一種鑒定tigar基因的表達(dá)量的方法及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定TIGAR基因的表達(dá)量的方法及其專用引物。本發(fā)明提供的引物對，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。所述特異引物對可用于鑒定TIGAR基因、鑒定豬肉食品中TIGAR基因的表達(dá)量、輔助鑒定豬肉品質(zhì)。本發(fā)明提供了特異引物對，采用SYBR?GreenⅠ熒光定量PCR方法對TIGAR基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，建立了TIGAR基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)曲線且線性關(guān)系良好。本發(fā)明提供給的引物對和方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測豬TIGAR基因表達(dá)情況。
【專利說明】—種鑒定TIGAR基因的表達(dá)量的方法及其專用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種鑒定TIGAR基因的表達(dá)量的方法及其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002]PSE肉是一種蒼白、柔軟、有汁液滲出的劣質(zhì)肉，每年由其引起的肉品劣變給畜禽產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PSE肉的形成主要取決于屠宰后無氧糖酵解的速度，無氧糖酵解的速度越快，越易產(chǎn)生PSE肉。
[0003]近來,英國Beatson癌癥研究所和西班牙研究人員在抗腫瘤研究過程中發(fā)現(xiàn)一種叫做 TIGAR (TP53_induced glycolysis and apoptosis regulator, TP53 誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子)的P53誘導(dǎo)基因。TIGAR蛋白可調(diào)節(jié)有氧呼吸和糖酵解平衡。TIGAR蛋白具有果糖-2，6- 二磷酸酶(FBPase-2)活性，TIGAR表達(dá)使果糖_2，6- 二磷酸去磷酸化變成果糖-6-磷酸，降低了其在細(xì)胞中的含量，而果糖_2，6- 二磷酸是糖酵解關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶(PFK-1)的強(qiáng)力激活因子，果糖_2，6- 二磷酸水平的降低會(huì)抑制磷酸果糖激酶的活性，使糖酵解反應(yīng)速率下降，導(dǎo)致糖酵解一系列酶和產(chǎn)物的變化，PH下降速度減慢，抑制PSE肉的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種鑒定TIGAR基因的表達(dá)量的方法及其專用引物。
[0005]本發(fā)明提供的專用引物為一對特異引物(又稱特異引物對)，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
[0006]本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在鑒定TIGAR基因中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在輔助鑒定豬肉品質(zhì)中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量；(c)輔助鑒定豬肉品質(zhì)。
[0010]本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括所述特異引物對；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量；(c)輔助鑒定豬肉品質(zhì)。所述試劑盒還可包括用于鑒定內(nèi)參基因的引物對，所述內(nèi)參基因具體可為β-actin基因。所述用于鑒定內(nèi)參基因的引物對具體可為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。所述試劑盒中還可包括具有所述特異引物對的靶序列的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒具體可為將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子插入骨架載體得到的重組質(zhì)粒。所述骨架載體具體可為PMD-18T載體。所述試劑盒還可包括記載有標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的載體；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可為:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y為循環(huán)閾值，x為體系中TIGAR基因片段的拷貝數(shù)。
[0011]本發(fā)明還保護(hù)一種 鑒定豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量的方法，包括如下步驟:[0012](I)提取待測豬肉的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0013](2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，采用所述特異引物對進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR ；
[0014](3)根據(jù)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果獲得TIGAR基因的表達(dá)量。
[0015]所述實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件具體可為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s、40個(gè)循環(huán)。
[0016]以上任一所述的TIGAR基因具體可為如下(I )、(II)或(III):( I )序列表中序列6所不的DNA分子；(II)在嚴(yán)格條件下與(I )限定的DNA序列雜交且編碼與PSE肉相關(guān)的蛋白的DNA分子；(III)與(I )限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與PSE肉相關(guān)的蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0.5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]鑒于TIGAR基因?qū)档吞墙徒馑?，抑制PSE肉的發(fā)生具有一定作用，并且目前對宰后不同品種、不同時(shí)間的兩基因表達(dá)情況國內(nèi)外研究甚少。本發(fā)明提供了特異引物對，采用SYBR Green I熒光定量PCR方法對TIGAR基因表達(dá)情況進(jìn)行研究，建立了 TIGAR基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)曲線且線性關(guān)系良好。本發(fā)明提供給的引物對和方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測豬TIGAR基因表達(dá)情況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為實(shí)施例2中的擴(kuò)增曲線。
[0019]圖2為實(shí)施例2中的溶解曲線。
[0020]圖3為實(shí)施例3中采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性的電泳圖。
[0021]圖4為實(shí)施例3中通過檢測`β -actin基因鑒定cDNA的質(zhì)量的電泳圖。
[0022]圖5為實(shí)施例3中檢測TIGAR基因的擴(kuò)增曲線。
