添加Mn(Ⅱ)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法
【專利摘要】添加Mn(II)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，其方法包括將稻草秸稈磨碎過篩后，選用乙二醇作為液化劑，濃硫酸催化作用下進(jìn)行液化預(yù)處理，洗滌并抽濾后得到發(fā)酵底物；選用管囊酵母和釀酒酵母作為發(fā)酵微生物，分別取斜面培養(yǎng)的兩種酵母在YEPD液體培養(yǎng)基中活化，將培養(yǎng)基混合液用血球計(jì)數(shù)板裝載，顯微鏡計(jì)數(shù)確定酵母濃度，稀釋至適合濃度；將發(fā)酵底物、MnSO4溶液、纖維素酶和稀釋后的酵母混合液分別加入到發(fā)酵罐中，使用無菌水調(diào)節(jié)至適合固液質(zhì)量比后，在恒溫條件下進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵；最后使用分光光度法測定發(fā)酵液中乙醇濃度，計(jì)算得到乙醇最終產(chǎn)率。本發(fā)明所涉及的原料來源廣泛，操作便利；減少了纖維素酶用量從而降低了工藝成本，并且能夠在較低溫度下啟動(dòng)生化反應(yīng)，為該領(lǐng)域生產(chǎn)工藝提供了新的思路。
【專利說明】添加Mn( II )鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于新能源制備方法的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及纖維物質(zhì)制乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在全球范圍內(nèi)，世界各國都面臨著化石能源日漸枯竭、人口不斷增長、尋找新的、可再生的清潔替代能源已成為全人類目前最緊迫的任務(wù)之一。生物乙醇被認(rèn)為是未來20年內(nèi)最主要的可再生的車用替代燃料，在巴西、美國及一些歐洲國家已經(jīng)開始大規(guī)模使用。生物乙醇具有其它燃料無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如原料來源廣泛，價(jià)格低廉，可與汽油以任意比互溶，提高汽油中氧含量從而促進(jìn)汽油充分燃燒，無毒副作用且可便利的應(yīng)用在目前的發(fā)動(dòng)機(jī)上等。目前的生物乙醇主要是由玉米、小麥等淀粉質(zhì)原料和蔗糖等糖質(zhì)原料發(fā)酵而成，被稱為第一代生物乙醇。我國的生物乙醇產(chǎn)量居世界第三位，僅次于美國和巴西。盡管第一代生物乙醇在生產(chǎn)成本上與汽油具有可比性，但其產(chǎn)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今世界的需求；同時(shí)在原料供應(yīng)上存在著糧食危機(jī)的問題，這與我國的能源發(fā)展戰(zhàn)略相悖；在世界范圍內(nèi)，由于第一代生物乙醇所導(dǎo)致的玉米價(jià)格大幅上漲等市場因素，生物乙醇在液體車用燃料的份額也已經(jīng)觸頂；此外，第一代生物乙醇所形成的凈能源并不高，且使用第一代生物乙醇對減排溫室氣體的作用也非常有限。纖維素燃料乙醇的原料主要為木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木質(zhì)纖維素的原料豐富，植物每年通過光合作用可產(chǎn)生高達(dá)1550億噸纖維素類物質(zhì)，而每年用于工業(yè)過程或燃燒的纖維素僅占2%左右，具有很大利用空間。纖維素的廢棄物(包括城市固體垃圾、廢紙、甘蔗渣、木薯渣等)等。利用廣泛存在的木質(zhì)纖維素原料通過生物轉(zhuǎn)化和生物煉制的路線生產(chǎn)生物乙醇(即纖維素乙醇)，被稱為第二代生物乙醇技術(shù)。纖維素乙醇不僅能夠解決原材料不足的問題，不與糧食和動(dòng)物飼料供給相沖突，凈產(chǎn)能高(用玉米秸桿等農(nóng)作物秸桿生產(chǎn)乙醇時(shí)，生產(chǎn)玉米等糧食的能耗不計(jì)入乙醇的生產(chǎn)能耗)，還可以大大降低溫室氣體的排放量，有效緩解溫室效應(yīng)及環(huán)境污染。此外，纖維素乙醇產(chǎn).業(yè)在廣大農(nóng)業(yè)產(chǎn)區(qū)的大規(guī)模實(shí)施，對提升農(nóng)村經(jīng)濟(jì)活力和產(chǎn)業(yè)水平具有舉足輕重的作用。
