照；ox-1到ox-3代表t2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。

圖6：在rag2的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子中種子大小、蛋白、脂肪和淀粉相關(guān)基因的表達(dá)。圖中：wt代表陰性對照；ox-1到ox-3代表t2代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。

具體實施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述試劑或材料，如未特備說明，均來源于商業(yè)渠道。

實施例1：rag2基因全長cdna的擴(kuò)增

對本發(fā)明所需要的基因rag2(基因登錄號loc_os07g11380)，主要通過rt-pcr方法進(jìn)行擴(kuò)增得到rag2基因的全長序列。具體操作如下：

1)抽提來自水稻粳稻品種中花11(zh11)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李梅芳研究員贈送，為中國公開應(yīng)用的水稻品種)開花后第14天種子的rna，rna抽提用試劑是invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)；

2)rt-pcr中反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈的步驟如下：①配制混合液1：總rna4μg，dnasei2u,10xdnaseibuffer1μl，加depc(焦碳酸二乙酯，rna酶的強烈抑制劑)處理水(0.01％depc)到10μl，混勻后將混合液1在37℃放置20分鐘以除去dna，②20分鐘后將混合液1置于65℃水浴中溫浴10分鐘以去除dnasei活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液1中加入1μl500μg/ml的oligo(dt)，④將在冰上冷卻的混合液1立即置于65℃水浴中溫浴10分鐘，以徹底使rna變性，然后置于冰上5分鐘，⑤配制混合液2：混合液110μl，5xfirststrandbuffer4μl，0.1mdtt(巰基乙醇)2μl，10mmdntpmixture1.5μl，depc處理水0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2μl，混勻后將混合液2置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時，⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90℃干浴3分鐘，⑦-20℃保存反應(yīng)最終產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購自invitrogen公司。

3)然后根據(jù)msu數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的rag2基因的全長cdna序列，設(shè)計引物pcr擴(kuò)增片段。pcr用到的體系為20μl，具體配法為：cdna第一鏈模板1μl，10xpcrbuffer2μl，10mmdntp1.6μl，2.5mmmg2+1.5μl，正向引物和反向引物各0.4μl，lataq酶0.2μl，加水至20μl(所用到的pcrbuffer、dntp、mg2+、lataq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。pcr反應(yīng)條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤從②－④循環(huán)35次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。擴(kuò)增該基因的全長序列：即用rag2-f1和rag2-r1擴(kuò)增出全長序列。

用來克隆rag2全長的引物如下所示：

rag2-f：5'-atggcttccaacaaggtagt-3'；

rag2-r：5'-gtgaccagttctcggggtccta-3'。

4)將擴(kuò)增出的基因全長連接到t/a克隆載體pgemt-vector(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國promega公司)上用t7和sp6引物測序驗證。

得到最終的rag2基因的cdna序列，其核苷酸序列如seqidno：1所示，其第83-583位為編碼區(qū)(cds)，編碼的蛋白質(zhì)為seqidno.2所示。

實施例2：rag2超表達(dá)載體的構(gòu)建

對本發(fā)明所需要的基因，通過rt-pcr方法進(jìn)行擴(kuò)增得到rag2的全長序列，具體步驟是：根據(jù)msu公共數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)公布的rag2基因的全長c dna序列，設(shè)計包含酶切位點的引物，以rag2基因全長cdna(來自實施例1)為模板，pcr擴(kuò)增基因全長片段。擴(kuò)增產(chǎn)物通過t/a克隆連接到pgemt-vector(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國promega公司)進(jìn)行測序驗證。

用來克隆包含酶切位點的rag2的全長片段的引物如下所示：

purag2-f:5'-gggggtaccatggcttccaacaaggtagt-3'；

purag2-r:5'-gggggatccgtgaccagttctcggggtccta-3'

擴(kuò)增的得到498bp的dna片段，該片段包括序列表seqidno：1的第83-580位為編碼區(qū)(cds))所示的核苷酸序列。

具體步驟如下：

1)將帶有rag2的全長片段的t/a克隆用kpni和bamhi酶切，回收目標(biāo)條帶，與kpni和bamhi酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pu2301-cflag(圖1的上圖，孫前文.水稻組蛋白末端修飾酶基因的功能研究[d].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，2009：63-65))連接(所使用的內(nèi)切酶均購自寶生物工程大連有限公司，使用方法及用量按照該公司提供的產(chǎn)品說明書；連接酶為上海英俊生物技術(shù)公司產(chǎn)品，用法及用量按照該公司產(chǎn)品說明書)；

