一種基于ihf蛋白進(jìn)行基因突變方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，通過設(shè)計(jì)突變引物在引物重疊區(qū)域引入突變，同時(shí)應(yīng)用IHF蛋白代替同源重組酶進(jìn)行重組克隆。利用分段PCR擴(kuò)增和全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增方法獲得全長(zhǎng)的突變基因，應(yīng)用IHF介導(dǎo)的同源重組反應(yīng)在室溫下可以進(jìn)行，并且同源重組效果與市場(chǎng)上存在的試劑盒活性差距不大，重組效率可達(dá)到95％以上。突變基因重組克隆測(cè)序證明突變成功，說明本發(fā)明的基因突變方法的可行性，并且本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、和保存運(yùn)輸要求條件低等優(yōu)點(diǎn)，具有種非常大的市場(chǎng)應(yīng)用潛力。
【專利說明】
一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本申請(qǐng)屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因突變是指?jìng)€(gè)別d匪P(脫氧單磷酸核苷)殘基以至片段DNA在結(jié)構(gòu)、復(fù)制或表型 功能的異常變化，也稱為DNA損傷。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是當(dāng)代生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中基因研究 一種重要方法，可應(yīng)用于改造和優(yōu)化目的基因，基因功能研究，探索啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)位點(diǎn)的有 功能關(guān)系，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具。
[0003] 基因突變也是生物變異的根本來源，為生物的進(jìn)化提供了原材料?；蛑亟M和基 因突變可以產(chǎn)生多種多樣的基因組合的子代，其中一些子代會(huì)含有適應(yīng)某種環(huán)境變化的基 因組合，所以說基因突變是生物變異的來源之一，是形成生物多樣性的重要原因。因此，我 們對(duì)基因突變的研究具有重大意義。
[0004] 近年來隨著PCR法同源重組克隆法被愈來愈受重視，由于該方法不受載體和目的 片段的酶切位點(diǎn)限制，通過重組酶直接介導(dǎo)目的片段與載體相連接實(shí)現(xiàn)基因基因克隆。同 時(shí)同源重組克隆操作簡(jiǎn)單，PCR產(chǎn)物可一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應(yīng)時(shí)間 短和傳統(tǒng)方法相比，具有快速，效率高的特點(diǎn)。利用同源重組法介導(dǎo)的基因突變是目前基因 突變的一種重要手段。同源重組不僅可以發(fā)生在高等的生物體在原核的工程菌種也可以發(fā) 生同源重組，僅需要目的基因與載體具有同源區(qū)域就可以發(fā)生同源重組實(shí)現(xiàn)基因克隆載體 構(gòu)建?；谶@一原理，人為的導(dǎo)入同源突變基因可以成功的實(shí)現(xiàn)基因突變，對(duì)下游基因研究 具有重要意義。
[0005] 目前的基因重組反應(yīng)一般需要重組酶和多種輔助因子參與下發(fā)生。通常這些重 組酶組分制備工藝比較復(fù)雜，并且不耐高溫，存在運(yùn)送和保存方法要求也比較高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本申請(qǐng)所要解決的技術(shù)問題是提供了一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變 方法，首先利用已經(jīng)設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物擴(kuò)增目的基因引入突變和同源重組區(qū)域。在引物設(shè) 計(jì)的過程中在重疊區(qū)域插入缺失的基因或者替換需要突變的基因；在目的基因 DNA的兩端 引入與克隆載體同源的15_50bp序列。接著用具有重組活性的IHF蛋白把引入突變的DNA片 段重組到克隆載體，最后提取重組質(zhì)粒并測(cè)序?qū)崿F(xiàn)基因突變的目的。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本申請(qǐng)公開了一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，包括 以下步驟：
[0008] 1)對(duì)目的基因進(jìn)行處理:針對(duì)目的基因的某些位點(diǎn)進(jìn)行突變，并將突變后的目的 基因進(jìn)行處理，得到兩段具有重疊區(qū)域的DNA片段，該重疊區(qū)域包括突變位點(diǎn)；重疊區(qū)域的 DNA片段的長(zhǎng)度為15-25bp;
[0009] 2)設(shè)計(jì)引物:針對(duì)目的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物和至少一對(duì)突變引入引 物；
