專利名稱：檢測(cè)OTOF基因c.2382_2383delC突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)OTOF基因突變的試劑盒；本發(fā)明還涉及新的OTOF突變基因及其在診斷和/或治療感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders, ANSD)是由第珊頡神經(jīng)的聽支受損而引起的一種特殊的感音神經(jīng)性聾。表現(xiàn)為聲音可以通過外耳、中耳正常的進(jìn)入到內(nèi)耳，但聲音信號(hào)不能同步地從內(nèi)耳傳輸?shù)酱竽X的
聽功能異常性疾病。臨床聽力檢查表現(xiàn)為誘發(fā)性耳聲發(fā)射正常、聽性腦干反應(yīng)嚴(yán)重異常的一組聽功能障礙癥候群。聽神經(jīng)病譜系障礙多自幼年或青春期起病，在高危嬰幼兒中發(fā)病率約為0. 23%，在各種原因所致的ABR異常的聾病患兒中的發(fā)病率高達(dá)11%，無性別差異。目前研究表明，聽神經(jīng)病譜系障礙的發(fā)病主要和遺傳、免疫、感染、中毒、代謝等相關(guān)因素相關(guān)。按照是否合并其他系統(tǒng)疾病可將遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙分為兩類一類是合并有其它顱神經(jīng)和/或周圍神經(jīng)病損的綜合征型疾病，如Charot Marie Tooth綜合征CMT1型(脫髓鞘型)及CMT2型(軸突型)、費(fèi)里德賴希共濟(jì)失調(diào)綜合征等；另一種是僅有聽力下降表現(xiàn)的非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙。非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙由于表型單一，基因型與表型之間有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。Stan■等根據(jù)發(fā)病部位的不同將其分為TYPE I型(病變部位在聽神經(jīng))和TYPE II型(病變部位在內(nèi)毛細(xì)胞及突觸)。按照遺傳模式的不同可將遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙分為常染色體顯性遺傳(AUNAl)、常染色體隱性遺傳(NSRAN)和X連鎖隱性遺傳(AUNXl)以及線粒體DNA突變等。2003年，Varga等運(yùn)用連鎖分析的方法，將四個(gè)家系定位在包含OTOF基因所在的2p23區(qū)域內(nèi)，確定OTOF為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)且較為常見的與非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的基因。OTOF基因DNA序列全長(zhǎng)101496bp，包含48個(gè)外顯子，定位于2p23。OTOF基因的編碼區(qū)，含終止密碼子，如SEQ ID NO. I所示。OTOF長(zhǎng)亞型變異體的mRNA長(zhǎng)度為7172bp，所編碼的蛋白質(zhì)otoferlin (如SEQ ID NO. 2所示)包含1997個(gè)氨基酸，可能參與突觸囊泡的融合。Otoferlin具有6個(gè)I丐離子結(jié)合區(qū)域(C2domain),其中后4個(gè)含有完整的5個(gè)天冬氨酸殘基，可以與鈣離子結(jié)合，且存在I個(gè)羧基端跨膜區(qū)域(TM)，這些結(jié)構(gòu)在脊椎動(dòng)物都是高度保守的。2006年,Petit教授研究小組觀察到小鼠otof基因編碼的蛋白質(zhì)otoferlin在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與傳入神經(jīng)元所形成的帶型突觸處呈高表達(dá)。敲除otof基因的純合小鼠表現(xiàn)為極重度耳聾，其內(nèi)毛細(xì)胞帶型突觸形態(tài)保持正常，鈣離子流通也正常，但是突觸囊泡的胞吐作用卻完全廢止，因此得出結(jié)論otof基因編碼的蛋白質(zhì)otoferlin作為一種鈣離子感應(yīng)器，在內(nèi)毛細(xì)胞帶型突觸處觸發(fā)膜融合，從而在內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡的胞吐過程中發(fā)揮著重要作用。因此由該基因突變導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者病變部位多在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞或突觸，人工耳蝸手術(shù)治療效果較好。而國(guó)內(nèi)外對(duì)于感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者OTOF基因的篩查發(fā)現(xiàn)，攜帶有該基因突變的聽神經(jīng)病譜系障礙患者臨床多以TypeII型表現(xiàn)為主，適合于人工耳蝸植入。而TYPE I型聽神經(jīng)病譜系障礙患者病變部位在聽神經(jīng)，位置深在，目前尚無有效的治療方法。因此，利用對(duì)感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的OTOF基因的檢測(cè)進(jìn)行輔助分型，對(duì)于臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供用于檢測(cè)OTOF突變c. 2382_2383delC(X800)基因的試劑盒，其技術(shù)方案為一種用于檢測(cè)與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的位于OTOF基因的c. 2382_2383delC(X800)突變的試劑盒，所述試劑盒包括 從待測(cè)樣品中提取DNA的試劑；用于擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的試劑；其中，所述擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第2382-2383位堿基。具體地，上述PCR引物為選自0T0F-F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3’，0T0F-R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -AGCTTCTGCAGGAAGTTCTGG-3’ ；0T0F-F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -GGAGGATGAGGCGGAACT-3’，0T0F-R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -GGGGGTTGTGACACCTTCT-3’ ；0T0F-F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -GCTGTGGCTGCTGGTGAGA-3’，0T0F-R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -GACAGCTCGGGCCATGAC-3’ ；0T0F-F-4 (SEQ ID NO. 9) :5，-CCAGCATCACCCACACTCCT-3，，0T0F-R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CGAAGGAGGGGGTGTCAGTG-3，；中的一對(duì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述試劑盒用于檢測(cè)位于OTOF基因的c. 