一種人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及測(cè)定單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SNP(單核苷酸多態(tài)性）是指單個(gè)核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式。基因多態(tài)性是個(gè)體與生倶來(lái)的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應(yīng)用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測(cè)在遺傳學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進(jìn)化等遺傳學(xué)現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進(jìn)化歷史， 闡明物種進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用于考古學(xué)中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關(guān) 系。2.研究多態(tài)與種群未緣關(guān)系等遺傳學(xué)研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關(guān)，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用于疾病預(yù)防措施。通過研究人體 對(duì)毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對(duì)某種毒物發(fā)生毒性作用的個(gè)體，及時(shí)避免該個(gè)體與毒物接觸， 保護(hù)該易感人群。例如，對(duì)準(zhǔn)備從事接觸苯等有機(jī)溶劑的人群進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應(yīng)的個(gè)體，令其遠(yuǎn)離苯等有機(jī)溶劑，保護(hù)此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學(xué)中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態(tài)檢測(cè)可以判斷患病個(gè)體對(duì)某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個(gè)體對(duì)藥物效 果的反應(yīng)程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004]PLIN1基因位于染色體15q26. 1，編碼的perilipin蛋白在脂肪代謝過程中起著重 要的作用。PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因A和G，形成三種 PLIN1基因的基因型：AA型（人體基因組rs2289487多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為A)， AG型（人體基因組rs2289487多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為A和G)和GG型（人體 基因組rs2289487多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為G)。
[0005] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)（PCR-RFLP)技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn) 確、低成本測(cè)定SNP(單核苷酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來(lái)對(duì)模板進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切和檢測(cè)酶切產(chǎn)物的片 段長(zhǎng)度，最終測(cè)定出SNP。PLIN1基因rs2289487多態(tài)位點(diǎn)采取PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)， 所需內(nèi)切酶為BsmI內(nèi)切酶，其價(jià)格較昂貴，需要開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測(cè)定人PLIN1基因 rs2289487位點(diǎn)多態(tài)性的可靠手段。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測(cè)定人PLIN1基因rs894160位點(diǎn)多態(tài)性的方 法，包括：
[0008] 提供待測(cè)人基因組DNA;
[0009] 提供擴(kuò)增人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中下 游引物具有錯(cuò)配喊基G;
[0010] 以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以 獲得含AGCRTCC片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中R為人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)上的待定堿基A或G;
[0011] 提供限制性內(nèi)切酶；
[0012] 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（反應(yīng)）以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以 及
[0013] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來(lái)確定人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)上的待定堿基R是A還是 G，
[0014] 其中，限制性內(nèi)切酶為僅能夠切開AGCATCC片段與AGCGTCC片段之一的限制性內(nèi) 切酶。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，下游引物的錯(cuò)配堿基G與多態(tài)位點(diǎn)R的 配對(duì)堿基之間相隔一個(gè)堿基A。令人驚訝的是，如此設(shè)置錯(cuò)配堿基將使酶切反應(yīng)進(jìn)行得極 其順利，不會(huì)出現(xiàn)酶切不充分等現(xiàn)象。并且，如此設(shè)置上游引物錯(cuò)配堿基使PCR反應(yīng)進(jìn)行順 利，提高了PCR的靈敏度和特異度，這可能與錯(cuò)配堿基后使得擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變有 關(guān)。
[0016] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，下游引物末端堿基與R的配對(duì)堿 基相鄰。例如，下游引物末端可以是……GA等結(jié)構(gòu)。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，限制性內(nèi)切酶可以采用僅能切開AGCATCC片段的 BtsCI或其同裂酶。這類BtsCI酶價(jià)格低廉，能大大降低測(cè)定成本。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長(zhǎng)度的未切 斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及（通常不能有效觀測(cè)到的）切斷后具有 較短片段的擴(kuò)增產(chǎn)物（通常不能有效觀測(cè)到的）。通過觀測(cè)（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片 段類型來(lái)確定人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)上的待定堿基是A還是G。例如，在采用BtsCI 酶的情況下，根據(jù)總片段和切斷后較長(zhǎng)片段這兩個(gè)片段的觀察結(jié)果來(lái)進(jìn)行判斷：如果觀察 到酶切產(chǎn)物只有一種具有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物，則待定堿基為G;如果觀察到酶 切產(chǎn)物只有一種具有較長(zhǎng)片段（小于總片段長(zhǎng)度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為A;如果觀察 到上述二者，則待定堿基既包括A又包括G。