[0010] 3)突變基因擴(kuò)增:首先用突變引入引物對(duì)兩段具有重疊區(qū)域的DNA片段進(jìn)行分段 PCR擴(kuò)增，得到兩管PCR產(chǎn)物，然后用全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的全長(zhǎng)DNA片段；
[0011] 4) IHF基因重組轉(zhuǎn)化:使用IHF蛋白介導(dǎo)具有突變位點(diǎn)的目的基因與克隆載體發(fā)生 同源重組轉(zhuǎn)化，其中，具有突變位點(diǎn)的目的基因?yàn)椴襟E3)得到的全長(zhǎng)DNA片段；
[0012] 5)轉(zhuǎn)化:在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和克隆，得到重組DNA載體，并通過測(cè)序驗(yàn)證突變 結(jié)果。
[0013]進(jìn)一步地，步驟3)中的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增中的PCR反應(yīng)體系是：25μ1的2 X Phusion Master Mix，一對(duì)體積均為0 · 5μ1的基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，兩管體積均為0 · 5μ1的PCR 產(chǎn)物，佘量為蒸餾水，該P(yáng)CR反應(yīng)體系的總量為50μ1。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟3)中的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增中的PCR反應(yīng)程序是:95 °C lmin; 95 °C 30s，55°C30s，72°C30s，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C5min。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟4)中，重組過程添加 IHF蛋白，反應(yīng)條件是室溫直接放置10-15min， 然后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn);轉(zhuǎn)化用于DH5a、T0P10、DH10B感受態(tài)宿主菌。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0017] 1)載體線性化:載體線性化可以減少轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的假陽性克隆。本發(fā)明中采 用PCR法線性化載體，并且使用割膠回收線性化載體進(jìn)一步的減少PCR擴(kuò)增模板帶來的不必 要干擾。
[0018] 2)突變引物:突變擴(kuò)增引物需要設(shè)計(jì)包基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物一對(duì)和至少一對(duì)突變擴(kuò) 增引物。
[0019] 3)PCR擴(kuò)增:首先利用分段PCR將突變引入DNA片段中，然后用全長(zhǎng)擴(kuò)增引物擴(kuò)增出 具有同源重組區(qū)域DNA全長(zhǎng)。
[0020] 4)IHF蛋白同源重組:使用具有DNA非特異結(jié)合活性的蛋白IHF代替重組酶克隆突 變基因，轉(zhuǎn)化、克隆、提取質(zhì)粒并測(cè)序達(dá)到基因突變目的。
[0021] 本發(fā)明將用DNA非特異性結(jié)合蛋白IHF在基因重組過程中代替重組酶。IHF是與雙 鏈DNA結(jié)合的類似組蛋白的耐熱的小分子蛋白質(zhì)。IHF由a亞基(h imA編碼，11.35kD)和β亞基 (hip編碼，10.65kD)構(gòu)成，例如λ噬菌體的位置特異性重組就需要宿主編碼的整合宿主因子 IHF。同源重組克隆法是指利用重組酶將目的DNA和克隆載體連接實(shí)現(xiàn)的克隆技術(shù)，基于之 前我們用IHF蛋白重代替重組酶進(jìn)行重組克隆得到成功，專利設(shè)計(jì)使用IHF蛋白作為突變基 因重組克隆，該IHF蛋白介導(dǎo)重組并實(shí)現(xiàn)基因突變方法在國(guó)內(nèi)外也是首創(chuàng)。
[0022] 當(dāng)然，實(shí)施本申請(qǐng)的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0023] 此處所說明的附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申 請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中： [0024] 圖1是本申請(qǐng)IHF-β活性檢測(cè)電泳圖，其中，M: DNA分子量marker; 1:空白對(duì)照；2-8: 分別是pET-22b質(zhì)粒加入0.5、1、2、4、8、9μ1的IHF蛋白電泳結(jié)果；
[0025] 圖2是本申請(qǐng)分段PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M:100bp Marker;l:以primer 1和 Primer 2為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；2:以Pr imer 3和Pr imer4為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié) 果；
[0026] 圖3是本申請(qǐng)整段PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖，其中，M，100bp Marker;l:以實(shí)施例3中1和 2為模板，pr imer 1和pr imer 2位引物的PCR電泳結(jié)果圖；