2382_2383delC突變的方法，包括以下步驟I)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA ；2)以該DNA為模板，以PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；其中，所述PCR引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第2382-2383位堿基；3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與OTOF正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 2382_2383delC突變位點(diǎn)。進(jìn)一步地,上述方法還包括下述步驟4)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定c. 2382_2383delC突變使氨基酸序列自795位發(fā)生移碼改變，并使氨基酸的編碼提前終止于第800位的氨基酸(p. L795S fsx5)。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供上述試劑盒在用于檢測(cè)感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途，將為在感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者中開展易感基因篩查提供方便確實(shí)的方法；同時(shí)可以指導(dǎo)臨床治療，并為將來利用這一突變作為靶點(diǎn)開展耳聾的基因治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
使用本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)方法為通過檢測(cè)來自于患者的待測(cè)樣本中是否存在OTOF基因c. 2382_2383delC突變，而判斷該患者感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型。其中，OTOF基因的c. 2382_2383delC堿基改變引起氨基酸編碼過程中在795位發(fā)生移碼改變(p. L795S fsx5),導(dǎo)致編碼提前終止于第800位(標(biāo)記為X800)，形成Otoferlin的截短肽鏈,喪失其功能,不成熟的表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)啟動(dòng)體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制,使變異的mRNA降解。OTOF基因突變相關(guān)的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙以常染色體隱性遺傳的方式傳遞。發(fā)明人應(yīng)用候選基因篩查的方法對(duì)17例非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙患者和100例聽力正常且無家族史的對(duì)照進(jìn)行篩查，在一例聽神經(jīng)病譜系障礙患者發(fā)現(xiàn)OTOF基因的c. 2382_2383delC (X800)突變，除此之外患者還攜帶另一個(gè)位于外顯子區(qū)域的突變OTOF基因突變與聽神經(jīng)病譜系障礙表型共分離。目前國(guó)際上報(bào)道與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的突變有80余種，尚無c. 2382_2383delC突變的報(bào)道。 圖I給出OTOF編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對(duì)照?qǐng)D，并示出突變位點(diǎn)(方框標(biāo)記處)，該突變使位于OTOF基因編碼區(qū)的第2382-2383位中的一個(gè)C堿基丟失，使得氨基酸編碼自第795位發(fā)生移碼，在第800位的氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子(p.L795S fsx5)，突變發(fā)生后基因表達(dá)產(chǎn)物由正常的1997個(gè)氨基酸變成了 799個(gè)氨基酸肽鏈。截?cái)嗟陌被犭逆渾?dòng)體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，使變異的mRNA降解。檢測(cè)該突變可用本領(lǐng)域的任何檢測(cè)點(diǎn)突變的方法來進(jìn)行，例如PCR (聚合酶鏈反應(yīng))一測(cè)序法、采用標(biāo)記的OTOF基因DNA探針雜交法或用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用PCR擴(kuò)增-直接測(cè)序法來檢測(cè)樣本，具體包括下述步驟I)采集待測(cè)個(gè)體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA ；2)以該DNA為模板，以針對(duì)OTOF基因或OTOF編碼區(qū)第2382-2383位堿基附近設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序分析，將所得到的序列與OTOF正常基因的序列進(jìn)行比較，確定是否存在OTOF突變位點(diǎn)。4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為OTOF基因突變c. 2382_2383delC導(dǎo)致的聽神經(jīng)病譜系障礙。進(jìn)一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定氨基酸是否存在自第795位的移碼至第800位的編碼終止改變(p. L795S fsx5)。在發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，通過聾病門診及資源收集網(wǎng)絡(luò)收集各種感音神經(jīng)性耳聾患者，包括聽神經(jīng)病譜系障礙患者，建立資源庫(kù)。在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，并建立門診病歷資料庫(kù)，詳細(xì)記錄患者病情、家系中的發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后，應(yīng)用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量后入庫(kù)，-20° C保存，每份DNA樣品均詳細(xì)對(duì)應(yīng)于登記的患者臨床資料。然后，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primerf設(shè)計(jì)引物，包含OTOF整個(gè)編碼區(qū)，應(yīng)用PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，正反向測(cè)序，應(yīng)用ABI公司3700DNA測(cè)序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號(hào)NC_000002. 11)比較確定OTOF突變位點(diǎn)。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定OTOF的突變位點(diǎn)。