2)連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見儀器說明書)導(dǎo)入大腸桿菌dh10b(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國promega公司代理)，在含有250ppm卡那霉素(購自羅氏生物公司產(chǎn)品)的la(la配方參見j.薩姆布魯克，ef弗里奇，t曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)；

3)將la抗性培養(yǎng)基上長出的單菌落在超凈工作臺接種于滅菌的10ml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的lb抗性培養(yǎng)基，然后在37℃搖床上培養(yǎng)16-18小時。按照j.薩姆布魯克和d.w.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2002版報道的方法抽提質(zhì)粒，用kpni和bamhi酶切并電泳檢測，根據(jù)插入片段的大小獲得陽性的超表達(dá)載體：pu2301-rag2-cflag(該質(zhì)粒的圖譜見圖1)；

實施例3：質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株陽性和表達(dá)量檢測

1)把新構(gòu)建的超表達(dá)載體pu2301-rag2-cflag(來自實施例2)通過電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻(xiàn)和使用的電壓參數(shù)如實施例2的步驟2)所述)導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105(購自澳大利亞cambia實驗室，為常規(guī)商業(yè)菌株)菌株中。將轉(zhuǎn)化后的菌株命名為ox-rag2。

2)將上步得到的ox-rag2轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11號(zh11)，轉(zhuǎn)化方法參照hiei等人報道的方法(hiei等,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj,1994,6:271-282.)以及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室的標(biāo)準(zhǔn)方法(專利號zl200710053552.9)進(jìn)行。獲得t0代轉(zhuǎn)基因植株。

3)取t0代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總dna,dna抽提方法為ctab法(zhang等，geneticdiversityanddifferentiationofindicaanjaponicaricedetectedbyrflpanalysis,1992,theorapplgenet,83,495-499)。以葉片總dna為模板，用pcr方法對t0代超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株用超表達(dá)載體引物(pu2301f和pu2301r)進(jìn)行陽性檢測。

引物的序列如下：

pu2301f：5'-attttcaccatttacgaacg-3'；

pu2301r：5'-ctggagaaaaatagagagagataga-3'。

以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司(或稱上海生工生物工程有限公司)合成。

pcr反應(yīng)總體積為20μl，具體配法是：模板100ng，10xpcrbuffer2μl，10mmdntp1.6μl，2.5mmmg2+1.5μl，正向引物、反向引物(pmcg1f和pmcg1r，pmcg2f和pmcg2r)各0.4μl，r-taq酶0.2μl,加去離子水至20μl(所用到的pcrbuffer、dntp、mg2+、r-taq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。pcr反應(yīng)條件如下：①94℃4分鐘，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分鐘，⑤從②－④循環(huán)32次，⑥72℃7分鐘，⑦4℃保存。pcr產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的tbe瓊脂糖凝膠上電泳檢測。因為超表達(dá)載體引物(pu2301f和pu2301r)片段為轉(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出特異條帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽性植株。對t0代陽性植株收種子(稱為t1代)，為t1代的大田種植和性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。

4)為了檢測超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的目標(biāo)基因的表達(dá)量，申請人采用real-timepcr的方法對轉(zhuǎn)基因t0代植株進(jìn)行了表達(dá)分析。實驗所用的總rna來自開花后第14天水稻種子，rna抽提用的試劑是采用invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；按照實施例1的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實時熒光定量pcr的方法檢測rag2的表達(dá)量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見說明書。pcr儀為美國abi公司的7500，pcr參數(shù)為95℃預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個循環(huán)。real-timepcr所用引物序列為：

rag2rt-f：5'-gtgtatgactctgtgggg-3'

rag2rt-r：5'-caacgaaatattgctacc-3'

最終得到的t0代超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中rag2表達(dá)結(jié)果見圖2。real-timepcr結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因材料中，超表達(dá)家系ox-1到ox-10為最終得到的10個轉(zhuǎn)基因單株，其中ox-5為轉(zhuǎn)基因陰性，在轉(zhuǎn)基因陽性植株中rag2的表達(dá)與野生型中花11(zh11)相比，上升了約20％-250％，說明超表達(dá)效果很好。

實施例4：轉(zhuǎn)基因植株性狀調(diào)查和種子主要成分含量的測定

1)將本發(fā)明的t0代陽性植株(即rag2基因表達(dá)量上升的植株)收種子(t0代)種入大田，加代至t2代，選取rag2表達(dá)量增加的株系(即超表達(dá)t2代)，我們選擇編號為ox-1，ox-2和ox-3的超表達(dá)t2代，進(jìn)行表型鑒定及表達(dá)量檢測(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株均有不同程度的表型，具體表現(xiàn)為種子變大(圖4)，千粒重增加10％-14％(圖4)，統(tǒng)計t2代三個株系各20株以及中花11(zh11)對照20株，三個家系分別與中花11(zh11)對照進(jìn)行單因素數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果如表1和圖4，其中ox-1，ox-2，ox-3代表超表達(dá)轉(zhuǎn)基因不同家系，＊代表差異顯著，p<0.05；＊＊代表差異極顯著，p<0.01。具體見表1所述。