[0003]目前，世界上已有數(shù)十套利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的中試裝置或示范生產(chǎn)線，它們各自采用的生產(chǎn)工藝也不盡相同，最普遍的纖維素乙醇生產(chǎn)工藝包括四個(gè)打的步驟:即木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理、原料的水解、乙醇發(fā)酵和分離提純。涉及到本發(fā)明的主要是原料水解(糖化)和乙醇發(fā)酵，故其他工藝步驟的研究不再贅述介紹。
[0004]預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料在纖維素酶的催化作用下酶解生成葡萄糖，然后由發(fā)酵微生物代謝生成乙醇。要提高發(fā)酵醒中的乙醇濃度，必須提高酶解結(jié)束時(shí)體系的葡萄糖濃度，進(jìn)而提高酶解體系的固體含量。對于該步驟目前主要分為兩種工藝，即分布糖化發(fā)酵工藝和同步糖化發(fā)酵工藝。兩種工藝方法均有各自不同的優(yōu)勢與不足。在分步糖化發(fā)酵工藝中，由于原料的糖化與葡萄糖的發(fā)酵是單獨(dú)進(jìn)行的，能夠保證纖維素酶和發(fā)酵微生物在各自的最佳溫度下進(jìn)行生化反應(yīng)，能夠提高制備效率。另一方面，該工藝至少需要兩個(gè)不同的反應(yīng)器，并且隨著工藝的進(jìn)行需要轉(zhuǎn)移反應(yīng)物，這就給操作上帶來了不便；此外，隨著固體含量以及酶解結(jié)束時(shí)葡萄糖濃度的提高，葡萄糖對纖維二糖酶的產(chǎn)物抑制作用逐漸增強(qiáng)，從而大大降低木質(zhì)纖維素原料的酶解效率。而同步糖化與發(fā)酵工藝是將纖維素的酶解與微生物的發(fā)酵兩個(gè)有先后順序的工段整合成一個(gè)同步的過程，即在同一個(gè)反應(yīng)器中，木質(zhì)纖維素原料在纖維素酶的催化下酶解生成葡萄糖的同時(shí)，立即被發(fā)酵微生物直接轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物乙醇；盡管產(chǎn)物乙醇對纖維二糖酶也會(huì)產(chǎn)生抑制作用，但比葡萄糖產(chǎn)生的產(chǎn)物抑制作用要小的多。這種工藝是目前最常用的木質(zhì)纖維素原料加工工藝，它不僅有效解除了葡萄糖對纖維二糖酶的抑制，而且提高了反應(yīng)器的利用效率和整個(gè)過程的效率。但是，由于纖維素酶的作用溫度一般為45?55°C，發(fā)酵微生物的最適生長和發(fā)酵溫度為30?37°C，因此，同步糖化與發(fā)酵時(shí)采用的溫度是一個(gè)折中的溫度:35?37°C。在此溫度下，纖維素酶的催化活性會(huì)有所降低。
[0005]根據(jù)纖維素乙醇現(xiàn)有的制備方法，如《可再生能源》2012年3月第30卷第3期中的“雙菌比較優(yōu)化稻草“液化”發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究”一文，利用稻草秸桿液化預(yù)處理的產(chǎn)物作為發(fā)酵底物，將底物進(jìn)行96h的酶解糖化后，分別采用釀酒酵母和休哈塔假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，對影響發(fā)酵階段的各因素進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳菌種完成秸桿到乙醇的轉(zhuǎn)化，研究表明釀酒酵母更適合做為發(fā)酵菌種，并且在30°C (條件下發(fā)酵36h，乙醇產(chǎn)率達(dá)到0.27g/g (發(fā)酵底物)。該方法主要有以下不足之處:(I)采用分步糖化發(fā)酵法制備乙醇，增加了工藝步驟(如酶解液的過濾和脫色)，操作較為復(fù)雜，并且乙醇產(chǎn)率不夠理想。(2)使用單一酵母進(jìn)行發(fā)酵，酶解產(chǎn)物得不到充分利用，也是造成乙醇產(chǎn)率較低的原因之一。(3)工藝周期較長，增加了生產(chǎn)能耗的同時(shí)也增大了成本。此外，申請?zhí)枮?01210597201.5，名稱為《一種提高稻草制燃料乙醇產(chǎn)率的新方法》一文中，公開的方法是纖維素物質(zhì)添加二價(jià)Fe鹽進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵制備燃料乙醇，其乙醇產(chǎn)率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有纖維素乙醇制備方法的不足，提供一種添加微量金屬鹽促進(jìn)同時(shí)糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具有操作工藝簡單、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，降低了反應(yīng)所需的溫度以及纖維素酶用量，從而達(dá)到降低制備成本等特點(diǎn)。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案是:添加Mn(II)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，以當(dāng)?shù)禺?dāng)年產(chǎn)的稻草秸桿為原料，先經(jīng)過液化纖維素方法預(yù)處理，在糖化發(fā)酵步驟時(shí)通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝條件。具體的方法步驟如下:
[0008](I)液化預(yù)處理
[0009]將稻草秸桿經(jīng)人工剪切、球磨機(jī)磨碎并過80目篩后，烘干至恒重；稱取15?25g干燥稻草連同110?130g乙二醇加入三口燒瓶中，投入磁力轉(zhuǎn)子；安裝好蒸餾裝置，將三口燒瓶中間口與冷凝管相接，放入磁力水浴攪拌器，設(shè)定反應(yīng)溫度為85?95°C、攪拌速率90?110r/min,開始攪拌,燒瓶的側(cè)邊的一個(gè)口加帶孔橡皮塞,將溫度計(jì)通過小孔插入到反應(yīng)混合物中，最后一個(gè)口加無孔橡皮塞作為進(jìn)料口 ；預(yù)熱5?15min后拔出進(jìn)料口橡皮塞，加入20?30mmol濃硫酸后加塞，待反應(yīng)液達(dá)到設(shè)定溫度后恒溫?cái)埾?0?80min ;反應(yīng)結(jié)束后將燒瓶與冷凝管脫離，移出攪拌器，往燒瓶中加入熱水稀釋變稠的反應(yīng)混合物，打開真空抽濾機(jī)，將反應(yīng)物傾入到抽濾機(jī)漏斗中，抽濾后加入15?25mL甲醇進(jìn)行二次抽濾，然后加熱水抽濾兩次，每次用水15?25mL，得到濾餅，烘干后得到發(fā)酵底物。[0010](2)酵母的活化與稀釋
[0011]稱取葡萄糖10?30g、蛋白胨15?25g、酵母粉5?15g,加入蒸懼水0.8?1.2L,攪拌均勻后在110?120°C濕熱滅菌15?25min,配制成液體培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)選取的產(chǎn)乙醇酵母為管囊酵母(1770)和釀酒酵母(1001)，分別取斜面培養(yǎng)的兩種酵母在液體培養(yǎng)基中活化(30°C，16?20h)，用血球計(jì)數(shù)板裝載攪拌后的培養(yǎng)液(160r.mirT1，2h)，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，確定培養(yǎng)基中的酵母菌濃度，并用無菌水調(diào)節(jié)至IO8Cell.mL—1數(shù)量級。
[0012](3)添加Mn鹽同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇
[0013]稱取第(I)步獲得的發(fā)酵底物lg，加入到發(fā)酵罐中，然后分別加入3?5ml濃度為2g/L的MnSO4，再加入適量第(2)步活化后的管囊酵母、釀酒酵母培養(yǎng)液，兩種酵母的培養(yǎng)液投加量共計(jì)1.5?4.5mL (接種量達(dá)到10%?30%，管囊酵母與釀酒酵母各自接種比例為Ig:2g?Ig:4g),纖維素酶用量為5?15U/g (底物)，最后加入適量無菌水調(diào)節(jié),使發(fā)酵容器內(nèi)固液質(zhì)量比為Ig:15g，用保鮮膜封住瓶口，橡皮筋扎緊后放入設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定在28?36°C，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為60?84h。
[0014](4)發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的測定
[0015]第(3)步的發(fā)酵液取ImL于50mL比色管中，加入0.05mol/L重鉻酸鉀溶液15mL，定容后于600nm波長下用722型分光光度計(jì)測定吸光度，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算乙醇濃度，得出乙醇產(chǎn)率，為0.298?0.414g/g (發(fā)酵底物)。
[0016]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，主要有以下效果:
[0017](I)本發(fā)明有效增強(qiáng)了稻草同時(shí)糖化發(fā)酵過程中纖維素酶和酵母的活性，并總體上提聞了乙醇的最終廣率。
.[0018](2)本發(fā)明選擇的方法工藝步驟簡單，所用設(shè)備少，生產(chǎn)成本低，并且在降低纖維素酶用量的情況下提高了乙醇產(chǎn)率，為傳統(tǒng)纖維素乙醇生產(chǎn)降低了成本。