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，判斷（或觀測(cè)）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來(lái)進(jìn)行的。這種情況下，優(yōu)選參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在 凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D 像位置，其中第一參照?qǐng)D像位置針對(duì)的是未切斷的總片段長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D 像位置則針對(duì)的是切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照?qǐng)D是由合成 的195bp和153bp兩個(gè)堿基片段同時(shí)經(jīng)凝膠電泳相同時(shí)間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復(fù)合參照?qǐng)D相比，由于采用了僅具有兩個(gè)特定參照?qǐng)D像位置的參照?qǐng)D，本發(fā)明的 這種方法能夠直觀快速地觀測(cè)或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時(shí)最大限度地避免了 誤判。酶切反應(yīng)后，優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進(jìn)行電泳，增加圖像亮度，提高判 斷準(zhǔn)確性。
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長(zhǎng)度而使得擴(kuò)增產(chǎn)物 的總片段長(zhǎng)度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長(zhǎng)度至少為35bp，優(yōu)選長(zhǎng)度40~ 60bp(在該優(yōu)選區(qū)間擴(kuò)增反應(yīng)尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長(zhǎng)度占總片段長(zhǎng)度 的百分比超過20%。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使得具有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物與切斷 后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長(zhǎng)，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會(huì)變得模糊一片，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。上游引物的片段長(zhǎng)度范圍保 證了PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，避免了錯(cuò)配堿基時(shí)會(huì)出現(xiàn)的擴(kuò)增不足現(xiàn)象。
[0021] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過控制PCR擴(kuò)增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性），使得設(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清楚，無(wú)雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難以區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴(kuò)增效率使得特定擴(kuò)增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過控制PCR擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時(shí)間15~30s(該時(shí)間可提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性），使得設(shè)計(jì) 的PCR反應(yīng)時(shí)間較短，擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清 楚，無(wú)雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別，而且PCR時(shí)間較短。但是，如果時(shí)間過短，則特異條帶不能 完全擴(kuò)增而使得擴(kuò)增產(chǎn)物較少，電泳后難以區(qū)分判斷；如果時(shí)間過長(zhǎng)，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀察效果。
[0023] 在本發(fā)明中，PCR反應(yīng)成分可以包含DNA模板、上下游引物、TaqDNA polymerase(DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例 中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可以使用TaqDNApolymerase(DNA聚合酶）及其TaqAntibody。Taq Antibody是TaqDNApolymerase的單克隆抗體，其與TaqDNApolymerase結(jié)合后抑制DNA 聚合酶活性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可以封閉TaqDNApolymerase的活 性，因此可以非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，具 有極高的擴(kuò)增靈敏度和特異性。ChampagneTaqAntibody只需要在95°C加熱30s即可完 全失活，釋放TaqDNApolymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行。
[0024] PCR反應(yīng)中可以加入pH值為8. 1~8. 7的Tris-HCl緩沖液，在72°C延伸反應(yīng)時(shí) 調(diào)整PCR溶液pH值在6. 8~7. 8之間，從而使Taq酶在偏堿性環(huán)境中更好地發(fā)揮活性。另 外，PCR溶液中還可以加入明膠（0.01%)以減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，穩(wěn)定酶活性 及保護(hù)作用，促進(jìn)PCR反應(yīng)。
[0025] 另外，PCR溶液中Mg2+濃度在1. 5~2. 0mmol/L之間時(shí)，可以很好地控制PCR反應(yīng) 的產(chǎn)率和特異性。
[0026] PCR反應(yīng)引物的終濃度一般為0. 1~1μΜ左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太 低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。
[0027] 此外，PCR反應(yīng)中還可以加入助溶劑二甲亞砜（DMS0)和硫酸銨以降低堿基錯(cuò)配水 平，提高富含GC模板的擴(kuò)增效率。這可能與消除引物和模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低DNA解鏈溫 度使DNA變性完全有關(guān)。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于測(cè)定人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)多態(tài) 性的試劑盒，其包含：
[0029] 用于PCR擴(kuò)增人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其 中下游引物具有錯(cuò)配堿基G以獲得含AGCRTCC片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中R為人PLIN1基因rs2289487位點(diǎn)上的待定堿基A或G;以及
[0030] 僅能夠切開AGCATCC片段與AGCGTCC片段之一的限制性內(nèi)切酶。
[0031] 上述試劑盒中還可以包括其它成分，例如PCR反應(yīng)Mix(包括4種dNTP混合物、 Mg2+、TaqDNApolymerase、TaqAntibody、緩沖液，DMS0和硫酸銨）和