一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體地，涉及一種同時檢測沙門氏菌（Salmonella)、志 賀氏菌（Shigella)和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus)三種菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品中存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食源性疾病呈逐年上 升趨勢，給人們的健康帶來很大的潛在威脅。由沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在全 球范圍內(nèi)引發(fā)的食源性疾病導(dǎo)致大量人員死亡，造成數(shù)十億美元損失。一份2003-2007年 中國細(xì)菌性食源性疾病流行病學(xué)特征分析顯示，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門 氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的比例分別為10. 3%、8. 9%和1.5%，三種致病菌導(dǎo)致 的食源性疾病事件總數(shù)占到統(tǒng)計的1060起食源性疾病時間的20%以上。
[0003] 目前應(yīng)對食品安全突發(fā)事件的手段一般為采集樣品后送到相關(guān)檢測機構(gòu)進(jìn)行傳 統(tǒng)分離培養(yǎng)，經(jīng)生理生化實驗后進(jìn)行確認(rèn)或排除。此方法培養(yǎng)時間長、工作量大、實驗步驟 繁瑣，在很多突發(fā)事件中不能及時反映準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。常規(guī)PCR方法檢測時間短，但其靈敏度 和可能帶來的污染是不能不考慮的問題。免疫磁分離技術(shù)是將特異性抗體與一定大小的磁 珠偶聯(lián)，利用特異性抗體能與細(xì)胞表面抗原相結(jié)合的原理，將磁球與細(xì)胞結(jié)合，在外磁場的 作用下，將磁球-細(xì)胞復(fù)合物從環(huán)境中分離出來，達(dá)到獲取目標(biāo)細(xì)胞的一項技術(shù)，但是單獨 使用該技術(shù)時只能實現(xiàn)分離，還需結(jié)合其他手段進(jìn)行檢測，而目前使用免疫磁分離技術(shù)進(jìn) 行分離的檢測方法的靈敏度仍有待提高。Taqman探針法多重實時熒光定量PCR技術(shù)采用了 封閉式反應(yīng)體系，采用多組特異性引物及探針，針對多組目標(biāo)菌進(jìn)行同時擴增檢測，而其準(zhǔn) 確性仍有待提1?。
[0004] 目前應(yīng)用免疫磁分離-多重?zé)晒舛縋CR對食品中的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃 色葡萄球菌進(jìn)行三重檢測還未見有報道，值得進(jìn)一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測方法靈敏度和準(zhǔn)確性不高以及難以實現(xiàn)三種菌株 的同時檢測的缺陷，提供一種具有高靈敏度和準(zhǔn)確性并能夠同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌 和金黃色葡萄球菌的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)食品中的復(fù)雜成分、 培養(yǎng)基成分以及DNA提取過程中提取液的殘留成分等都是PCR反應(yīng)的潛在抑制因子，會直 接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，配合使用免疫磁分離技術(shù)與多重?zé)晒舛?PCR的方法能夠有效地實現(xiàn)沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測。因此，本發(fā) 明提供了一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)將待測樣品與液體培養(yǎng)基混合，并將混合物置于能夠使待測樣品中可能存在 的細(xì)菌擴增的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得擴增后的樣品；
[0008] (2)利用免疫磁珠捕獲擴增后的樣品中可能存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0009] (3)提取步驟⑴中捕獲的菌體的基因組DNA ;
[0010] (4)采用針對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物對提取到的基 因組DNA進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR，根據(jù)多重?zé)晒舛縋CR的結(jié)果確定待測樣品中沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的存在。
[0011] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明實現(xiàn)了沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的同時 檢測，靈敏度高且結(jié)果準(zhǔn)確。而且，本發(fā)明方法能夠快捷地對待測樣品中的沙門氏菌、志 賀氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，對提高快速應(yīng)對食品安全突發(fā)事件的能力具有重大意 義。
[0012] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【具體實施方式】
[0013] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0014] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的單位"CFU/g"意指以每克待測樣品 為基準(zhǔn)的菌株的CFU數(shù)；使用的術(shù)語"免疫磁珠"是指通過偶聯(lián)反應(yīng)將抗體結(jié)合到磁性微 球（或磁球）的表面上，形成的免疫磁性微球；術(shù)語"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；術(shù)語"引 物"包括至少一個上游引物和至少一個下游引物；本發(fā)明中使用的液體體積均為20°C下的 數(shù)值。
