背景技術(shù):
惡性腫瘤的發(fā)病是由多種外源性致癌物誘導(dǎo)和內(nèi)源性基因表達(dá)失控共同作用的結(jié)果,其中基因的異常表達(dá)包括多種癌基因的活化和/或多種抑癌基因的失活。fbxw7基因(f框/wd40域蛋白基因)又稱hcdc4,其表達(dá)的蛋白屬于f-box蛋白,是scf(skp1-cul1-fbox)泛素連接酶的靶蛋白識(shí)別組分,參與降解周期蛋白myc,notch1等,在人體細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞的生長和分化中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,其缺失能引起和/或加快癌細(xì)胞增殖,是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的抑癌基因。
fbxw7基因共有12個(gè)外顯子,在人類基因組中高度保守,其表達(dá)的蛋白有3個(gè)結(jié)構(gòu)域,包括f-box,wd40重復(fù)序列和d結(jié)構(gòu)域。其中n末端的wd40重復(fù)序列為底物結(jié)合域。fbxw7基因在癌癥中的整體突變率約為6%,而在急性t淋巴細(xì)胞白血病中的突變率高達(dá)31%,且43%的突變發(fā)生在兩個(gè)突變熱點(diǎn):arg465和arg479,頻率約為29%和14%。fbxw7的突變將影響自身功能,進(jìn)而對下游參與細(xì)胞周期的蛋白產(chǎn)生影響,使血液中的白細(xì)胞上升,導(dǎo)致疾病發(fā)生。akhoondi等發(fā)現(xiàn)fbxw7突變體可上調(diào)cycline的水平并且延長其半衰期。oneil等現(xiàn)fbxw7突變體和野生型共同形成的異二聚體雖然能和作為靶標(biāo)的myc結(jié)合,但卻不能正常地使其降解。2013年,king等將fbxw7突變體轉(zhuǎn)入小鼠的白血病造血干細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞大量擴(kuò)增,說明該基因突變使得白血病干細(xì)胞更具侵染性。
目前,fbxw7突變對于預(yù)后的意義存在差異,主要原因是:不同的治療方案對預(yù)后有不同的影響;白血病的成因復(fù)雜,有其他的不良因素同時(shí)干擾等。但是檢測fbxw7的突變是否存在,對于白血病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測以及針對性制定治療方案無疑有積極意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供檢測fbxw7基因突變的寡核苷酸,采用pcr技術(shù),可用于快速檢測急性t淋巴細(xì)胞白血病患者體內(nèi)的fbxw7基因外顯子突變情況。所述寡核苷酸包括至少一對擴(kuò)增fbxw7基因外顯子的引物,所述至少一對擴(kuò)增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r,其堿基序列為:
fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag;
fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg;
fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc;
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進(jìn)一步地,所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r,其堿基序列為:
m13f:tgtaaaacgacggccagt;
m13r:aacagctatgaccatg。
進(jìn)一步地,fbxw7-1f:fbxw7-1r、fbxw7-2f:fbxw7-2r、fbxw7-3f:fbxw7-3r、fbxw7-4f:fbxw7-4r、fbxw7-5f:fbxw7-5r、fbxw7-6f:fbxw7-6r、fbxw7-7/8f:fbxw7-7/8r、fbxw7-9f:fbxw7-9r、fbxw7-10f:fbxw7-10r、fbxw7-11f:fbxw7-11r、fbxw7-12f:fbxw7-12r的比值均為1。
進(jìn)一步地,m13f:m13r的比值為1。
進(jìn)一步地,所述寡核苷酸在輔助檢測急性t淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的方法,包括以下步驟:
(1)抽提樣本中的基因組dna;
(2)利用至少一對擴(kuò)增引物對(1)中的dna進(jìn)行擴(kuò)增,獲得擴(kuò)增產(chǎn)物;
(3)利用一對測序引物m13f和m13r對(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列;
(4)將(3)中的堿基序列與fbxw7基因野生型參考序列進(jìn)行比較,確定突變位點(diǎn)是否存在,其中,所述至少一對擴(kuò)增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r,其堿基序列為:
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fbxw7-7/8f:
tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg;
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fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg;
fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa;
所示
m13f:tgtaaaacgacggccagt;
m13r:aacagctatgaccatg。
進(jìn)一步地,fbxw7-1f:fbxw7-1r、fbxw7-2f:fbxw7-2r、fbxw7-3f:fbxw7-3r、fbxw7-4f:fbxw7-4r、fbxw7-5f:fbxw7-5r、fbxw7-6f:fbxw7-6r、fbxw7-7/8f:fbxw7-7/8r、fbxw7-9f:fbxw7-9r、fbxw7-10f:fbxw7-10r、fbxw7-11f:fbxw7-11r、fbxw7-12f:fbxw7-12r的比值均為1。
進(jìn)一步地,m13f:m13r的比值為1。
進(jìn)一步地,所述方法在輔助檢測急性t淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒,所述試劑盒包括檢測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液,其中,檢測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液包括至少一對擴(kuò)增引物,所述測序體系反應(yīng)液包括一對測序引物m13f和m13r,所述至少一對擴(kuò)增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r,其堿基序列為:
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fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg;
fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc;
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fbxw7-7/8f:
tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg;
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fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa;
所述一對測序引物的堿基序列為:
m13f:tgtaaaacgacggccagt;
m13r:aacagctatgaccatg。
進(jìn)一步地,fbxw7-1f:fbxw7-1r、fbxw7-2f:fbxw7-2r、fbxw7-3f:fbxw7-3r、fbxw7-4f:fbxw7-4r、fbxw7-5f:fbxw7-5r、fbxw7-6f:fbxw7-6r、fbxw7-7/8f:fbxw7-7/8r、fbxw7-9f:fbxw7-9r、fbxw7-10f:fbxw7-10r、fbxw7-11f:fbxw7-11r、fbxw7-12f:fbxw7-12r的比值均為1。
進(jìn)一步地,m13f:m13r的比值為1。
進(jìn)一步地,所述檢測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液還包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。
進(jìn)一步地,所述測序體系反應(yīng)液還包括測序純化液、牛小腸堿性磷酸酶、edta、無水乙醇、75%乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。
進(jìn)一步地,所述測序純化液包括核酸外切酶i、牛小腸堿性磷酸酶。
進(jìn)一步地,所述試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
進(jìn)一步地,所述試劑盒在輔助檢測急性t淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。
進(jìn)一步地,引物序列fbxw7-1f和fbxw7-1r是擴(kuò)增fbxw7基因第1號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-2f和fbxw7-2r是擴(kuò)增fbxw7基因第2號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-3f和fbxw7-3r是擴(kuò)增fbxw7基因第3號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-4f和fbxw7-4r是擴(kuò)增fbxw7基因第4號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-5f和fbxw7-5r是擴(kuò)增fbxw7基因第5號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-6f和fbxw7-6r是擴(kuò)增fbxw7基因第6號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-7/8f和fbxw7-7/8r是擴(kuò)增fbxw7基因第7和8號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-9f和fbxw7-9r是擴(kuò)增fbxw7基因第9號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-10f和fbxw7-10r是擴(kuò)增fbxw7基因第10號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-11f和fbxw7-11r是擴(kuò)增fbxw7基因第11號外顯子序列的引物,引物序列fbxw7-12f和fbxw7-12r是擴(kuò)增fbxw7基因第12號外顯子序列的引物。
有益效果:(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增fbxw7基因全部12個(gè)外顯子序列的引物,通過加接頭,使所有11對引物的pcr產(chǎn)物均可以用一對測序引物進(jìn)行測序,而現(xiàn)有的測序技術(shù)要對每種擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)特異性的測序引物,這就需要設(shè)計(jì)11條測序引物(單向測序)或22條測序引物(雙向測序),因此,本發(fā)明提供的擴(kuò)增引物既能將所述fbxw7全外顯子序列都擴(kuò)增出來,也保證無論這些外顯子的何處位置發(fā)生突變,都不會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況;(2)在設(shè)計(jì)引物時(shí),通過讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物,讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物,降低擴(kuò)增引物的數(shù)量,這也會(huì)降低擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量,從而降低測序引物的數(shù)量,因而極大地降低檢測成本;(3)本發(fā)明采用pcr技術(shù),通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件,可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳;(4)常用的熒光定量pcr法要針對fbxw7基因全部12個(gè)外顯子可能發(fā)生突變的眾多突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)探針,因此,在12個(gè)外顯子中,假設(shè)每個(gè)外顯子存在3個(gè)突變位點(diǎn),則要設(shè)計(jì)36個(gè)探針,檢測成本顯著增加,而本發(fā)明通過給設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物添加接頭,僅需使用一對測序引物就可檢測這36個(gè)突變位點(diǎn)以及還未被發(fā)現(xiàn)的其他突變類型,從而使得檢測成本顯著降低。
附圖說明
圖1為fbxw7基因在染色體上的定位圖。
圖2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12為fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r的電泳圖。
