一種檢測(cè)vhl基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)VHL基因突變的檢測(cè)方法和試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] VHL基因（M頂編號(hào)608537)定位于3p25-26,全長(zhǎng)10KD，包含三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi) 含子，可轉(zhuǎn)錄形成兩種mRNA。包含三個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA翻譯出p30 (213個(gè)氨基酸） 和pl9 (159個(gè)氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（54號(hào)密碼子）轉(zhuǎn)錄形成 的異構(gòu)體，與p30功能相似。
[0003]VHL基因突變方式多樣，包括點(diǎn)突變、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突 變等。目前檢測(cè)VHL基因突變最常用的方法是PCR直接測(cè)序，確診率為38 %~80 %，但PCR 測(cè)序檢測(cè)技術(shù)只能檢測(cè)點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變，不能檢測(cè)VHL基因大片 段缺失。
[0004] 近年來，國(guó)內(nèi)外用于VHL基因大片段缺失檢測(cè)的方法包括SoythemBlot、MLPA、 RT-PCR及MPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有檢測(cè)方法操作繁瑣，價(jià)格昂貴，不 適于臨床推廣應(yīng)用的缺陷。RT-PCR、MPQFM-PCR雖操作簡(jiǎn)單，但診斷效率卻有限。而熒光 原位雜交在診斷基因大片段缺失上，兼有診斷效率高且適合臨床推廣的特點(diǎn)，因此，我們可 利用熒光原位雜交來診斷VHL基因大片段缺失，并結(jié)合PCR測(cè)序檢測(cè)點(diǎn)突變、小片段缺失或 插入、剪切位點(diǎn)突變的技術(shù)解決現(xiàn)有的VHL基因突變檢測(cè)效率有限和推廣困難的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種可以同時(shí)檢測(cè) VHL基因點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變和大片段缺失的方法和試劑盒，同時(shí)提 供一種用于VHL基因大片段缺失檢測(cè)的雜交探針。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種檢測(cè)VHL基因突變的方法，包括：利 用VHL基因的三個(gè)外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對(duì)4-6對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行VHL 基因點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測(cè)，獲得所述DNA溶液中是否存在點(diǎn)突 變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測(cè)結(jié)果；利用雜交探針對(duì)所述待測(cè)樣本進(jìn)行VHL 基因大片段缺失的檢測(cè)，獲得待測(cè)樣本是否存在大片段缺失的檢測(cè)結(jié)果。
[0007] 其中，所述雜交探針由如SEQIDNO. 1-6所示的探針引物通過PCR制備而得到。
[0008] 特別是，所述如SEQIDNO. 1-6所示的探針引物包括探針引物對(duì)1-3:
[0009] 探針引物 1 5' -agtaacgagttggcctagcctcg
[0010] 5'-cgtcttcttcagggccgtactc
[0011] 探針引物 2 f5' -gtactgacgttttactttttaaaaagataagg
[0012] Sj-Catgctctacacattgttctcctgg
[0013]探針引物 3 5' -gcattgcacatcaacggat
[0014] 5' -cagtcttcccaaagcaggag
[0015] 其中，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的探針引物進(jìn)行PCR制備得到的雜交探 針的大小為300-1000bp。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的探針引物進(jìn)行PCR制備得到 的雜交探針的大小為300-800bp。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的探針引物進(jìn)行PCR制備得到 的雜交探針的大小為300-500bp。
[0018] 其中，所述擴(kuò)增引物對(duì)4-6如SEQIDNO. 7-12所示，包括：
