專利名稱：以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液循環(huán)DNA測定技術領域，具體是一種以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法。
背景技術：
血液循環(huán)DNA (Circulating DNA, ctDNA),又稱游離 DNA 或無細胞 DNA (Cell-freeDNA)，主要來源于細胞的凋亡和死亡?？勺鳛槟[瘤、自身免疫病及胎兒遺傳學檢測的依據(jù)。目前的檢測方法均需要先從血清或血漿中提取DNA，然后擴增基因組中某個基因的方式，計算ctDNA的濃度或基因組拷貝數(shù)。由于個體間、不同病理狀態(tài)間ctDNA含量及片段完整程度存在較大差異，即便不考慮操作者的因素，所用提取方法和試劑的不同就會造成提取效率存在巨大差別。在此基礎上的ctDNA測定結果誤差會更大。但直接用血漿或血清擴增，血清或血漿中含有的蛋白質(zhì)等會嚴重干擾PCR，使標本間的擴增效率不一致。此外用于定量的測定對象也是影響檢測重復性和敏感性的重要因素。文獻報道多以b-actin等管家基因為檢測對象，由于是單拷貝基因，檢測靈敏度低。18S rRNA編碼基因是一個極其穩(wěn)定的保守基因序列，極少發(fā)生突變等，以其為檢測對象，可顯著提高檢測穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服以上技術缺陷，本發(fā)明提供一種以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為，一種以ISSrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，其步驟 如下:1、取5名健康人外周靜脈血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g離心5分鐘，取上層血漿500 μ 1，將5人血漿混勻后，加入DNAse,終濃度10U/ml，37°C 20分鐘消化ctDNA，95°C 5-10分鐘滅活DNAse，制備不含DNA的血漿基質(zhì)；加入等體積的溶解在緩沖液中的外源性DNA，使終濃度為100ng/ml，充分混勻，95°C 5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液分裝作為血漿ctDNA直接定量檢測的標準品，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?、取IOul標準品，加入90ul的0.5X緩沖液稀釋10倍，再取IOul稀釋后的血漿DNA，加入90ul的0.5X緩沖液再稀釋10倍，依次稀釋下去，制備出不同稀釋倍數(shù)的標準品O3、使用以下 18S rRNA編碼基因的PCR引物序列:18S_F:CGTAGTTCCGACCATAAACGA ；18S-R1:GACAAATCGCTCCACCAACTA(擴增子 62bp) ；18S-R2:GCCCTTCCGTCAATTCCT(擴增子147bp) ；18S-R3:GGCGGGTCATGGGAATAA (擴增子 297bp)。4、分別取2ul不同稀釋倍數(shù)的標準品血漿直接進行定量PCR擴增，PCR體系共20ul，包括快速復活熱啟動DNA聚合酶IuUSuperGreen染料lul、2x混合物IOul、終濃度為300nM 的引物 4ul 以及 H204ul ；95°C 5 分鐘；95°C 5 秒，60°C 20 秒，72°C 20 秒，重復 40 個循環(huán)。5、繪制各引物對擴增的標準曲線，計算待測血漿中ctDNA含量。按以下公式計算DNA完整性指數(shù)(DII) =DII =較大片段檢測的ctDNA含量/較小片段檢測的ctDNA含量。進一步，所述2x混合物包括2x反應緩沖液、終濃度為3mM的氯化鎂、三磷酸脫氧核苷。進一步，所述三磷酸脫氧核苷包括終濃度均為0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。進一步，所述不同稀釋倍數(shù)的標準品的稀釋倍數(shù)為1: 1、1: 10或者1: 100。進一步，進行定量PCR擴增使用ROCHE LightCycler480定量PCR儀。本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果為:1.該技術不經(jīng)過DNA提取步驟，可以去除DNA提取誤差所導致的ctDNA測定誤差；2.篩選了特定的18S rRNA編碼基因的PCR引物序列組裝ctDNA定量測定試劑盒，可以測定從60bp-350bpl8S rRNA編碼基因序列，結果的穩(wěn)定性、重復性和高靈敏度方面有顯著改善；3.試劑價錢便宜，減少了使用DNA提取試劑盒的費用等，操作簡便；4.可用于大規(guī)模腫瘤高危人群篩查、腫瘤的早期診斷及療效預后的動態(tài)觀察。


下面結合附圖和具體實施方式
進行詳細說明圖1為以18S RNA為測定對象進行標準量ctDNA的PCR擴增后的熒光信號分析2為血漿ctDNA含量與熒光強度的相關性曲線圖
具體實施方式