表1.表型統(tǒng)計

2)因為rag2屬于種子儲藏蛋白，而且其蛋白序列與植物脂轉(zhuǎn)運蛋白具有同源性，可能參與脂肪的轉(zhuǎn)運；同時小麥中α淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑家族具有淀粉酶糖酵解作用，參與淀粉的合成，所以我們選取超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)量增加的株系收種子(t2代)測定種子主要儲藏物質(zhì)的含量。

水稻種子儲藏蛋白的抽提與測定。成熟種子總儲藏蛋白含量測定采用near-infraredreflectancespectroscopy方法，以xdsrapidliquidanalyze(fosstecatorab，sweden)進(jìn) 行測定(geetal.,analysisoftheconditionalcorrelationsfromdifferentgeneticsystemsbetweentheproteincontentandtheappearancequalitytraitsofindicarice,jgenetgenomics,2007)。成熟種子堿溶和醇溶性蛋白提取步驟：準(zhǔn)確稱取500mg稻米粉，放入研缽中，加入2ml0.1mol/lnaoh研磨，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入到10ml離心管中，再用2ml0.1mol/lnaoh洗滌研缽，重復(fù)三次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入10ml離心管中，顛倒搖勻，放置30min，放置過程間斷搖勻數(shù)次。室溫3500r/min離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，用蒸餾水定容并搖勻，即得到堿溶性蛋白。將上述沉淀用70％乙醇重復(fù)提取，操作步驟同上，得到醇溶性蛋白。吸取提取液0.1ml，放入10ml離心管中，加5ml考馬斯亮藍(lán)g-250試劑，混勻，放置2min，在595nm波長下比色(比色空白用0.1ml蒸餾水代替提取液與5ml考馬斯亮藍(lán)g-250試劑混合)，記錄od值。然后根據(jù)所測od595nm在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。

粗脂含量測定(soxtectm2050脂肪含量測定)。米粉及儀器的準(zhǔn)備：1、稱取5g米粉(一個樣品需要5g，若需要重復(fù)，則取相應(yīng)的量)，置于稱量瓶中，與105℃烘箱中烘2h，取出置于干燥器中冷卻至室溫待用；2、將鋁杯洗干凈后，置于105℃烘箱中烘2h，取出置于干燥器中冷卻至室溫；3、米粉稱量(a)：將干燥的米粉準(zhǔn)確稱取3.5g左右，采用差量法，記錄米粉重量，并按照編號放入對應(yīng)的架子里；4、鋁杯稱量(b)將干燥后的鋁杯從干燥器中取出，并按照順序稱量其重量，做好記錄，放入對應(yīng)的鋁杯架子里(注意，稱量鋁杯一定不能用手直接接觸，而且不能將鋁杯放在空氣中過久，從干燥器中取出后應(yīng)立刻稱量其重量)；5、準(zhǔn)備石油醚：將石油醚放入通風(fēng)廚中，倒入通風(fēng)廚內(nèi)石油醚專用加液量筒內(nèi)，調(diào)好容量，按壓加液器上的活塞來加液，加石油醚時，保證加液器內(nèi)的體積大于600ml，以免加液時出現(xiàn)石油醚不夠的情況。儀器運行：1、打開通風(fēng)廚的總開關(guān)，按下風(fēng)機按鈕；2、打開儀器的驅(qū)動單元(driveunit)，將裝有米粉的濾紙杯放在儀器上，長按驅(qū)動單元上左側(cè)的向上的按鈕，直至濾紙杯上升到儀器的最上端，檢查濾紙杯是否與上面的磁鐵對齊，并旋轉(zhuǎn)著使二者之間對齊(戴上手套進(jìn)行操作)；3、將稱好的鋁杯放在儀器上，長按驅(qū)動單元右側(cè)的向下的按鈕，使鋁杯貼緊底部的加熱板，再按左側(cè)的向下的按鈕，將濾紙杯下降到底部(一定得使鋁杯和濾紙杯都下降到底部，不然加石油醚的時候會漏液)；4、打開儀器頂部的蓋子，將加石油醚的管子插入到對應(yīng)的孔內(nèi)，將加液器上的活塞打到頂部(每次加液80-90ml，已經(jīng)調(diào)好刻度，也可以根據(jù)自己的需要調(diào)整)，緩緩按下活塞，使石油醚進(jìn)入對應(yīng)的鋁杯中。依次加完石油醚，蓋好頂蓋，將管子收好，放入到之前的袋子里，注意不要將石油醚灑出；5、加完石油醚后，打開控制單元，等儀器穩(wěn)定后，選擇程序1，已經(jīng)調(diào)好。脂肪抽提時間約2h，運行完后停止；6、程序結(jié)束后，按下控制單元的向上鍵，將鋁杯取出，看石油醚是否回收完，若還有很多剩余，可以將程序調(diào)至9，讓儀器再運行一次；7、石油醚回收完后，將鋁杯取出，放入圓形的鋁杯架上，放入105℃烘箱中烘2h，取出放入干燥器內(nèi)干燥至室溫。后期計算，以及整理1、將干燥好的 鋁杯取出，按照編號稱量其重量(c)。計算脂肪含量＝(c-b)/a；2、回收儀器內(nèi)的石油醚；3、將濾紙杯放在通風(fēng)廚內(nèi)，使濾紙杯內(nèi)的米粉干燥，之后倒出濾紙杯內(nèi)的米粉，并用刷子將米粉刷出；4、用洗潔精海綿刷洗鋁杯，并放入烘箱中烘干，放入干燥器重以備下次使用；5、關(guān)閉儀器，關(guān)閉風(fēng)機，關(guān)上通風(fēng)廚。