上述步驟2所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物還可以用雜交探針來檢測(cè)，所用的雜交探針可以是與正常的OTOF核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補(bǔ)序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩查是否存在已被確定的突變。 因此，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑選自測(cè)序檢測(cè)試劑、限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè)試劑、限制性長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)試劑、序列特異性引物檢測(cè)試劑和探針雜交檢測(cè)試劑。在上述方法中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的核苷酸序列設(shè)計(jì)，通常為15 30個(gè)堿基，GC含量為45 50%左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c末端特異性結(jié)合，其可以利用專門的計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer 3. 0設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物，其序列為上游引物0T0F-F-1:5，-TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3，(nt80978_nt81000)下游引物0T0F-R-1:5，-AGCTTCTGCAGGAAGITCTGG-3，(nt81488_nt81508)OTOF正常基因的標(biāo)準(zhǔn)序列可以參考例如Genbank NC_000002. 11。用于檢測(cè)OTOF基因c. 2382_2383delC突變的試劑盒中可以包含以下試劑用于擴(kuò)增樣本DNA中OTOF基因或OTOF基因編碼區(qū)第2382-2383位堿基附近的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測(cè)樣品中提取DNA的試劑；PCR反應(yīng)試劑；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序的試劑。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供一個(gè)檢測(cè)OTOF基因c. 2382_2383delC突變的試劑盒，容器內(nèi)裝有用以檢測(cè)OTOF基因c. 2382_2383delC突變的成分，與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴(kuò)增后，直接檢測(cè)樣品中OTOF基因c. 2382_2383delC突變位點(diǎn)的試劑盒，可含有擴(kuò)增引物、dNTPs、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液、或測(cè)序反應(yīng)所需試劑等的一種或多種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對(duì)0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，所述用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(I)提取待測(cè)血樣的DNA，利用上述的一對(duì)0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，將所得的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比較確定突變位點(diǎn)的存在；所述步驟還可進(jìn)一步包括(3)按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定是否存在自第795位氨基酸的移碼至第800位氨基酸的終止改變(P. L795S fsx5)。該試劑盒可簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)OTOF突變位點(diǎn)，從而應(yīng)用于感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)基因的檢測(cè)及其診斷或治療方法中。本發(fā)明也提供了 OTOF突變基因在診斷或治療人類感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的應(yīng)用。通過檢測(cè)來自患者的待測(cè)樣本中是否存在OTOF基因c. 2382_2383delC突變而判斷該患者的感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生原因及類型，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供依據(jù)；此外，在進(jìn)一步的臨床治療方面，在檢測(cè)為發(fā)生了 OTOF基因c. 2382_2383delC突變之后，可以將正?；?qū)霐y帶突變基因的細(xì)胞并在其中表達(dá)，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進(jìn)行基因治療。本發(fā)明提出了通過檢測(cè)患者中是否存在OTOF基因新的突變而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型的檢測(cè)方法，這將有利于為不同類型感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者確定個(gè)體化治療方案，避免人工耳蝸植入無效而造成的不必要的經(jīng)濟(jì)損失。下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的說明，詳細(xì)描述但不限制本發(fā)明。


圖I為OTOF基因編碼區(qū)核苷酸與氨基酸的對(duì)照(NM_194248. 2，NP_919224. I):突變位于OTOF基因第2382-2383位中一個(gè)C堿基，用方框圈起來的是突變的堿基和對(duì)應(yīng)的氨基酸，突變后的堿基序列使氨基酸自795位發(fā)生移碼(下劃線部分的氨基酸)，并提前終止于第800位氨基酸(“*”標(biāo)記處)。 圖2為本發(fā)明方法中PCR反應(yīng)過程示意圖，示出了反應(yīng)溫度和時(shí)間，其中*表示每個(gè)循環(huán)降低0.5°C。圖3為本發(fā)明方法中，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置。圖4為本發(fā)明方法中OTOF基因測(cè)序結(jié)果的局部圖，4A為雜合突變序列，4B為野生型序列，方框示突變位點(diǎn)位置。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用試驗(yàn)材料，如無特別說明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。