一種檢測(cè)男性不育癥Fkbp6基因突變位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測(cè)技術(shù)，涉及對(duì)人類(lèi)男性不育癥基因致病突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法。
[0002]本發(fā)明提供一種檢測(cè)人類(lèi)男性不育癥致病基因突變的PCR試劑盒。本發(fā)明的內(nèi)容涉及一種檢測(cè)男性不育癥Fkbp6基因中1個(gè)致病突變位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，該檢測(cè)結(jié)果可用來(lái)臨床輔助檢測(cè)男性不育癥。
【背景技術(shù)】
[0003]男性不育癥，是指男子在規(guī)律性生活且未避孕的情況下，一年內(nèi)未使健康配偶妊娠。男性不育癥(Male Infertility)嚴(yán)重影響現(xiàn)代男性健康和家庭幸福，據(jù)WTO統(tǒng)計(jì)表明:育齡夫婦約15%不能生育，其中男性因素占50%。導(dǎo)致男性不育的原因復(fù)雜廣泛，涉及生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)和功能、激素調(diào)節(jié)、遺傳物質(zhì)、感染免疫等諸多方面的異常和障礙。其中相當(dāng)一部分屬于原因不明的特發(fā)性不育，包括特發(fā)性無(wú)精子、弱精子、少精子、畸形精子癥。
[0004]目前，分子生物學(xué)方法已經(jīng)深入到男性不育癥研究當(dāng)中。導(dǎo)致男性不育的遺傳損害是多種多樣的，除了染色體非整倍體畸形和基因重排，還包括微缺失和單個(gè)基因缺陷。小鼠和果蠅基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超過(guò)3000個(gè)基因涉及雄性生育能力的遺傳調(diào)控，相關(guān)基因不僅涉及生精細(xì)胞系，還包括與性腺及軀體發(fā)育相關(guān)的功能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前發(fā)現(xiàn)了一大批涉及男性不育的染色體畸形和多效性單基因遺傳病。
[0005]1.AZF 基因
1976年，Tiepolo和Zuffardi通過(guò)核型分析發(fā)現(xiàn)了 6例無(wú)精子癥患者Y染色體長(zhǎng)臂的微缺失并提出了無(wú)精子因子(AZF)概念，隨后的研究將其定位于Yqll.23，AZFa缺失表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，AZFb缺失表現(xiàn)為生精阻滯，AZFc缺失的病理表現(xiàn)為從正常到無(wú)精子。AZF并不是單一的基因，而是在功能上相互關(guān)聯(lián)的基因家族，在精子發(fā)生、發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要作用，各種研究表明嚴(yán)重精子發(fā)生障礙包括無(wú)精子癥患者中約有3%-15%具有Y染色體微缺失。
[0006]2.X來(lái)源睪丸特異性逆基因
在精子發(fā)生的減數(shù)分裂期，性染色體隔離為XY小體，處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)，X染色體上活躍表達(dá)的管家基因也停止轉(zhuǎn)錄，而在此時(shí)，常染色體上一些X染色體來(lái)源睪丸特異性逆基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)其前輩基因的缺失表達(dá)起到補(bǔ)償作用，這稱(chēng)為補(bǔ)償假說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為逆基因在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，它們的突變可能導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生。一名少精子癥男子發(fā)生在10q22的交互易位，CSTE2T基因就位于10q22~q23，研究推斷少精子癥的發(fā)生與其有關(guān)。
[0007]3.性激素相關(guān)基因
比較常見(jiàn)的有雄激素受體基因(AR),卵泡刺激素受體基因(FSHR),黃體生成素受體基因(LHR)，促性腺激素基因，促性腺激素釋放激素受體基因(GnRHR )。其中，人FSH受體基因第7個(gè)外顯子的純合子點(diǎn)突變表現(xiàn)為不同程度的生精損害。LHR基因突變導(dǎo)致的功能喪失會(huì)引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良，輕者表現(xiàn)為性腺功能減退，重者表現(xiàn)為男性假兩性畸形。FSH-b突變的男性呈現(xiàn)無(wú)精子癥的表現(xiàn)。
[0008]4.線粒體相關(guān)基因
線粒體DNA的完整性和精子活動(dòng)及精液質(zhì)量普遍相關(guān)。KaoS在1995年發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)力最低的精子細(xì)胞擁有最高的4977bp mtDNA缺失率，認(rèn)為mtDNA突變?cè)诰硬∽冎邪l(fā)揮重要作用。
[0009]5.人類(lèi)生精階段標(biāo)志基因
精子的生成需要經(jīng)歷有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成等幾個(gè)階段，不育癥患者可出現(xiàn)不同階段的生精阻滯。研究發(fā)現(xiàn)，在某一個(gè)階段特異性的表達(dá)某些調(diào)控生精的關(guān)鍵基因，利用睪丸活檢組織進(jìn)行特定基因表達(dá)譜檢測(cè)，就可了解精子發(fā)生阻滯的階段。