gs-ms法測定種子中的脂肪酸。準(zhǔn)確稱取500mg的糙米粉用于測量脂肪酸含量。利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms(qp2010)對超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株及野生型種子的脂肪酸進(jìn)行百分比相對含量的測定，利用定性判斷脂肪酸組分的種類。方法步驟:1、稱取約500mg糙米粉置于10ml離心管中。2、依次加入500ul乙醚：石油醚(l:l)和250ulkoh-甲醇(0.4mol/l)，蓋緊管蓋，輕輕振蕩10s，靜置3-4h。3、加入適量去離子水，使反應(yīng)液分層，取上清于加樣管中，置于氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測定。

淀粉含量檢測(二硝基水楊酸法)。1、水稻種子成熟收獲后曬干或者烘干，然后將種子進(jìn)行脫粒處理，采用實驗礱谷機(blh-3250型)；將糙米在精米機上粉碎成精米；精米在旋風(fēng)式粉碎機(旋風(fēng)式粉碎磨，jfs-13a型)上粉碎成米粉。2、dns試劑的制備：將3.15gdns和131ml2mol/l氫氧化鈉，加到250ml含有91克酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加上2.5g重蒸酚和2.5g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加入ddh2o定容到500ml，即制成3,5-二硝基水楊酸試劑，于棕色瓶中備用。3、樣品葡萄糖的制備：稱取過200目篩子的米粉樣品50mg(4個空白對照各加50μl蒸餾水)于10ml離心管中，用槍迅速加入預(yù)熱的6ml2.5mol/lkoh(40℃)溶液，加牙簽并在室溫下震蕩5min使淀粉充分打散溶解，后40℃水浴5min再室溫下震蕩5min，直至無生淀粉團(tuán)生成，去掉牙簽；加入3ml0.4mol/l醋酸鈉緩沖液(ph＝4.75)，加入濃鹽酸溶液(約800μl)將樣品溶液的ph值調(diào)至4.75，ph值很關(guān)鍵，涉及到糖苷酶的活性；最后加入60μl葡萄糖苷酶，于130rpm轉(zhuǎn)速搖床中在60℃下作用45min；之后再6000rpm4℃離心5min，取上清稀釋10倍后備用。用dns法測定葡萄糖含量(見下所述)，50mg樣品中總淀粉的含量等于葡萄糖含量乘以0.9(gonietal.,1996)。4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋(用蒸餾水稀釋d型無水葡萄糖，各3個重復(fù))：4000μg/ml→2000μg/ml→1000μg/ml→500μg/ml→250μg/ml→125μg/ml→62.5μg/ml→0μg/ml，各吸取0.2ml于2ml離心管中，分別準(zhǔn)確加入dns試劑0.4ml，沸水浴加熱5min，冰水混合物中冷卻5min，再加1.4ml的蒸餾水混勻，各吸取200μl于96孔酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀tecaninfinitem200在540nm波長下測定吸光度。5、樣品葡萄糖含量的測定：樣品液及空白對照用蒸餾水稀釋10倍后，使糖濃度為0.1-1.0mg/ml，各吸取稀釋后的糖液0.2ml于2ml離心管中，方法同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，用多功能酶標(biāo)儀在540nm波長下測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線算出葡萄糖μg/ml數(shù)，乘以10倍后求出樣品中葡萄糖含量。6、打開并預(yù)熱多功能酶標(biāo)儀(測濃度可不用預(yù)熱)，打開電腦→點擊軟件magellan→create/editamethod→ new/open→選nunclon96plattransparent→選96孔有樣的孔→雙擊左側(cè)absorbance→選參數(shù)540nm、預(yù)振次數(shù)、測樣點的數(shù)目等→保存方法于自己文件夾中→點startmeasurement→usepredefinedmethod→選你定的方法→開始→點edit中copytoexcel→保存excel于自己文件夾中→退出，保存results文件。7、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程式制備：將葡萄糖的od值及待測樣品的od值均減去空白對照的od值→對葡萄糖od值做散點圖→劃趨勢線→點擊趨勢線點公式及r2值，r2值越接近1，曲線的線性化越好，至少要小數(shù)點后有兩個9方采用使用。