[0025] 其中，所述利用VHL基因的三個(gè)外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴(kuò)增引物對(duì)4-6 對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行VHL基因點(diǎn)突變、小片段缺失或插入、剪切位點(diǎn)突變的檢測(cè)包括：利用所述 擴(kuò)增引物對(duì)4-6和待測(cè)樣本建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；將得到 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理和測(cè)序分析，判斷所述DNA是否發(fā)生了VHL基因點(diǎn)突變、小片段缺 失或插入和剪切位點(diǎn)突變。
[0026] 其中，所述PCR反應(yīng)條件為：94°CIOmin預(yù)變性；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C復(fù)性5min;4°C保存。
[0027] 其中，所述利用雜交探針對(duì)所述待測(cè)樣本進(jìn)行VHL基因大片段缺失的檢測(cè)包括： 利用已采集的待測(cè)樣本制備細(xì)胞涂片；將所述雜交探針置于雜交液中與所述細(xì)胞發(fā)生雜交 反應(yīng)，獲得雜交產(chǎn)物；洗滌所述雜交產(chǎn)物，并進(jìn)行細(xì)胞核染色處理，獲得核染色后的細(xì)胞涂 片；通過熒光顯微鏡觀察所述核染色后的細(xì)胞涂片，判斷待測(cè)樣本的DNA是否發(fā)生了基因 大片段缺失。
[0028] 其中，所述待測(cè)樣本是具有細(xì)胞核的細(xì)胞，可以是外周血、組織標(biāo)本、尿液、脊髓及 其他含有VHL基因的具有細(xì)胞核的樣本。
[0029] 其中，所述雜交探針的濃度是約8_20ng/y1。
[0030] 優(yōu)選的，所述雜交探針的濃度是約10-15ng/ y 1。
[0031] 其中，所述雜交反應(yīng)的共變性溫度是70-80°C，共變性反應(yīng)時(shí)間是5-10min。
[0032]優(yōu)選地，所述雜交反應(yīng)的共變性溫度是73-76°C，共變性反應(yīng)時(shí)間是7-8min。
[0033] 其中，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度是40_46°C，雜交時(shí)間是14_18h。
[0034] 優(yōu)選地，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度是42-44°C，雜交時(shí)間是16h。
[0035] 特別是，所述利用雜交探針對(duì)所述待測(cè)樣本進(jìn)行VHL基因大片段缺失的檢測(cè)還包 括雜交探針的制備。
[0036] 其中，所述雜交探針的制備包含：在人類基因組中篩選用作FISH探針的VHL基因 序列，通過克隆引物對(duì)7-9獲得目的基因片段；將得到的基因片段連接到質(zhì)粒中，獲得含有 目的基因片段的質(zhì)粒；將所述質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后，得質(zhì)粒溶液；利用 探針引物、熒光原料和所述質(zhì)粒溶液制備具有熒光染料標(biāo)記的熒光原位雜交探針。
[0037]其中，所述克隆引物對(duì)7-9如SEDIDNO. 13-18所述的堿基序列，包括：
[0044] 其中，所述制備細(xì)胞涂片的過程包括：分離所述樣本中的細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗 滌和KCl低滲處理后，用固定液固定所述細(xì)胞的形態(tài)，制成細(xì)胞涂片；將所述細(xì)胞涂片進(jìn)行 老化處理，經(jīng)胃蛋白酶消化處理后，進(jìn)行酒精梯度脫水，得到細(xì)胞涂片。
[0045] 其中，所述通過克隆引物對(duì)7-9獲得目的基因片段的反應(yīng)體系是
[0046]
[0047] 其中，所述通過克隆引物對(duì)7-9獲得目的基因片段反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性 lOmin，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 個(gè)循環(huán)，72°C復(fù)性 7min，4°C保存。
[0048] 其中，所述將得到的基因片段連接到質(zhì)粒中的反應(yīng)體系是：T-vector0. 7y1，PCR 產(chǎn)物 5yI，T4連接酶IyI，T4Byf f erIyI，ddH20 余量，總體積 10y1。
[0049] 其中，所述將得到的基因片段連接到質(zhì)粒中的反應(yīng)條件是：在室溫條件下反應(yīng) 2h〇
[0050] 其中，所述利用探針引物、熒光原料和所述質(zhì)粒溶液制備具有熒光染料標(biāo)記的熒 光原位雜交探針的反應(yīng)體系為：
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