[0019](3)本發(fā)明能夠在較低溫度下啟動(dòng)生化反應(yīng)，降低了反應(yīng)最佳溫度，減少了能耗，符合綠色生產(chǎn)的理念。
[0020](4)本發(fā)明為纖維素乙醇制備工藝提供了前所未有的新思路，如采用不同的工藝(如分步糖化發(fā)酵法)，仍然可以考慮添加微量元素提高活性，達(dá)到理想的乙醇產(chǎn)率。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]添加Mn(II)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，其具體步驟如下:
[0024](I)稻草秸桿預(yù)處理
[0025]將稻草秸桿經(jīng)人工剪切、球磨機(jī)磨碎并過80目篩后，烘干至恒重；稱取20g干燥稻草、120g乙二醇加入三口燒瓶中，投入磁力轉(zhuǎn)子；安裝好蒸餾裝置，將三口燒瓶中間口與冷凝管相接，放入磁力水浴攪拌器，設(shè)定反應(yīng)溫度為90°C、攪拌速率lOOr/min，開始攪拌，燒瓶的側(cè)邊的一個(gè)口加帶孔橡皮塞，將溫度計(jì)通過小孔插入到反應(yīng)混合物中，最后一個(gè)口加無孔橡皮塞作為進(jìn)料口 ；預(yù)熱IOmin后拔出進(jìn)料口橡皮塞，加入25mmol濃硫酸后加塞，待反應(yīng)液達(dá)到90°C后恒溫?cái)嚢?0min ;反應(yīng)結(jié)束后將燒瓶與冷凝管脫離，移出攪拌器，往燒瓶中加入熱水稀釋變稠的反應(yīng)混合物，打開真空抽濾機(jī)，將反應(yīng)物傾入到抽濾機(jī)漏斗中，抽濾后加入20mL甲醇進(jìn)行二次抽濾，最后用熱水洗滌抽濾兩次，每次用水20mL，得到濾餅，烘干后得到發(fā)酵底物。
[0026](2)酵母的活化與稀釋
[0027]取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g、蒸懼水1L, 115°C濕熱滅菌20min,配制成液體培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)選取的產(chǎn)乙醇酵母為管囊酵母(1770)和釀酒酵母(1001)，分別取斜面培養(yǎng)的兩種酵母在液體培養(yǎng)基中活化(30°C，18h)，用血球計(jì)數(shù)板裝載攪拌后的培養(yǎng)液(160r.mirT1, 2h),置于顯微鏡下計(jì)數(shù),確定培養(yǎng)基中的酵母菌濃度，并用無菌水調(diào)節(jié)至108cell.mL_1 數(shù)量級。
[0028](3)添加Mn鹽同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇
[0029]將第(I)步獲得的發(fā)酵底物稱取lg，加入到發(fā)酵罐中，然后加入4ml濃度為2g/L的MnSO4溶液，管囊酵母溶液0.75ml，釀酒酵母溶液2.25ml (即接種量為20%，管囊酵母與釀酒酵母接種比例為Ig:3g)，纖維素酶用量為10U/g (底物)，最后加入適量無菌水調(diào)節(jié)，使發(fā)酵容器內(nèi)固液質(zhì)量比為Ig:15g，用保鮮膜封住瓶口，橡皮筋扎緊后放入設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定在32°C，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為72h。
[0030](4)發(fā)酵液中乙醇濃度的測定
[0031]第(3)步的發(fā)酵液取ImL于50mL比色管中，加入0.05mol/L重鉻酸鉀溶液15mL，定容后于600nm波長下用722型分光光度計(jì)測定吸光度，計(jì)算乙醇濃度，得出乙醇產(chǎn)率為
0.414g/g (發(fā)酵底物)。
[0032]實(shí)施例2
[0033]添加Mn(II)鹽 促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，其具體步驟如下:
[0034]第(I)步中:將稻草秸桿磨碎并過80目篩，干燥稻草質(zhì)量15g，乙二醇質(zhì)量110g，設(shè)定反應(yīng)溫度為85°C,攪拌速率90r/min,預(yù)熱5min加入20mmol濃硫酸,恒溫?cái)嚢?0min,將反應(yīng)物抽濾后用甲醇15mL進(jìn)行二次抽濾，用熱水洗滌抽濾兩次，每次15mL，烘干后得到發(fā)酵底物。
[0035]第⑵步中:葡萄糖10g、蛋白胨15g、酵母粉5g、蒸餾水0.8L，110°C濕熱滅菌15min，分別取斜面培養(yǎng)的兩種酵母在液體培養(yǎng)基中活化(30°C，16h)，用血球計(jì)數(shù)板裝載攪拌后的培養(yǎng)液(160r.min-1, 2h),無菌水調(diào)節(jié)至IO8Cell.ml/1數(shù)量級。