下面結合實例，對本發(fā)明進一步說明。1.肺癌患者62例，其中男43例，女19例，中位年齡52歲。健康查體30例，其中男19例，女11例，中位年齡45歲。2.取以上人員的外周靜脈血I 2ml，置于EDTA抗凝管中，10°C-20°C靜置4小時，2000g離心5分鐘，取上層血漿100ul-200ul，加入相同體積的試劑A，充分混勻，95°C 5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液為模板直接用于PCR檢測。3.結果:圖1為以18S RNA為測定對象進行標準量ctDNA的PCR擴增后的熒光信號分析圖；圖2為血漿ctDNA含量與熒光強度的相關性曲線圖；62例肺癌患者和30例健康人用3對18S rRNADNA引物測得的ctDNA見下表。
權利要求
1.一種以18SrRNA基因為測定對象的CtDNA含量和完整性測定方法，其特征在于，其步驟如下: (1)取5名健康人外周靜脈血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g離心5分鐘，取上層血漿500 μ 1，將5人血漿混勻后，加入DNAse,終濃度10U/ml，37°C 20分鐘消化ctDNA，95°C 5-10分鐘滅活DNAse，制備不含DNA的血漿基質(zhì)；加入等體積的溶解在緩沖液中的外源性DNA，使終濃度為100ng/ml，充分混勻，95°C 5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液分裝作為血漿ctDNA直接定量檢測的標準品，分裝后_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)取IOul標準品，加入90ul的0.5 X緩沖液稀釋10倍，再取IOul稀釋后的血漿DNA，加入90ul的0.5X緩沖液再稀釋10倍，依次稀釋下去，制備出不同稀釋倍數(shù)的標準品； (3)使用以下18S rRNA 編碼基因的 PCR 引物序列:18S_F:CGTAGTTCCGACCATAAACGA ；18S-R1:GACAAATCGCTCCACCAACTA 擴增子為 62bp ；18S-R2:GCCCTTCCGTCAATTCCT 擴增子為147bp ；18S-R3:GGCGGGTCATGGGAATAA 擴增子為 297bp ； (4)分別取2ul不同稀釋倍數(shù)的標準品血漿直接進行定量PCR擴增，PCR體系共20ul，包括快速復活熱啟動DNA聚合酶lul、SuperGreen染料lul、2x混合物IOul、終濃度為300nM的引物4ul以及H204ul ；95°C 5分鐘；95°C 5秒，60°C 20秒，72°C 20秒，重復40個循環(huán)； (5)繪制各引物對擴增的標準曲線，計算待測血漿中ctDNA含量；按以下公式計算DNA完整性指數(shù)DII =DII =較大片段檢測的ctDNA含量/較小片段檢測的ctDNA含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，其特征在于，所述2x混合物包括2x反應緩沖液、終濃度為3mM的氯化鎂、三磷酸脫氧核苷。
3.根據(jù)權利要求1所述的以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，其特征在于，所述三磷酸脫氧核苷包括終濃度均為0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
4.根據(jù)權利要求1所述的以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，其特征在于，所述不同稀釋倍數(shù) 的標準品的稀釋倍數(shù)為1: 1、1: 10或者1: 100。
5.根據(jù)權利要求1所述的以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，其特征在于，進行定量PCR擴增使用ROCHE LightCycler480定量PCR儀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以18SrRNA基因為測定對象的ctDNA含量和完整性測定方法，取5名健康人外周靜脈血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g離心5分鐘，取上層血漿500μl，將5人血漿混勻后，充分混勻，95℃5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液分裝作為血漿ctDNA直接定量檢測的標準品，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果為1.該技術不經(jīng)過DNA提取步驟，可以去除DNA提取誤差所導致的ctDNA測定誤差；2.篩選了特定的18SrRNA編碼基因的PCR引物序列組裝ctDNA定量測定試劑盒，可以測定從60bp-350bp18S rRNA編碼基因序列，結果的穩(wěn)定性、重復性和高靈敏度方面有顯著改善。
文檔編號C12Q1/68GK103160581SQ20131007204
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者宋現(xiàn)讓 申請人:宋現(xiàn)讓