圖13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23分別為樣本1的fbxw7基因第1、2、3、4、5、6、7/8、9、10、11、12號外顯子野生型測序截圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是,實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法,通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如,奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版,或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
實(shí)施例1
一種檢測fbxw7基因多態(tài)突變位點(diǎn)的寡核苷酸,該寡核苷酸是針對fbxw7基因至少一個(gè)外顯子所設(shè)計(jì)的,包括至少一對擴(kuò)增引物,所述至少一對擴(kuò)增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r,其堿基序列為:
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fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg
fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc
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所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r,其堿基序列為:
m13f:tgtaaaacgacggccagt;
m13r:aacagctatgaccatg。
一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒,包括檢測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液和測序體系反應(yīng)液,其中,
檢測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液包括:2×pcrbuffer(10.0μl);dntps(2mm);kodfxdnapolymerase(1u/μl);fbxw7基因12個(gè)外顯子的上、下游引物fbxw7-1f(10μm)、fbxw7-1r(10μm)、fbxw7-2f(10μm)、fbxw7-2r(10μm)、fbxw7-3f(10μm)、fbxw7-3r(10μm)、fbxw7-4f(10μm)、fbxw7-4r(10μm)、fbxw7-5f(10μm)、fbxw7-5r(10μm)、fbxw7-6f(10μm)、fbxw7-6r(10μm)、fbxw7-7/8f(10μm)、fbxw7-7/8r(10μm)、fbxw7-9f(10μm)、fbxw7-9r(10μm)、fbxw7-10f(10μm)、fbxw7-10r(10μm)、fbxw7-11f(10μm)、fbxw7-11r(10μm)、fbxw7-12f(10μm)、fbxw7-12r(10μm)。
測序體系反應(yīng)液包括:測序純化液(核酸外切酶i:0.6u,牛小腸堿性磷酸酶:1.2u);edta(125mm);無水乙醇;75%乙醇;hidi(高度去離子甲酰胺);一對測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm);bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)。
優(yōu)選地,該試劑盒還包括血液dna抽提試劑。
優(yōu)選地,該試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。陽性對照品為含有人fbxw7基因外顯子dna的溶液,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。陰性對照品為ddh2o??瞻讓φ掌窞?μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
實(shí)施例2血液樣本dna抽提
血液樣本dna抽提(根據(jù)天根生物血液/細(xì)胞/組織基因dna提取試劑盒說明書):抽提人血液樣本dna,具體抽提方法如下:
(1)抽取300μl血液加入900μl紅細(xì)胞裂解液,顛倒混勻,室溫放置5分鐘,期間再顛倒混勻幾次。12000rpm離心1min,吸去上清,留下白細(xì)胞沉淀,加200μl緩沖液ga,振蕩至徹底混勻;
(2)加入20μl蛋白酶k溶液,混勻;
(3)加入200μl緩沖液gb,充分顛倒混勻,70℃放置10分鐘,溶液應(yīng)變清亮,簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠;
(4)加入200μl無水乙醇,充分振蕩混勻15秒,此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀,簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠;
(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中),12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱cb3放回收集管中;
(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱cb3放入收集管中;
(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱cb3放入收集管中;
(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw,12000rpm離心30秒,倒掉廢液;
(9)將吸附柱cb3放回收集管中,12000rpm離心2分鐘,倒掉廢液,將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;
(10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te,室溫放置2~5分鐘,12000rpm離心2分鐘,將溶液收集到離心管中。
實(shí)施例3樣本dna擴(kuò)增
按照實(shí)施例2抽提的血液樣本dna,然后利用實(shí)施例1中的擴(kuò)增引物擴(kuò)增人fbxw7基因外顯子,獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增時(shí)在常規(guī)pcr儀上進(jìn)行,可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。詳情如下所示:
(i)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)=待測樣本數(shù)+陰性對照1個(gè)+陽性對照1個(gè)+空白對照1個(gè))取測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液,每管19μl分裝于反應(yīng)管中;
