專利名稱：一種曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni, Rochebrune)俗稱墨魚、日本無針烏賊，隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、二觸亞綱(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、烏賊超科(Sepiacea)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella),是我國(guó)近海重要的捕撈品種之一。其不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好并且具有一定的藥用價(jià)值。其肉潔白如玉，具有鮮、嫩、脆的特點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)豐富，每百克肉含蛋白質(zhì)13克、脂肪0.7克以及豐富的I丐、磷、鐵。除鮮食外，還可加工制成罐頭食品或干制品。烏賊的干制品南方叫螟蛹謄，北方叫墨魚干，雄性生殖腺干品叫烏龜穗，雌性纏卵腺于品叫烏魚蛋，均為海味佳品。烏賊骨即中藥海螵蛸。由于過度捕撈，至上世紀(jì)80 年代，烏賊的資源量銳減，漁訊消失，曼氏無針烏賊資源遭到極度破壞。如浙江舟山海域及山東日照海域，本為曼氏無針烏賊的主要產(chǎn)地，近年卻罕能見到野生曼氏無針烏賊。為了加強(qiáng)對(duì)曼氏無針烏賊資源的保護(hù)，近年來展開了其增殖放流及產(chǎn)卵場(chǎng)的保護(hù)和修復(fù)工作，人工育苗已取得成功，現(xiàn)在需要評(píng)估其資源現(xiàn)狀及建立增殖放流的效果的評(píng)估機(jī)制以制定合理的放流計(jì)劃，這對(duì)保護(hù)與恢復(fù)海洋多樣性具有重要意義。微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)是近年來飛速發(fā)展的遺傳分子標(biāo)記的一種。它是以2- 6個(gè)堿基的短核苷酸為基本單位重復(fù)串聯(lián)而成序列，一個(gè)微衛(wèi)星表達(dá)可達(dá)幾十到幾百個(gè)bp，由于重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)程度的不完全造成了每個(gè)位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性。由于每個(gè)微衛(wèi)星兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可根據(jù)其兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過PCR技術(shù)來擴(kuò)增相應(yīng)位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列，再經(jīng)電泳分析，即可顯示不同基因型個(gè)體微衛(wèi)星的多態(tài)性。微衛(wèi)星由于分布廣泛，密度大，多態(tài)性豐富，遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增，所需DNA數(shù)量極少，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因定位、分子標(biāo)記輔助育種(Marker-assisted Selection,MAS)等領(lǐng)域。特別對(duì)于水生生物，由于其生存環(huán)境等原因，利用微衛(wèi)星作為標(biāo)記可在沒有物理標(biāo)記的情況下區(qū)分混養(yǎng)個(gè)體所屬家系，可促進(jìn)育種工作的開展及提供其育種效率。因此，選用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)于曼氏無針烏賊資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及多態(tài)性引物，共提供8個(gè)曼氏無針烏賊的微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及相對(duì)應(yīng)的引物，為曼氏無針烏賊的種群遺傳學(xué)、家系鑒定及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)提供有效的工具。本發(fā)明一個(gè)方面提供8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核酸序列分別為SEQ ID NO: 1_8。本發(fā)明還提供上述核酸序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還提供從上述8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其中序列為SEQ ID NO:1的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)SM_1，其上下游序列分別為:SM_1 F:5，-GGGGAAGAAATCTCAGGAACA-3，，SEQ ID NO:9 ；SM_1 R:5，-GTAACAATGGCCGTGATGAA- 3’ SEQ ID NO:10 ； 序列為SEQ ID NO:2的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為:SM-2 F: 5’-ATGTTGAAACCAAGTAGATGCA-3’，SEQ ID NO:11 ；SM-2 R: 5’-TATTTTCTTTTGGCGGGAG-3’SEQ ID NO:12 ；序列為SEQ ID NO:3的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為:SM-3 F:5’ - CAGATGACCCCTTGAAATGA-3’，SEQ ID NO:13 ;SM-3 R: 5’-CAGATGACCCCTTGAAATGA-3’ SEQ ID NO: 14;序列為SEQ ID NO:4的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為:SM-5 F:5’ - AGTTGACGCAGGAGAAAGTGT-3’，SEQ ID NO:15;SM-5 R: 5’-CAATTCCACAAGCAAACCAT-3’ SEQ ID NO:16 ；序列為SEQ ID NO:5的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為:SM-9 F:5’-TTCAACCTTTATGACCGACTA-3’， SEQ ID NO:17;SM-9 R: 5’-CAGGTAGGTGTACGAGCAAA-3’ SEQ ID NO:18 ；序列為SEQ ID NO:6的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為:SM_16 F:5’-AGGTGGGGTCCTCATCTGTT-3’， SEQ ID NO:19 ；SM-16 R: 5’ - TGTTCCTGCCTGATAAAAGCA-3’ SEQ ID NO:20 ；序列為SEQ ID NO:7的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SM-17 F: 5’-TGAAAAGAGGATGGAAGAGACT-3’，SEQ ID NO:21 ；SM-17 R: 5’-TGTTATTACCACAGAGCAGGA-3’ SEQ ID NO:22;序列為SEQ ID NO:8的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SM-20F:5’-CACACCAAATTCTAACCTTCA-3’， SEQ ID NO:23SM-20 R: 5’ - GTTTCCTGTTAAATTGATATGAGT-3’ SEQ ID NO:24。本發(fā)明的微衛(wèi)星多態(tài)性引物用于曼氏無針烏賊種群遺傳多樣性的檢測(cè)，包括如下步驟:1)微衛(wèi)星PCR引物設(shè)計(jì)及合成:從已構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出含有微衛(wèi)星序列的片段，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行合成；2)基因組DNA的獲取:采用bio-tech DNA試劑盒提取曼氏無針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；3)微衛(wèi)星片段的擴(kuò)增:采用設(shè)計(jì)的引物，以已提取的曼氏無針烏賊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得曼氏無針烏賊個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物4)電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物:采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測(cè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物；5)遺傳參數(shù)評(píng)估:根據(jù)每個(gè)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEP0P 4.0.10計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。本發(fā)明從曼氏無針烏賊基因組DNA中篩選8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于曼氏無針烏賊的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。


