特異性），使得設(shè)計的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的這種設(shè)計可以使得PCR擴增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難以區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0024] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時間15~30s (該時間可提高擴增反應(yīng)的效率和擴增產(chǎn)物的特異性），使得設(shè)計 的PCR反應(yīng)時間較短，擴增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的這種設(shè)計可以使PCR擴增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴增而使得擴增產(chǎn)物較少，電泳后難以區(qū)分判斷；如果時間過長，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀察效果。
[0025] 在本發(fā)明中，PCR反應(yīng)成分可以包含DNA模板、上下游引物、Taq DNA polymerase (DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例 中，PCR 擴增反應(yīng)中可以使用 Taq DNA polymerase 及其 Taq Antibody。Taq Antibody 是 Taq DNA polymerase的單克隆抗體，其與Taq DNA polymerase結(jié)合后抑制DNA聚合酶活 性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可以封閉Taq DNA polymerase的活性，因此 可以非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴增，具有極高的 擴增靈敏度和特異性。Taq Antibody只需要在95°C加熱30s即可完全失活，釋放Taq DNA polymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴增反應(yīng)能夠順利進行。
[0026] PCR反應(yīng)中可以加入pH值為8. 1~8. 7的Tris-HCl緩沖液，在72°C延伸反應(yīng)時 調(diào)整PCR溶液pH值在6. 8~7. 8之間，從而使Taq酶在偏堿性環(huán)境中更好地發(fā)揮活性。另 外，PCR溶液中還可以加入明膠（0.01%)以減少PCR管對Taq酶的吸附作用，穩(wěn)定酶活性 及保護作用，促進PCR反應(yīng)。
[0027] 另外，PCR溶液中Mg2+濃度在1. 5~2. 0mmol/L之間時，可以很好地控制PCR反應(yīng) 的產(chǎn)率和特異性。
[0028] PCR反應(yīng)引物的終濃度一般為0. 1~1 μΜ左右，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增，太 低則擴增產(chǎn)物太少。
[0029] 此外，PCR反應(yīng)中還可以加入助溶劑二甲亞砜（DMS0)和硫酸銨以降低堿基錯配水 平，提高富含GC模板的擴增效率。這可能與消除引物和模板的二級結(jié)構(gòu)，降低DNA解鏈溫 度使DNA變性完全有關(guān)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于測定人NEFM基因 rsl2515位點多態(tài)性的 試劑盒，其包含：
[0031] 用于PCR擴增人NEFM基因 rs 12515位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上 游引物具有錯配堿基G以獲得含GTAAAY片段的擴增產(chǎn)物，其中Y為人NEFM基因 rsl2515 位點上的待定堿基C或T ;以及
[0032] 僅能夠切開GTAAAC片段與GTAAAT片段之一的限制性內(nèi)切酶。
[0033] 上述試劑盒中還可以包括其它成分，例如PCR反應(yīng)Mix(包括4種dNTP混合物、 Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、緩沖液，DMS0和硫酸銨）和用于實施測定的說明 書等。
[0034] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非有明顯抵觸，本發(fā)明的第一方面和第二方面的相 關(guān)特征可以相互組合。
[0035] 本發(fā)明的測定手段不但快速可靠，而且測定成本大大降低。
【附圖說明】
[0036] 圖1描述了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的酶切產(chǎn)物電泳紫外照片。其中Marker是：標(biāo) 準(zhǔn)參考位置；泳道1 :TT基因型；泳道2 :TC基因型；泳道3 :CC基因型。
【具體實施方式】
[0037] 下面對本發(fā)明進行詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下詳細描述僅用于說 明而非限定本發(fā)明。
[0038] (1)待測DNA的獲取
[0039] 采集不同人群外周血，提取基因組DNA后進行下面的NEFM基因 rs 12515位點多態(tài) 性的測定。
[0040] 對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制。既可以是從人體的體液或者組 織獲得離體樣本，還可以是經(jīng)過預(yù)先降解處理的基因組。為了方便實施，通常優(yōu)選從血液提 取離體樣本。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少NEFM基因的組織，而與是否表達 該NEFM基因無關(guān)。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可 以參考常用的分子生物學(xué)手冊，例如《實用流式細胞術(shù)彩色圖譜》、《分子克隆》第2版等。
[0041] ⑵引物設(shè)計與合成
[0042] 查找NCBI網(wǎng)站的Gene數(shù)據(jù)庫和SNP數(shù)據(jù)庫，分別獲得NEFM基因全序列和rs 12515 多態(tài)位點信息。rsl2515多態(tài)位點y前后部分堿基序列（堿基序列以5' 一3'表示，大小寫 意義相同）如下（SEQ ID N0:1):
[0043]
[0044] 根據(jù)上述序列設(shè)計引入錯配堿基的上游引物和下游引物。在最終所得擴增產(chǎn)物 上，上游引物的錯配堿基G與Y之間相隔四個堿基TAAA。
[0045] 在本發(fā)明中，上游引物具有錯配堿基G，且長度為35~60bp。下游引物也引入錯 配堿基C，目的是消除PCR產(chǎn)物序列該堿基位置附近的GTNNAC序列并消除該酶切位點。其 中一個實施例中的引物如下：
[0046] 上游引物：5'TGTATTATGC MAGTACCAA CTGAGCCAAA AACA￡TAAA 3'（SEQ ID N0:2)，
[0047] 下游引物：5'AAAAGTCCAT ITTAAATGCA CCAGTGAG￡T 3'（SEQ ID N0:3)，
[0048] 其中上、下游引物下劃線堿基均為錯配堿基。
[0049] (3)制備PCR擴增產(chǎn)物
[0050] 根據(jù)上游引物和下游引物特征及PCR相應(yīng)試劑制定PCR擴增程序和條件，制備 PCR擴增產(chǎn)物。其中一個實施例中，取基因組DNA(50~80ng)、上下游引物（終濃度為 0·~1 μΜ)、2XPCR Mix7. 5 μ L(包括 4 種 dNTP 混合物、Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、緩沖液，DMSO和硫酸銨）和雙蒸水共同組成15 μ L反應(yīng)體系，調(diào)整溶液pH為7. 3 左右。PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性30s，95°C變性30s - 63°C退火30s - 72°C延伸20s共 30個循環(huán)，72°C延伸7min。PCR反應(yīng)后獲得穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物。
[0051] (4)酶切反應(yīng)
[0052] 本發(fā)明采用內(nèi)切酶Hpyl66II的價格低廉，如表1所示。
[0053] 表1 NEB公司Hpyl66II內(nèi)切酶識別序列及其價格
[0055] 注：N為A或T或G或C。
[0056] 其中一個實施例中，取PCR產(chǎn)物10yL，加入限制性內(nèi)切酶Hpyl66II 5U、2yL 10X酶切緩沖液和7. 5 μ L雙蒸水組成20 μ L反應(yīng)體系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶 切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)1倍濃縮后電泳觀察。
[0057] (5)電泳測試
[0058] 其中一個實施例中，PCR產(chǎn)物經(jīng)Hpyl66II酶切后如果不能切開則仍為119bp，如果 被切開則出現(xiàn)82bp和37bp，其中37bp片段電泳圖中難以分辨。
[0059] 將酶切產(chǎn)物在2~4%瓊脂糖凝膠中3~8V/cm條件下，電泳30~80min，于紫外 燈下拍照測定。酶切電泳圖見圖1，依據(jù)119bp和82bp片段的有無判斷來判斷基因型：CC 型為82bp -個片段，CT型有119bp和82bp兩種片段，TT型為119bp -個片段。
[0060] 下面是實施本發(fā)明的若干實施例。
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