實(shí)施例I待測(cè)血樣提取與OTOF基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增一、待測(cè)對(duì)象血樣DNA的制備I、研究對(duì)象對(duì)17例散發(fā)非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙患者和100名無家族史的聽力正常對(duì)照按照下述方法進(jìn)行OTOF基因的篩查。17例患者中，I例聽神經(jīng)病譜系障礙患者的OTOF基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者為c. 2382_2383delC突變和另外一種突變的復(fù)合雜合子。對(duì)100名聽力正常者的篩查中未發(fā)現(xiàn)c. 2382_2383delC突變者。對(duì)所有參加者詳細(xì)調(diào)查其病史以及家族史，并對(duì)其進(jìn)行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學(xué)評(píng)估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18° C 28° C)，上面鋪一層I倍體積已稀釋的血液，室溫，IOOOXg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入5ml Ep管中，5000 Xg,離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000Xg,離心10分鐘。4)將細(xì)胞懸于 2ml TE 緩沖液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，pH8. 0)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至終濃度 0.5% (100 iil)，蛋白激酶 k 100 200 ii g/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小時(shí)。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000Xg，離心10分鐘。6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。 7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2. 5倍體積的無水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 過夜。第二天11)高速離心，10000Xg，10 分鐘，4。C。12)棄上清液，加入75%乙醇2ml，高速離心10000 X g，5分鐘13)棄上清液，吹干。14)用 TE 緩沖液溶解(200 ii I TE/5ml 全血，400 TE/10ml 全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)定量。二、OTOF基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增I、引物序列上游引物0T0F-F-1:5，-TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3，(nt80978_nt81000)下游引物0T0F-R-1:5，-AGCTTCTGCAGGAAGITCTGG-3，(nt81488_nt81508)注0T0F基因序列檢索號(hào)NC_000002. 112、PCR反應(yīng)體系的建立(表I)表10T0F基因的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)與感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙相關(guān)的位于OTOF基因的c. 2382_2383delC(X800)突變的試劑盒，所述試劑盒包括 從待測(cè)樣品中提取DNA的試劑； 用于擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑； 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的試劑； 其中，所述擴(kuò)增樣本DNA的PCR反應(yīng)試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第2382-2383位堿基。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中所述PCR引物為選自下述引物中的一對(duì) 0T0F-F-1:5， -TGATCAAAACGGAGAAGTCCTAC-3，，0T0F-R-1:5’ -AGCTTCTGCAGGAAGTTCTGG-3’ ；0T0F-F-2:5， -GGAGGATGAGGCGGAACT-3，，0T0F-R-2:5’ -GGGGGTTGTGACACCTTCT-3’ ；0T0F-F-3:5， -GCTGTGGCTGCTGGTGAGA-3，,0T0F-R-3:5’ -GACAGCTCGGGCCATGAC-3’ ；0T0F-F-4:5，-CCAGCATCACCCACACTCCT-3，,0T0F-R-4:5， -CGAAGGAGGGGGTGTCAGTG-3，。
3.如權(quán)利要求I或2所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測(cè)位于OTOF基因的c.2382_2383delC突變的方法，包括以下步驟 1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織樣本，提取DNA； 2)以該DNA為模板，以PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； 其中，所述PCR引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段包含OTOF基因第2382-2383位堿基； 3)將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與OTOF正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 2382_2383delC突變位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述試劑盒，所述方法還進(jìn)一步包括下述步驟 4)按照正常閱讀框架進(jìn)行翻譯以確定c.2382_2383delC突變使氨基酸序列自795位發(fā)生移碼改變，并使氨基酸的編碼提前終止于第800位的氨基酸(p. L795S fsx5)。
5.如權(quán)利要求I所述的試劑盒在用于檢測(cè)感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測(cè)OTOF基因c.2382_2383delC突變的試劑盒，通過檢測(cè)患者中是否存在該突變基因而診斷感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙發(fā)生的原因和類型。該突變基因和檢測(cè)方法將有利于臨床上開展感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的OTOF突變篩查工作，為感音神經(jīng)性聾及聽神經(jīng)病/聽神經(jīng)病譜系障礙患者的診斷和治療提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102732615SQ20121017175
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者王秋菊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院, 王秋菊