圖1:本發(fā)明的微衛(wèi)星引物對(duì)應(yīng)用中親本對(duì)數(shù)與鑒定成功率的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明的微衛(wèi)星位點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的描述。1、微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選:從構(gòu)建的曼氏無針烏賊墨囊基因文庫(kù)的序列中用軟件SSRHUNTER1.3進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找；參數(shù)設(shè)置為查找含有二堿基、三堿基和四堿基重復(fù)數(shù)5次以上的序列。共篩選出20個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)的位點(diǎn)，并從中設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性的檢測(cè)。2、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物:從含有微衛(wèi)星的基因序列中，選取符合引物設(shè)計(jì)的序列使用PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。主要參數(shù)設(shè)置為:引物長(zhǎng)度18_25p，20個(gè)為最適長(zhǎng)度，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65 °C。GC含量一般在40%_60%之間，盡量避免錯(cuò)配，發(fā)卡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。3、檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行多態(tài)性I)基因組DNA的獲取:采用bio-t ech DNA試劑盒提取25個(gè)曼氏無針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；2 )微衛(wèi)星PCR的擴(kuò)增:采用設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星引物序列擴(kuò)增曼氏無針烏賊基因組DNA ;反應(yīng)體系20yL，包括 4XPower Taq PCR Master Mix (BioTeke, Beijing, China) 10 μ L,正、反向引物各 2μ L，基因組DNA約200 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4° C預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每一循環(huán)包括94° C變性I min，退火溫度I min (各引物退火溫度見表I)，72° C延伸I min,最后72。C延伸5 min。3)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物:采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，800W恒功率電泳1-1.5小時(shí)預(yù)電泳后進(jìn)行點(diǎn)樣，用1200V恒電壓電泳4-5個(gè)小時(shí)。電泳完成后進(jìn)行染色顯影處理，膠板在10%的冰醋酸溶液浸泡30min，蒸餾水分兩次洗滌各3min，0.2%硝酸銀溶液染30min，3%的碳酸鈉顯色30秒,終止反應(yīng)即顯現(xiàn)出擴(kuò)增的產(chǎn)物片段,采用10-bp DNA ladder作為marker檢測(cè)等位基因位置。4)遺傳參數(shù)評(píng)估:根據(jù)每個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEP0P 4.0.10計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，從而篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物及對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。經(jīng)過多樣性檢測(cè)，本發(fā)明共篩選出8個(gè)具有遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1-8,其設(shè)計(jì)的多態(tài)性引物的信息如表I所示表1:8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的退火溫度、片段長(zhǎng)度、多態(tài)性等的相關(guān)信息
權(quán)利要求
1.一種曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)，所述的位點(diǎn)為: 1)序列為SEQID NO: 1-8中的任一個(gè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)， 2)與I)中的微衛(wèi)星位點(diǎn)的核苷酸序列互補(bǔ)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物對(duì)，所述的引物對(duì)是從權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的。
3.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:1的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10o
4.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:2的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID NO:lUPSEQ ID NO:12。
5.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:3的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID N0:13和SEQ ID NO:14。
6.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:4的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
7.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:5的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
8.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:6的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID N0:19和SEQ ID NO:20。
9.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:7的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分 別為SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:22。
10.如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，從序列為SEQID NO:8的微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其序列分別為SEQ ID N0:23和SEQ ID NO:24。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種曼氏無針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核酸序列分別為SEQ ID NO:1-8。引物序列為SEQ ID NO:9-24。本發(fā)明從曼氏無針烏賊基因組DNA中篩選8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于曼氏無針烏賊的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103114088SQ201310071949
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者盧少坤, 王春琳, 李榮華, 宋微微, 母昌考 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)