[0027] 圖4是本申請(qǐng)菌落生長(zhǎng)情況，其中，4-1市售試劑盒轉(zhuǎn)化菌落生長(zhǎng)情況;4-2用本發(fā) 明的方法用ΙμL IHF蛋白的菌落生長(zhǎng)情況;4-3本發(fā)明的方法用2.5μ1 IHF蛋白的菌落生長(zhǎng) 情況。4-4:本發(fā)明的方法用4μ1 IHF蛋白的菌落生長(zhǎng)情況；
[0028]圖5是本申請(qǐng)cpl-3基因序列比對(duì)結(jié)果；
[0029]圖6是本申請(qǐng)cpl-9基因序列比對(duì)結(jié)果；
[0030]圖7是本申請(qǐng)cpl-ΙΟ基因序列比對(duì)結(jié)果；
[0031] 圖8是本申請(qǐng)IHF蛋白SDS-PAGE凝膠電泳。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本申請(qǐng)的實(shí)施方式，藉此對(duì)本申請(qǐng)如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0033]實(shí)施例1 IHF蛋白的制備
[0034] 1)IHF(NC_000913.3)來源于大腸桿菌，是DNA結(jié)合蛋白DNABII家族的一個(gè)成員。 它是可與雙鏈DNA結(jié)合的類似組蛋白的耐熱的小分子蛋白質(zhì)，IHF由α亞基（himA編碼， 11.35kD)和 β 亞基(hip 編碼，10.65kD)構(gòu)成。
[0035] 將來源于大腸桿菌的IHFa或IHF0亞基基因片段分別重組插入PET_22b表達(dá)載體 中，重組載體通過轉(zhuǎn)化后克隆，并用采用菌落PCR、酶切法和測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體正 確無誤，重組表達(dá)載體命名為PET22_IHFa或者pET22_IHFf3;
[0036] 2)將構(gòu)建好的重組載體pET22-IHFa或者PET22-IHF0轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)工程菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞中，氨芐平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆接種到加入氨芐抗性的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C，225rpm過夜培養(yǎng)，按體積比1:100的量接種到50ml的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C 培養(yǎng)至其0D值為0.6-0.8;添加 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，將菌液放入37°C，160rpm搖床中誘導(dǎo)表 達(dá)3小時(shí)；
[0037] 3)離心菌液收集菌體沉淀，通過反復(fù)凍融法使菌體裂解，蛋白從菌體中釋放。SDS- PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖8所示。
[0038] 4)IHF 的純化
[0039]菌液(3000 X g)離心15min，收集大腸桿菌菌體，-70 °C冷凍放置過夜。
[0040] 裂解緩沖液(組分為:0.1M，0.02M EDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶）（pH7.5)，重新懸 浮菌體，室溫放置30min。冰上超聲裂解菌體，裂解液離心（120(KK)Xg)90min收集上清。上清 液過陰離子交換柱Pr印Q。以25mM Tris/HCl，lmM EDTA(pH7.5)洗脫，再以NaCl溶液進(jìn)行梯 度洗脫。之后，再過肝素親和柱進(jìn)一步純化，以NaCl溶液梯度洗脫，可得到純度為95%左右 的IHF蛋白原液。經(jīng)測(cè)定IHF蛋白原液的濃度為102ngAU。
[0041 ] 5)IHF的活性檢測(cè)
[0042]按照表1配置10μ1的反應(yīng)體系
[0043] 表1 IHF活性檢測(cè)反應(yīng)體系表
[0044]
[0046] 如表1所示，在反應(yīng)液中，加入不同體積的IHF蛋白，室溫下靜置lOmin。取5μ1反應(yīng) 液跑瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。在加入IHF蛋白后，IHF與雙鏈DNA結(jié)合，隨著加入量 的增加，DNA條帶逐漸上移，這表明純化出的蛋白IHF具有與DNA結(jié)合的活性，并且與環(huán)狀的 雙鏈DNA相互作用。
[0047] 實(shí)施例2引物設(shè)計(jì)
[0048] 1)我們使用大腸桿菌基因組的一段基因序列，并送金斯瑞公司進(jìn)行基因片段合 成，其基因片段序列如SEQ ID NO. 1所示：
[0049] ATGAATAAATCTCAATTGATCGACAAGATTGCTGCAGGGGCTGATATCTCTAAAGCTGCGGCTGGCCGTGCGTTAGA t§ctattattgc^[tccgtaactgaatctctgaaagaaggggatgatgtagcactggtaggttttggtacttttgc CGTTAAAGAGCGTGCTGCCCGTACTGGCCGCAACCCGCAGACCGGTAAAGAGATCACCATCGCTGCTGCTAAAGTAC CGAGCTTCCGTGCAGGTAAAGCACTGAAAGACGCGGTAAACTAA；