根據(jù)上述三種測定種子成分的方法，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株種子中蛋白含量增加30％-56％(圖5，表2)，脂肪含量增加9％-25％(圖5，表2)，淀粉的含量降低(圖5，表2)，而且c16:0(棕櫚酸)，c18:1(油酸)，c18:2(亞油酸)和c18:3(亞麻酸)這4主要的脂肪酸含量也增加(表3)。統(tǒng)計t2代ox-1，ox-2，ox-3三個家系各20株以及中花11(zh11)對照20株，三個家系分別與中花11(zh11)對照進(jìn)行單因素數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果如表2和表3，其中ox-1，ox-2，ox-3代表轉(zhuǎn)基因不同家系，＊代表差異顯著，p<0.05；＊＊代表差異極顯著，p<0.01。

表2.水稻種子中主要儲藏物質(zhì)含量

表3.水稻種子中主要脂肪酸含量

實施例5：轉(zhuǎn)基因植株中種子大小和種子成分相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了驗證rag2在調(diào)控種子大小和種子儲藏物質(zhì)兩方面的作用，我們選取超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株t2代和野生型植株在開花后第14天的種子，抽提種子rna，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測控制籽粒大小和儲藏物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)量。實驗所用的總rna來自所取的種子，rna抽提用試劑是invitrogen公司的trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；按照實施例1的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實時熒光定量pcr的方法檢測相關(guān)基因的表達(dá)量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見說明書。pcr儀為美國abi公司的7500，pcr參數(shù)為95℃預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95℃變性5秒，60℃退火延伸40秒，45個循環(huán)。

real-timepcr所用引物序列如下所示：

種子大小相關(guān)基因：

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種子儲藏蛋白相關(guān)基因：

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種子脂肪合成相關(guān)基因：

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種子淀粉合成相關(guān)基因：

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表達(dá)結(jié)果見圖6所示，圖6中wt代表陰性對照；ox-1，ox-2，ox-3代表超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。圖6表示種子大小、種子儲藏蛋白、脂肪合成和淀粉合成相關(guān)基因在不同材料中的表達(dá)量。其中種子大小相關(guān)基因(gw2,gw8，gs3，gs5)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)量基本沒有變化；種子儲藏蛋白相關(guān)基因(glua,glub，glud，rm1，prol14,rp10)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)量普遍上升，脂肪合成相關(guān)基因(os08g0510400,os09g0505300)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中表達(dá)量也表現(xiàn)為上升，而淀粉合成相關(guān)基因(gbssi,ssi，ssiia，ssiiia，osagpl2,osagps2b)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株中多數(shù)降低。實驗結(jié)果表明rag2超表達(dá)能夠顯著增加種子大小，進(jìn)而產(chǎn)量增加，但是其調(diào)控機制并不包含在已有的調(diào)控種子大小和產(chǎn)量的途徑中，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的調(diào)控種子大小和產(chǎn)量的新途徑。同時，含量測定與相關(guān)基因的表達(dá)也是一致的，rag2超表達(dá)能夠增加水稻種子蛋白和脂肪含量，降低淀粉含量，提高了水稻種子的營養(yǎng)品質(zhì)。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>水稻rag2基因在提高水稻數(shù)量性狀中的應(yīng)用

<130>水稻rag2基因在提高水稻數(shù)量性狀中的應(yīng)用

<160>2

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<213>水稻

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<213>水稻

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165