測(cè)定人NEFM基因rs12515位點(diǎn)多態(tài)性的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及測(cè)定單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SNP (單核苷酸多態(tài)性）是指單個(gè)核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B(tài)性是個(gè)體與生倶來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應(yīng)用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測(cè)在遺傳學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進(jìn)化等遺傳學(xué)現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進(jìn)化歷史， 闡明物種進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用于考古學(xué)中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關(guān) 系。2.研究多態(tài)與種群未緣關(guān)系等遺傳學(xué)研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關(guān)，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用于疾病預(yù)防措施。通過研究人體 對(duì)毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對(duì)某種毒物發(fā)生毒性作用的個(gè)體，及時(shí)避免該個(gè)體與毒物接觸， 保護(hù)該易感人群。例如，對(duì)準(zhǔn)備從事接觸苯等有機(jī)溶劑的人群進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應(yīng)的個(gè)體，令其遠(yuǎn)離苯等有機(jī)溶劑，保護(hù)此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學(xué)中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態(tài)檢測(cè)可以判斷患病個(gè)體對(duì)某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個(gè)體對(duì)藥物效 果的反應(yīng)程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 神經(jīng)纖維絲（Neurofilaments, NFS)是真核生物細(xì)胞中主要的細(xì)胞骨架元素，主 要存在于神經(jīng)元中。其按分子量不同可分為三種亞單元，即分子量為68kd的低分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilment, light polypeptide, NEFL)，150kd大小的中等大小分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilament, medium polypeptide, NEFM),和 200kd 的高分子量神經(jīng)絲 (Neurofilament, heavy polypeptid, NEFH)。每種亞單元都是單個(gè)基因產(chǎn)物，在細(xì)胞骨架中 起到重要的作用。
[0005] 中分子量神經(jīng)纖維絲基因又稱為神經(jīng)纖維絲中鏈基因，是近年來研究較多的一種 細(xì)胞骨架基因，定位于染色體8p21，有4個(gè)外顯子。有研究表明NEFM基因多態(tài)性可能與其 編碼的蛋白功能有關(guān)。NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)位于UTR-3區(qū)域，有研究表明該多態(tài)可能影 響NEFM的功能。
[0006] NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因 C和T，形成三種NEFM 基因的基因型：CC型（人體基因組rsl2515多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為C)，CT型 (人體基因組rs12515多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為C和T)和TT型（人體基因組 rsl2515多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為T)。
[0007] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)（PCR - RFLP)技術(shù)是一種快速、簡便、準(zhǔn) 確、低成本測(cè)定SNP(單核苷酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對(duì)模板進(jìn) 行擴(kuò)增反應(yīng)，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切和檢測(cè)酶切產(chǎn)物的 片段長度，最終測(cè)定出SNP。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別含NEFM基因 rsl2515多態(tài)位點(diǎn)的堿基序列，不能采取PCR - RFLP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。因此需要開發(fā)新的檢 測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測(cè)定人NEFM基因 rsl2515 位點(diǎn)多態(tài)性的可靠手段。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測(cè)定人NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)多態(tài)性的方 法，包括：
[0010] 提供待測(cè)人基因組DNA ;
[0011] 提供擴(kuò)增人NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引 物具有錯(cuò)配喊基G ;
[0012] 以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以 獲得含GTAAAY片段，其中Y為人NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)上的待定堿基C或T ;
[0013] 提供限制性內(nèi)切酶；
[0014] 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（反應(yīng)）以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以 及
[0015] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人NEFM基因 rsl2515位點(diǎn)上的待定堿基Y是C還是T， 其中，限制性內(nèi)切酶為僅能夠切開GTAAAC片段與GTAAAT片段之一的限制性內(nèi)切酶。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯(cuò)配堿基G與Y之間相隔四 個(gè)堿基TAAA。令人驚訝的是，如此設(shè)置錯(cuò)配堿基將使酶切反應(yīng)進(jìn)行得極其順利，不會(huì)出現(xiàn)酶 切不充分等現(xiàn)象。并且，如此設(shè)置上游引物錯(cuò)配堿基使PCR反應(yīng)進(jìn)行順利，提高了 PCR的靈 敏度和特異度，這可能與錯(cuò)配堿基后使得擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)可選實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與Y相鄰。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基不與Y相 鄰。例如，上游引物末端可以是……GTAA、……GTA、……GT結(jié)構(gòu)。難以想象，具有這種設(shè) 計(jì)的上游引物竟然會(huì)進(jìn)一步大大促進(jìn)酶切反應(yīng)，這可能與擴(kuò)增結(jié)合力有某種關(guān)聯(lián)。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，限制性內(nèi)切酶可以采用僅能切開GTAAAC片段的 Hpyl66II或其同裂酶。這類酶價(jià)格低廉，能大大降低測(cè)定成本。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn)物（較短 片段通常不能有效觀測(cè)到）。通過觀測(cè)（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人NEFM 基因 rsl2515位點(diǎn)上的待定堿基是C還是T。例如，在采用Hpyl66II酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長片段這兩個(gè)片段的觀察結(jié)果來進(jìn)行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物，則待定堿基為T ;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長片段（小于總片段長度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為C;如果觀察到上述二者，則待定堿 基既包括C又包括T。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，判斷（或觀測(cè)）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來進(jìn)行的。這種情況下，優(yōu)選參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在 凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D 像位置，其中第一參照?qǐng)D像位置針對(duì)的是未切斷的總片段長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D 像位置則針對(duì)的是切斷后具有較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照?qǐng)D是由合成 的119bp和82bp兩個(gè)堿基片段同時(shí)經(jīng)凝膠電泳相同時(shí)間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復(fù)合參照?qǐng)D相比，由于采用了僅具有兩個(gè)特定參照?qǐng)D像位置的參照?qǐng)D，本發(fā)明的 這種方法能夠直觀快速地觀測(cè)或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時(shí)最大限度地避免了 誤判。酶切反應(yīng)后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進(jìn)行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準(zhǔn)確性。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長度而使得擴(kuò)增產(chǎn)物 的總片段長度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優(yōu)選長度40~ 60bp (在該優(yōu)選區(qū)間擴(kuò)增反應(yīng)尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度 的百分比超過20%。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使得具有總片段長度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物與切斷 后具有較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會(huì)變得模糊一片，無法準(zhǔn)確區(qū)分。上游引物的片段長度范圍保 證了 PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，避免了錯(cuò)配堿基時(shí)會(huì)出現(xiàn)的擴(kuò)增不足現(xiàn)象。
[0023] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過控制PCR擴(kuò)增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C (該溫度可提高擴(kuò)增反應(yīng)的