[0050] 突變位點(diǎn)：第79位G-C，第90位T-A，我們將對(duì)原序列的第79位和第90位進(jìn)行突變。 并將該基因分成兩段具有重疊區(qū)域的DNA片段，該重疊區(qū)域包括突變位點(diǎn)；重疊區(qū)域的DNA 片段的長(zhǎng)度為15_25bp;
[0051 ] 2)引物設(shè)計(jì):使用的軟件:GenSearch設(shè)-Η對(duì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物和至少一對(duì)突變 引入引物，本發(fā)明設(shè)計(jì)一對(duì)突變引入引物和一對(duì)基因全長(zhǎng)同源重組引物，GenSearch輸出的 結(jié)果如下：
[0052] Primerlj'-CGTTAGATCCTATTATTGCATCCGTAACTGAATCH^JnSEQIDNOJm*;
[0053] Primer2:5' -GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGAATTCTTAGTTTACCGCGTCTT-3'，如SEQ ID NO. 3所示；
[0054] Primer3:5' -TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATATGAATAAATCTCAATTGATCG-3'，如SEQ ID NO.4所示；
[0055] Primer4:5/-CAGTTACGGATGCAATAATAGGATCTAACGCACG-3 /，如SEQIDN0·5所示； 其中，Primerl和Primer2是目的基因中的其中的一段基因的突變引入引物;Primer3和 Primer4是目的基因中的其中的另一段基因的突變引入引物；
[0056] 實(shí)施例3分段PCR
[0057] 1)分段PCR擴(kuò)增目的基因，在重疊區(qū)域引入突變，兩管PCR如表格2所示，每管體系 均為50μ1:
[0058]第一管:各種試劑添加如表2所示
[0059]表2第一段PCR反應(yīng)體系
[0060]
[0061 ]第二管:各試劑的添加如表格3所示：
[0062]表3第二段PCR反應(yīng)體系
[0063]
[0064] 2)均按以下條件進(jìn)行？0?反應(yīng)：95°(：1111丨11;95 1€3〇8,551€3〇8,721€3〇8，共30個(gè)循 環(huán)；最后 72°C5min。
[0065] 3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):每管取3μ1 PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠為電泳支持介質(zhì)，在1 XTAE和95V電壓下電泳30min，然后在0.5yg/mL溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射 儀觀察，結(jié)果見圖2,分段PCR的產(chǎn)物是目的產(chǎn)物，大小符合分段的兩段基因片段的大小。
[0066] 實(shí)施例4整段PCR
[0067] 1)整段PCR擴(kuò)增出整條基因片段，同時(shí)在基因的兩端引入與克隆載體15_50bp的同 源區(qū)域。整段PCR反應(yīng)體系如表4所示，反應(yīng)體系為50μ1:
[0068] 表4整段PCR反應(yīng)體系
[0069]
[0070] 2)均按以下條件進(jìn)行？0?反應(yīng)：95°(：1111丨11;95 1€3〇8,551€3〇8,721€3〇8，共30個(gè)循 環(huán)；最后 72°C5min。
[0071] 3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取3μ1 PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠為電泳支持介質(zhì)，在1 XTAE 和95V電壓下電泳30min，然后在0.5yg/mL溴化乙錠染色液中染色15min，用紫外透射儀觀 察，具體電泳結(jié)果見圖3,整段PCR的產(chǎn)物是目的產(chǎn)物，大小符合目的基因片段的大小。
[0072]實(shí)施例5.克隆轉(zhuǎn)化與測(cè)序
[0073]將實(shí)施例4制備得到的具有突變位點(diǎn)的目的基因（該基因的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1相比，在第79位和第90位不同，本核苷酸序列的79位為C，第90位為A)使用同源重組的 方法重組到克隆載體中，本發(fā)明中使用實(shí)施例1中制備的IHF蛋白介導(dǎo)同源重組反應(yīng)。詳細(xì) 步驟如下：
[0074] 1)IHF同源重組反應(yīng):配制IHF介導(dǎo)同源重組反應(yīng)體系，按照下表4配置反應(yīng)體系： [0075] 表4 IHF同源重組反應(yīng)體系
[0076]