[0036]第(3)步中:發(fā)酵底物稱取lg，加入到發(fā)酵罐中，然后加入3mL濃度為2g/L的FeSO4溶液，管囊酵母培養(yǎng)液0.5mL、釀酒酵母培養(yǎng)液lmL(即接種量為10%，管囊酵母與釀酒酵母接種比例為Ig:2g)，纖維素酶用量為5U/g(底物)，最后加入適量無菌水調(diào)節(jié)，使發(fā)酵容器內(nèi)固液質(zhì)量比為Ig:15g，密封住瓶口后放入設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定在28°C，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為60h。
[0037]第⑷步中:取第(3)步的發(fā)酵液ImL于50mL比色管中，加入0.05mol/L重鉻酸鉀溶液15mL，定容后于600nm波長下用722型分光光度計(jì)測定吸光度，得出乙醇產(chǎn)率為
0.298g/g (發(fā)酵底物)。
[0038]實(shí)施例3
[0039]添加Mn(II)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，其具體步驟如下:
[0040]第(I)步中:將稻草秸桿磨碎并過80目篩，干燥稻草質(zhì)量25g，乙二醇質(zhì)量130g,設(shè)定反應(yīng)溫度為95°C,攪拌速率110r/min,預(yù)熱15min加入30mmol濃硫酸,恒溫?cái)嚢?0min，將反應(yīng)物抽濾后加入25mL甲醇進(jìn)行二次抽濾，最后用熱水洗滌抽濾兩次，每次25mL，烘干后得到發(fā)酵底物。
[0041]第(2)步中:葡萄糖30g、蛋白胨25g、酵母粉15g、蒸餾水L2L，12(TC濕熱滅菌25min，分別取斜面培養(yǎng)的兩種酵母在液體培養(yǎng)基中活化(30°C，20h)，用血球計(jì)數(shù)板裝載攪拌后的培養(yǎng)液(160r.min-1, 2h),無菌水調(diào)節(jié)至IO8Cell.ml/1數(shù)量級。
[0042]第(3)步中:發(fā)酵底物稱取lg，加入到發(fā)酵罐中，然后加入5mL濃度為2g/L的FeSO4溶液，管囊酵母培養(yǎng)液0.9mL,釀酒酵母培養(yǎng)液3.6mL (即接種量為30 %，管囊酵母與釀酒酵母接種比例為Ig:4g)，纖維素酶用量為15U/g (底物)，最后加入適量無菌水調(diào)節(jié)，使發(fā)酵容器內(nèi)固液質(zhì)量比為Ig:15g，密封住瓶口后放入設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定在36°C，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為84h。
[0043]第⑷步中:取第(3)步的發(fā)酵液ImL于50mL比色管中，加入0.05mol/L重鉻酸鉀溶液15mL，定容后于600nm波長下用722型分光光度計(jì)測定吸光度，得出乙醇產(chǎn)率為
0.365g/g (發(fā)酵底物)。`
【權(quán)利要求】
1.添加Mn(II)鹽促進(jìn)稻草同時(shí)糖化發(fā)酵制備乙醇的方法，其特征在于添加二價(jià)Mn鹽進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵，它的操作步驟為:稱取發(fā)酵底物lg，加入到發(fā)酵罐中，然后加入3?5mL濃度為2g/L的MnSO4溶液，加入適量活化后的管囊酵母、釀酒酵母培養(yǎng)液，兩種培養(yǎng)液投加量共計(jì)1.5?4.5mL，使酵母接種量達(dá)到10%?30%，管囊酵母與釀酒酵母各自接種比例為Ig:2g?Ig:4g,纖維素酶用量為5?15U/g,最后加入適量無菌水調(diào)節(jié),使發(fā)酵容器內(nèi)固液質(zhì)量比為Ig:15g，密封住瓶口后放入設(shè)定好溫度的培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定在28?36°C，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間 為60?84h，最后得到含乙醇的發(fā)酵液。
【文檔編號(hào)】C12P7/10GK103436588SQ201310400158
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】徐龍君, 畢智明, 謝太平, 劉成倫, 王金成 申請人:重慶大學(xué)