[0010]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和男性不育癥致病基因定位的日漸明確，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和基因測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行分子檢測(cè)逐漸大行其道，其中，“分子開(kāi)關(guān)”檢測(cè)突變由于其操作簡(jiǎn)單、不用測(cè)序、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，成為廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)技術(shù)。
[0011]高保真DNA聚合酶在進(jìn)行DNA擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)引物與模板完全配對(duì)時(shí)，則在聚合酶的聚合中心直接進(jìn)行聚合反應(yīng)；當(dāng)引物與模板不完全配對(duì)時(shí)，則送到酶解中心進(jìn)行校正，校正后的引物再被送回聚合中心進(jìn)行聚合反應(yīng)；如果引物不能被即時(shí)校正，則PCR反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行，從而引發(fā)聚合反應(yīng)的非成熟性終止。于是產(chǎn)生了“配對(duì)引物可以延伸，不配對(duì)引物不延伸”二元化效果。在進(jìn)行點(diǎn)突變分析時(shí)，就可以利用這種二元化效果對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行非此即彼的二元化識(shí)別。而且，聚合酶對(duì)錯(cuò)配堿基的識(shí)別并不局限于引物的3’末端或新生DNA分子，也能識(shí)別3’末端上游1個(gè)至數(shù)個(gè)堿基距離的錯(cuò)配。根據(jù)這一特征，可以認(rèn)為高保真聚合酶對(duì)DNA合成時(shí)的堿基錯(cuò)配存在一個(gè)反復(fù)識(shí)別的過(guò)程。由此，可以將耐外切酶消化的硫化磷酸修飾的堿基特異性引物結(jié)合具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，而構(gòu)成了受單堿基差異調(diào)控的復(fù)合突變敏感性“分子開(kāi)關(guān)”。
[0012]該突變敏感性“分子開(kāi)關(guān)”已經(jīng)成功應(yīng)用于神經(jīng)性耳聾基因和苯丙酮尿癥/?"基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)；對(duì)性染色體以及線粒體上的SNP位點(diǎn)的檢測(cè)也取得成功，說(shuō)明“分子開(kāi)關(guān)”突變檢測(cè)技術(shù)是一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)實(shí)用的突變檢測(cè)方法。本專(zhuān)利運(yùn)用突變敏感性“分子開(kāi)關(guān)”突變檢測(cè)技術(shù)，建立了男性不育癥Fkbp6基因的1個(gè)致病突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測(cè)人類(lèi)男性不育癥致病基因突變的PCR試劑盒及相應(yīng)的PCR擴(kuò)增方法。目的是建立導(dǎo)致人類(lèi)男性不育癥的Fkbp6基因中1個(gè)致病突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，該檢測(cè)結(jié)果用于判讀患者是否攜帶Fkbp6致病突變。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是設(shè)計(jì)引物，根據(jù)目的片段的有無(wú)為臨床診斷提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
根據(jù)男性不育癥的Fkbp6基因中1個(gè)致病突變位點(diǎn)T141G設(shè)計(jì)以下引物:
正常模板配對(duì)引物T141G N F:5’-TCCGAGAAGGAGCTG-3’ ；突變模板配對(duì)引物T141G ΜF(xiàn):5’_ TCCGAGAAGGAGCGG-3’ ；共同的下游引物 T141G R:5’ -AGGCTGAGGCAGGAG-3’。其中，所述正常模板配對(duì)引物T141G N F和突變模板配對(duì)引物T141G M F的3’端的-3與-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾，或?qū)?2位堿基經(jīng)鎖核酸化(LNA)修飾。其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度284bp，其序列見(jiàn)序列表中的序列4。
[0015]本發(fā)明提供了檢測(cè)一種男性不育癥Fkbp6基因中1個(gè)致病突變位點(diǎn)T141G的試劑盒，包括'2 X PCR反應(yīng)mix。mix中含有PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、引物、耐熱性高保真DNA聚合酶、溴酚藍(lán)上樣緩沖液。
[0016]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種采用權(quán)利要求1和4所述的試劑盒檢測(cè)男性不育癥Fkbp6基因1個(gè)致病突變位點(diǎn)的一套操作流程，包括:
1，PCR擴(kuò)增采用權(quán)利要求書(shū)1的一組引物。
[0017]2，PCR擴(kuò)增由預(yù)變性和30-40次擴(kuò)增溫度循環(huán)組成。PCR反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性 10 min, 94 °C變性 30 sec, 55 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 30 sec，循環(huán) 30-40 次。循環(huán)結(jié)束后72 1:補(bǔ)齊延