(ii)將上述處理好的待測樣本和陰性對照品、陽性對照品各取1μl分別加入反應(yīng)管中,混勻,低速離心數(shù)秒,進(jìn)行pcr擴(kuò)增,獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液配制方法如表1所示。pcr擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)條件如表2所示。每對擴(kuò)增引物的詳細(xì)信息如表3所示。
表1.測體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液配制
注:表中的primerf和primerr選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r。
表2.pcr擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)條件
表3.每對擴(kuò)增引物信息
實(shí)施例4sanger測序
取9μl實(shí)施例3中的擴(kuò)增產(chǎn)物和2μl實(shí)施例1中的測序純化液按照表4中所述的程序進(jìn)行純化,從而獲得純化產(chǎn)物。
表4純化程序
將1μl所獲得的純化產(chǎn)物分別與實(shí)施例1中的測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)按照表5中的體系進(jìn)行混合,然后按照表6中的測序反應(yīng)程序進(jìn)行測序。
表5
表6.測序反應(yīng)程序
沉淀環(huán)節(jié):
向完成測序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μl125mm的edta,靜置5min;加入15μl無水乙醇,漩渦混勻;3700rpm離心30min;倒置離心15sec,加入50μl70%乙醇,漩渦混勻;3700rpm離心15min;倒置離心15sec,置于95℃金屬浴上;加入10μlhidi后進(jìn)行變性試驗(yàn)。變性試驗(yàn)步驟為:95℃,5min;接著在-30℃2min,然后在4℃保存。
變性程序結(jié)束后,上測序儀(abi3730)測序。
結(jié)果判斷:
分別將測序結(jié)果與fbxw7野生型參考序列(genbankaccn:nc_000004.12)進(jìn)行比對,根據(jù)實(shí)際突變情況對結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。
實(shí)施例5臨床樣本檢測
取16例臨床血液樣本(樣本編號為1~16)先后按照實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4,配制試劑、抽提樣本dna、擴(kuò)增(獲得擴(kuò)增產(chǎn)物)和測序。每份樣本往檢測體系pcr反應(yīng)液中加入1μl。
利用所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物,開展dna電泳,電泳條件為1.5%瓊脂糖凝膠電泳,110v,25min,凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳結(jié)果如圖2~12所示。
圖2~12為這16例血液樣本以fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r等11對擴(kuò)增引物擴(kuò)增后所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜,m為markerdl2000,1~16為送檢的血液樣本編號1~16號。這11對引物擴(kuò)增的片段長度分別為411bp、907bp、639bp、410bp、312bp、533bp、1361bp、376bp、340bp、368bp、970bp,通過電泳圖的分析表明這11對引物擴(kuò)增有效,且條帶單一。
在這16例樣品中,以樣本1為例進(jìn)行詳細(xì)說明。樣本1的測序結(jié)果如圖13~23所示。
圖13顯示是樣本1的fbxw7基因第1號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的1號外顯子未發(fā)生突變。
圖14顯示是樣本1的fbxw7基因第2號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的2號外顯子未發(fā)生突變。
圖15顯示是樣本1的fbxw7基因第3號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的3號外顯子未發(fā)生突變。
圖16顯示是樣本1的fbxw7基因第4號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的4號外顯子未發(fā)生突變。
圖17顯示是樣本1的fbxw7基因第5號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的5號外顯子未發(fā)生突變。
圖18顯示是樣本1的fbxw7基因第6號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的6號外顯子未發(fā)生突變。
圖19顯示是樣本1的fbxw7基因第7/8號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的7、8號外顯子未發(fā)生突變。
圖20顯示是樣本1的fbxw7基因第9號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的9號外顯子未發(fā)生突變。
圖21顯示是樣本1的fbxw7基因第10號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的10號外顯子未發(fā)生突變。
圖22顯示是樣本1的fbxw7基因第11號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的11號外顯子未發(fā)生突變。
圖23顯示是樣本1的fbxw7基因第12號外顯子野生型測序截圖,說明樣本1的12號外顯子未發(fā)生突變。
從檢測結(jié)果可以看出,本發(fā)明所述引物已經(jīng)把fbxw7基因共12個(gè)外顯子序列包括在內(nèi)了,能夠擴(kuò)展出fbxw7基因全部12個(gè)外顯子,并且測序結(jié)果完全準(zhǔn)確。由檢測結(jié)果可知,樣本1的12個(gè)外顯子均為野生型。另外,對fbxw7基因外顯子突變陽性樣本的檢測也表明本發(fā)明的寡核苷酸、方法和試劑盒能夠檢測出fbxw7基因外顯子突變的突變情況。
sequencelisting
<110>武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
<120>檢測fbxw7基因突變的方法、寡核苷酸及其應(yīng)用
<130>
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