[0023]圖6為實(shí)施例3中檢測TIGAR基因的溶解曲線。
[0024]圖7為實(shí)施例3中檢測TIGAR基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖8為實(shí)施例3中檢測內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線。
[0026]圖9為實(shí)施例3中檢測內(nèi)參基因的溶解曲線。
[0027]圖10為實(shí)施例3中檢測內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]圖11為實(shí)施例4的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0030]pMD-18T載體:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:6011oE.coll JM109感受態(tài)細(xì)胞:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:D9052S。IOObp DNA Ladder Marker:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:3422A。SYBRPremix Ex TaqI1:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:RR820Q。2 XPower Taq PCR MasterMix:百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號PR1701。Universal DNA純化回收試劑盒:天根生化科技有限公司，貨號DP214-02。高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒:天根生化科技有限公司，貨號DP107-02。[0031]實(shí)施例1、特異引物對的設(shè)計(jì)
[0032]設(shè)計(jì)一對用于鑒定TIGAR基因的引物如下(靶序列為169bp):
[0033]Fl (序列 I):5，-CAggTgAAAATgCgTggAAA-3，；
[0034]Rl (序列 2):5，-CTgAATTAAACgTggAggCACA-3，。 [0035]設(shè)計(jì)一對用于鑒定β -actin基因的引物對如下(靶序列為216bp):
[0036]F2 (序列 3):5，_TgCgggACATCAAggAgAAg_3，；
[0037]R2 (序列 4):5，-AgTTgAAggTggTCTCgTgg-3，。
[0038]實(shí)施例2、引物對的靈敏度和特異性
[0039]1、合成序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，將其插入pMD_18T載體，得到重組質(zhì)粒。
[0040]2、將質(zhì)粒濃度為3.4X IO9拷貝數(shù)/μ I的重組質(zhì)粒溶液用超純水進(jìn)行梯度稀釋，然后將各個(gè)稀釋液作為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。
[0041]實(shí)時(shí)熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0042]實(shí)時(shí)熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個(gè)循環(huán)；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0043]每種稀釋液進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0044]擴(kuò)增曲線見圖1。圖1中，自左至右的擴(kuò)增曲線依次為采用質(zhì)粒濃度為3.4X108、
3.4Χ107、3.‘ΧΙΟ6』.‘ΧΙΟ5』.‘ΧΙΟ4』.‘ΧΙΟ3』.4Χ102、3.4Χ101 拷貝數(shù) /μ I 的稀釋液作為模板得到的擴(kuò)增曲線。實(shí)時(shí)熒光PCR體系中TIGAR基因片段的拷貝數(shù)為10以上時(shí)，均可觀察到擴(kuò)增曲線，即采用Fl和Rl組成的引物對通過實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定目的基因，靈敏度為10個(gè)拷貝的目的基因/每個(gè)反應(yīng)體系。
[0045]當(dāng)PCR體系中含IO1-1O8數(shù)量級拷貝的TIGAR基因片段時(shí)，Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)各個(gè)稀釋液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y為循環(huán)閾值，x為體系中TIGAR基因片段的拷貝數(shù)。
[0046]溶解曲線見圖2，可見只有單一峰，說明實(shí)時(shí)熒光PCR得到了單一產(chǎn)物，特異性強(qiáng)。將Fl和Rl在NCBI上進(jìn)行比對可知，此引物對在豬的全基因序列中只能擴(kuò)增TIGAR基因序列，因此在嚴(yán)格控制污染前提下，只擴(kuò)增豬cDNA庫時(shí)不會(huì)產(chǎn)生其它非特異性擴(kuò)增。
[0047]實(shí)施例3、引物對的應(yīng)用
[0048]1、取兩頭屠宰30min后的大白豬的半膜肌，提取總RNA。采用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，總RNA的0D26(i/28(i在1.7-2.0之間。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，見圖3 (I和2分別對應(yīng)兩頭大白豬)，28S和18S條帶清晰可見，無明顯降解。
[0049]2、將步驟I提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過檢測β -actin基因(內(nèi)參基因)鑒定cDNA的質(zhì)量，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4 (I和2分別對應(yīng)兩頭大白豬)，顯示內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶，濃度較統(tǒng)一，質(zhì)量較好。
[0050]PCR 體系:12.5 μ 12 X Power Taq PCR MasterMix, cDNAl.5 μ I，F(xiàn)21.5 μ I，R21.5 μ 1，加DEPC處理水補(bǔ)充至體積為25 μ I。
[0051]PCR 反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s、55.5°0退火3()8、721:延伸 30s，28個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0052]3、將步驟2得到的cDNA用超純水稀釋至5倍體積、10倍體積、100倍體積、1000倍體積，得到各個(gè)稀釋液(依次命名為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液)。
[0053]4、將步驟3得到的各個(gè)稀釋液作為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測TIGAR基因。