[0077] 每個(gè)反應(yīng)的體積用水調(diào)節(jié)到10ul，混勻離心后，除了第一個(gè)加 Enzyme (0.5ul)的反 應(yīng)需要在22°C，30min充分反應(yīng)，65°C，10分鐘將酶滅活以外，其余的三個(gè)只加 IHF蛋白的反 應(yīng)條件是靜置在常溫下1 〇分鐘即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0078] 2)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：用熱激發(fā)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟如下:將反應(yīng)液分別加入lOOul Top 10 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化（1.5ml離心管），冰上靜置30min，使用金屬浴，42°C下熱激70s，再冰上 靜置5min。再在超凈工作臺(tái)中向離心管中加入300ul S0C培養(yǎng)基，在37 °C條件下，以轉(zhuǎn)速 225rpm搖菌lh。之后取200ul菌液進(jìn)行涂平板(含100mg/ml Amp的LB固體培養(yǎng)基），37°C培養(yǎng) 箱中倒置過夜培養(yǎng)，最后獲得克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4,由圖4可以看出加入不同量的IHF蛋白 進(jìn)行同源重組再轉(zhuǎn)化之后獲得的克隆數(shù)與使用市售同源重組試劑盒菌落生長(zhǎng)情況差別不 大，說明IHF蛋白可以達(dá)到與重組酶幾乎相同的重組效果。
[0079] 3)陽性克隆篩選:挑取3個(gè)圖4所示的平板中的單個(gè)菌落于離心管中，分別命名為 〇口1-3,〇口1-9和〇口1-10，并加入511111^培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)千分之一的10011^/1111的氨節(jié)，在37 °C條件下，以轉(zhuǎn)速180rpm培養(yǎng)過夜，各取lml菌液送金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖5-圖7。 結(jié)果表明突變位點(diǎn)均突變成功。
[0080] 上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí) 進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā) 明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 對(duì)目的基因進(jìn)行處理:針對(duì)目的基因的某些位點(diǎn)進(jìn)行突變，并將突變后的目的基因 進(jìn)行處理，得到兩段具有重疊區(qū)域的DNA片段，該重疊區(qū)域包括突變位點(diǎn)；重疊區(qū)域的DNA片 段的長(zhǎng)度為15_25bp; 2) 設(shè)計(jì)引物:針對(duì)目的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物和至少一對(duì)突變引入引物； 3) 突變基因擴(kuò)增:首先用突變引入引物對(duì)兩段具有重疊區(qū)域的DNA片段進(jìn)行分段PCR擴(kuò) 增，得到兩管PCR產(chǎn)物，然后用全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的全長(zhǎng)DNA片段； 4. IHF基因重組轉(zhuǎn)化:使用IHF蛋白介導(dǎo)具有突變位點(diǎn)的目的基因與克隆載體發(fā)生同源 重組轉(zhuǎn)化，其中，具有突變位點(diǎn)的目的基因?yàn)椴襟E3)得到的全長(zhǎng)DNA片段； 5) 轉(zhuǎn)化:在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和克隆，得到重組DNA載體，并通過測(cè)序驗(yàn)證突變結(jié)果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，其特征在于，所述步驟3)中 的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增中的PCR反應(yīng)體系是:25μ1的2 X Phusion Master Mix，一對(duì)體積均 為0.5μ1的基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，兩管體積均為0.5μ1的PCR產(chǎn)物，余量為蒸餾水，該P(yáng)CR反應(yīng)體 系的總量為50μ1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，其特征在于，所述步驟3)中 的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增中的PCR反應(yīng)程序是：95 cClmin; 95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 30s，共30 個(gè)循環(huán);最后72°C5min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于IHF蛋白進(jìn)行基因突變方法，其特征在于，所述步驟4)中， 重組過程添加 IHF蛋白，反應(yīng)條件是室溫直接放置10-15min，然后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn);轉(zhuǎn)化 用于DH5a、TOPl 0、DHl OB感受態(tài)宿主菌。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105907746SQ201510955600
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日
【發(fā)明人】戚智青, 王慶波
【申請(qǐng)人】戚智青