[0015] 本發(fā)明提供了 一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法，該方法包 括以下步驟：
[0016] (1)將待測樣品與液體培養(yǎng)基混合，并將混合物置于能夠使待測樣品中可能存在 的細(xì)菌擴增的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得擴增后的樣品；
[0017] (2)利用免疫磁珠捕獲擴增后的樣品中可能存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯(lián)得到；
[0018] (3)提取步驟⑴中捕獲的菌體的基因組DNA ;
[0019] (4)采用針對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物對提取到的基 因組DNA進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR，根據(jù)多重?zé)晒舛縋CR的結(jié)果確定待測樣品中沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的存在。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，為了準(zhǔn)確地檢測待測樣品中三種菌株的存在，需要在免疫磁分離之 前對待測樣品進(jìn)行細(xì)菌擴增處理，從而擴增待測樣品中可能存在的細(xì)菌，特別是沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌。所述液體培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基， 如營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（優(yōu)選為加入有〇. 8-1. 2重量％的甘氨酸的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）。所述培 養(yǎng)的條件也可以為常規(guī)選擇，例如，培養(yǎng)的溫度可以為35-38°C，培養(yǎng)的時間可以為4-6h， 可以利用搖床進(jìn)行所述培養(yǎng)，而搖床的轉(zhuǎn)速通?？梢栽O(shè)置為100_200rpm。本發(fā)明中，經(jīng)培養(yǎng) 步驟獲得的培養(yǎng)物即可直接作為擴增后的樣品。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，抗體與磁球偶聯(lián)獲得所述免疫磁珠的方法可以為常規(guī)方法，例 如，可以按照文獻(xiàn)（劉輝榮等，簡便高效分離細(xì)胞新型免疫磁珠制備，中國公共衛(wèi)生， 2008,11:1349-1351)中的方法進(jìn)行。
[0022] 為了捕獲待測樣品中的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌，所述抗體包括分 別能夠與沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合的抗體，優(yōu)選地，所述抗體包括 沙門氏菌多克隆抗體、志賀氏菌多克隆抗體和金黃色葡萄球菌多克隆抗體，更優(yōu)選包括購 自Meridian公司的商品號（Cat. #)為G5V61-500的兔抗沙門氏菌抗體、購自Meridian公司 的商品號（Cat. #)為B65901R的兔抗志賀氏菌抗體和購自Meridian公司的商品號（Cat. #) 為B65881R的兔抗金黃色葡萄球菌抗體。
[0023] 所述磁球可以為各種常規(guī)用于免疫磁分離的磁球，例如，可以為表面修飾有氨基 或羧基的超順磁性Fe304聚苯乙烯復(fù)合微球。優(yōu)選情況下，所述磁球的粒徑為150-200nm。
[0024] 優(yōu)選情況下，相對于每毫克的磁球，所述抗體的用量彡0. lmg，更優(yōu)選為0. 1-lmg。 在實際操作時，可以由不同抗體分別制得三種免疫磁珠，進(jìn)行免疫磁分離捕獲時再將三者 加入體系中。
[0025] 優(yōu)選情況下，相對于每毫升的擴增后的樣品，以磁球的重量計，所述免疫磁珠的用 量為0. 5-5 μ g，更優(yōu)選為2-3 μ g。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，利用免疫磁珠捕獲三種菌體可以借助免疫磁分離系統(tǒng)（例如Matrix Pathatrix免疫磁分離系統(tǒng)）進(jìn)行，對所述捕獲的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，步驟（1) 中，捕獲的條件包括：溫度為35-38°C，時間為25-35min。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，對步驟（2)中提取基因組DNA的具體方法沒有特別的要求，可以為本 領(lǐng)域常規(guī)采用的提取DNA的方法，可以使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，具體操作及條件可 以參見試劑盒的說明書。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，所述多重?zé)晒舛縋CR為三重?zé)晒舛縋CR，所述特異性引物優(yōu)選 為能夠特異地擴增沙門氏菌的NAa基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 :10所示）、志賀氏菌 的 ipaH 基因 （Accession Number :M76445)和金黃色葡萄球菌的 Sa442 基因 （Accession Number :AF〇33l9l)的引物。
[0029] 進(jìn)一步優(yōu)選地，多重?zé)晒舛縋CR所使用的上游引物、下游引物以及相應(yīng)的特異 性熒光探針的核苷酸序列如下：
[0030] 上游引物 1 :5' -GCTATTTTCGTCCGGCATGA-3'（SEQ ID NO :1)
[0031] 下游引物 1 :5' -GCGACTATCAGGTTACCGTGGA-3'（SEQ ID NO :2)
[0032] 特異性熒光探針 1 :5' -TAGCCAGCGAGGTGAAAACGACAAAGG-3'（SEQ ID NO :7)
[0033] 上游引物 2 :5' -CTTGACCGCCTTTCCGATA-3'（SEQ ID NO :3)
[0034] 下游引物 2 :5' -AGCGAAAGACTGCTGTCGAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0035] 特異性熒光探針 2 :5' -AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3'（SEQ ID NO :8)
[0036] 上游引物 3 :5, -T