[0054]實(shí)時(shí)熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0055]實(shí)時(shí)熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個(gè)循環(huán)；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0056]每種稀釋液進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0057]擴(kuò)增曲線見圖5 (自左至右的擴(kuò)增曲線依次為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液作為模板得到的擴(kuò)增曲線)。溶解曲線見圖6。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。在5、10、100或1000稀釋倍數(shù)下，線性關(guān)系良好，R2=0.999385，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-3.4692201gX+34.441328，其中Y為循環(huán)閾值，X為體系中TIGAR基因片段的拷貝數(shù)，可計(jì)算得到擴(kuò)增效率為94.2%。
[0058]5、將步驟3得到的各個(gè)稀釋液作為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測β -actin基因(內(nèi)參基因)。
[0059]實(shí)時(shí)熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F2,0.8μ I R2,
0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0060]實(shí)時(shí)熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個(gè)循環(huán)；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0061 ] 每種稀釋液進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0062]擴(kuò)增曲線見圖8 (自左至右的擴(kuò)增曲線依次為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液作為模板得到的擴(kuò)增曲線)。溶解曲線見圖9。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖10。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-3.2778851gX+23.205946，其中Y為循環(huán)閾值，X為體系中β-actin基因片段的拷貝數(shù)，R2=0.998073，線性關(guān)系較好，可計(jì)算得到擴(kuò)增效率為101.8%。
[0063]根據(jù)步驟4和步驟5的結(jié)果可知:各基因擴(kuò)增曲線反應(yīng)良好；溶解曲線只有一個(gè)峰，說明反應(yīng)特異性好；各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致。
[0064]實(shí)施例4、引物對的應(yīng)用
[0065]采用與實(shí)施例3相同的方法，對屠宰后30min、2h、4h、8h的豬半膜肌中的TIGAR基因的相對表達(dá)量進(jìn)行測定，觀察宰后不同品種(長白豬和東北花豬)、不同時(shí)間豬TIGAR基因變化趨勢。長白豬體質(zhì)較弱，抗逆性差，應(yīng)激敏感較強(qiáng)，故用以作為較易產(chǎn)生PSE肉品種進(jìn)行研究。東北花豬是以本地民豬為母本與克米洛夫豬雜交而成的我國特有品種，其生長較快，飼料轉(zhuǎn)化率高，適應(yīng)性強(qiáng)，胴體瘦肉率較低，較不易產(chǎn)生應(yīng)激，故作為較不易產(chǎn)生PSE肉品種與長白進(jìn)行TIGAR mRNA宰后不同時(shí)間表達(dá)量的比較研究。
[0066]共進(jìn)行4次平行試驗(yàn)，以長白豬宰后30min的TIGAR基因表達(dá)量作為參照，其它各品種、各宰后時(shí)間相對于參照的相對表達(dá)量見表1。經(jīng)SAS9.1.3分析，結(jié)論如下:各品種宰后30min與宰后2、4、8h有顯著差異，30min表達(dá)量顯著高于2、4、8h (P〈0.05);東北花豬與長白豬間TIGAR基因表達(dá)量有顯著差異，且東北花豬宰后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于長白豬(P〈0.05)。
[0067]表1不同品種的豬宰后不同時(shí)間TIGAR基因的相對表達(dá)量
[0068]
[0069]注:大寫字母不同表示差異極顯著(P〈0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0070]對TIGAR mRNA作圖并進(jìn)行多重比較，見圖11。圖11中:每兩個(gè)相鄰柱子為一組，每組中左邊的柱子為長白豬，右邊的柱子為東北花豬；大寫字母不同表示差異極顯著(P〈0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P〈0.05)。經(jīng)SAS9.1.3分析，結(jié)論如下:東北花豬TIGAR基因表達(dá)量顯著高于長白豬(P〈0.05);長白豬宰后30min與宰后2h有顯著差異，2h與4h、8h有顯著差異(P〈0.05);東北花豬宰后30min與長白豬Oh有極顯著差異(P〈0.01)，長白豬宰后30min與東北花豬宰后8h有極顯著差異(P〈0.01),其余宰后時(shí)間無顯著性差異；東北花豬宰后30min與長白豬宰后30min、2h有顯著差異(P〈0.05)，長白豬宰后30min、2h與長白豬宰后4、8h及東北花豬宰后8h有顯著差異(P〈0.05)。
【權(quán)利要求】
1.引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
2.權(quán)利要求1所述引物對在鑒定TIGAR基因中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述引物對在鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述引物對在輔助鑒定豬肉品質(zhì)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述引物對在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c): Ca)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量；(c)輔助鑒定豬肉品質(zhì)。
6.一種試劑盒，包括權(quán)利要求1所述引物對；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量；(c)輔助鑒定豬肉品質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括具有所述引物對的靶序列的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括用于鑒定內(nèi)參基因的引物對。
9.一種鑒定豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量的方法，包括如下步驟: (1)提取待測豬肉的總R NA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；(2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，采用權(quán)利要求1所述引物對進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR； (3)根據(jù)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果獲得待測豬肉中TIGAR基因的表達(dá)量。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為:950C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484540SQ201310400073
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】湯曉艷, 康大成, 王敏, 李朋穎, 顏成英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所