Stmn2基因作為綿羊免疫性狀的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于綿羊分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種STMN2基因作為綿羊免疫 性狀的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的分子標(biāo)記克隆自STMN2基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 在養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中，疾病嚴(yán)重威脅著羊只的健康并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管通過(guò) 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和應(yīng)用藥物疫苗等措施可預(yù)防疾病，但未能十分有效控制傳染病的流行，同 時(shí)大量藥物的使用會(huì)使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，給畜產(chǎn)品的安全造成隱患。
[0003] 長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，從抗病力的遺傳基礎(chǔ)研究出發(fā)，篩選抗性基因，從分子水平開(kāi)展抗病育 種，從遺傳上提高羊只對(duì)病原的抗性，增強(qiáng)免疫力是從根本上解決這一問(wèn)題的重要途徑。抗 病育種潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益以及某些疾病可作為研究人類疾病動(dòng)物模型的誘人前景，正有 力地推動(dòng)著這項(xiàng)工作的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，抗病育 種在綿羊的育種中已經(jīng)開(kāi)始發(fā)揮重要作用。
[0004] 在抗病育種中，抗病基因的尋找是關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)外已鑒定出的主要抗病候選基 因有以下幾個(gè)：
[0005] (1)天然抗性巨·結(jié)合蛋白 I (Natural resistance - associated macrophage protein I，Nrampl)，Nramp是一個(gè)基因家族，是目前研究較多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3個(gè)成員，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有Nrampl和Nramp2。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Nrampl基因與抗病力的相 關(guān)性進(jìn)行了大量的研究，把Nrampl基因作為功能基因研究其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物抗病性狀的報(bào)道 也較多，但主要集中在人類、小鼠、豬和家禽上（陳冬金，謝喜平，陳巖鋒，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研究進(jìn)展.畜牧與飼料科學(xué)，2012, 33(7) : 79 - 81.)。綿羊的Nrampl基 因定位在 1 號(hào)染色體 2q41 - q42 的區(qū)域（Pitel F. E. P. Cribiu，M. Yerle，et al. Regional localization of the ovine NRAMP gene to chromosome 2q41 - q42 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet，1995, 70 (I-2) :116 ~118·)，山羊的 Nrampl 基因 定位于 2 號(hào)常染色體上長(zhǎng)臂 ql2. 2 (Vacca G. Μ· M. Pazzola，C. Pisano，et al. Chromosomal localisation and genetic variation of the SLClIAl gene in goats(Capra hircus). Vet J，2011. 190(1) :60~65.)。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊Nrampl基因多態(tài)性與傷寒沙門氏菌易感 性和抗性有關(guān)（姚菊霞，王光華，馬利青.羊主要抗病候選基因的研究進(jìn)展.青海畜牧獸醫(yī) 雜志，2014, 44(5) :40~43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝桿菌、沙門氏菌等多種胞內(nèi)寄生病 原菌的侵染而發(fā)揮重要的免疫功能，對(duì)畜禽機(jī)體抗病力影響較大（吳宏梅等，NRAMPl基因 研究進(jìn)展及其在抗病育種中的應(yīng)用.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005,32(4) :26~28.)。
[0006] (2)主要組織相容性復(fù)合物（MHC)是由一群緊密連鎖的基因群組成的一個(gè)定位于 動(dòng)物某對(duì)染色體的特定區(qū)域，與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的多基因家族，在宿主的免疫 反應(yīng)中對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的控制和清除有重要作用。目前，已證實(shí)主要組織相容性復(fù)合 物與人類和家畜的多種疾病存在著密切關(guān)系。因此，近年來(lái)對(duì)MHC的研究成為家畜抗病育 種研究中的前沿部分（孫東曉，張沅.反芻家畜主組織相容性復(fù)合物的研究進(jìn)展.中國(guó)畜 牧雜志，2002,38(5) :46~47.h綿羊的MHC稱為OLA(綿羊白細(xì)胞抗原），位于第20號(hào)染 色體上，具有高度的多態(tài)性和連鎖不平衡性。根據(jù)MHC抗原結(jié)構(gòu)和功能的不同，可將MHC分 為class I型class II型和class III型D -般認(rèn)為綿羊MHC class II的多態(tài)性和遺傳性是 為了保護(hù)機(jī)體組織對(duì)抗疾病的感染。在這個(gè)基因區(qū)域有DQ和DR兩個(gè)亞區(qū)，OLA II類分子 的DQ和DR亞區(qū)的DRB和DQB兩個(gè)基因位點(diǎn)所編碼的MHC在抗原免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著最主要 的作用；其第2個(gè)外顯子編碼抗原的功能區(qū)（抗原結(jié)合區(qū)）具有豐富的多態(tài)性，它組成II類 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC與生產(chǎn)性能具有密切的聯(lián)系，但需要進(jìn)一步研究才 能應(yīng)用于家畜的遺傳標(biāo)記。
[0007] 此外，其它有研究的與抗病力有關(guān)的基因是TLR(Toll - like receptor，Toll 樣受體）MX1 (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒（流感）抗性因子 I)、 ILl(Interleukins 1，白細(xì)胞介素 I)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ)等基因 D
[0008] STMN2 (stathmin - like 2)蛋白，又稱SCG10,是一種神經(jīng)特異性蛋白，屬于 stathmin家族，這個(gè)家族成員包括stathmin，STMN1，STMN2, SCLIP，RB3。在胚胎期神 經(jīng)元發(fā)生的過(guò)程中生長(zhǎng)錐部位表達(dá)含量很高（Grenningloh G，Soehrman S，Bondallaz P，et al. Role of the microtubule destabilizing proteins SCGlO and stathmin in neuronal growth. J Neurobiol，2004, 58(1) :60 ~69)，出生之后突然降低，但在成熟大 腦的神經(jīng)元突觸重塑部位仍有表達(dá)，這提示STMN2與神經(jīng)結(jié)構(gòu)重塑有著某種聯(lián)系（Mori N j Morii H. SCGlO - related neuronal growth - associated proteins in neural dev elopment, plasticity, degeneration,and aging. J Neurosci Res，2002,70 (3):264 ~ 273)，Riedrer等研究表明STMN2的過(guò)度表達(dá)能促進(jìn)神經(jīng)的延伸（Riedrer Beat M，Pellier Yef Ronique，Antonsson Bruno,et al. Regulation of microtubule dynamics by the neuronal growth - associated protein SCG10. Neurobiology Proc Natl Acad Sci USA，1997, 94⑵：741~745)，從而導(dǎo)致突觸的重塑，影響神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性（Hiroshi Morii，Tomiko YamadajItsuko Nakanoj et al. Site -specific phosphorylation of SCGlO in neuronal plasticity:Role of Ser73phosphorylation by N-methyld-aspartic acid receptor activation in rat hippocampus. Neuroscience Letters，2006,396 (3):241 ~ 246)。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物癲癇模型中STMN2的表達(dá)增高（Mori N，Morii H. SCGlO-related neuronal growth - associated proteins in neural development, plasticity, degen eration，and aging. J Neurosci Res，2002, 70 (3) : 264 ~273)，這表明其可能參與了難 治性癲癇的形成此外，有研究表明STMN2的激活與MPK(Mitogen actived protein kinase, MAPK)有關(guān)(Antonsson Bj Lutjens R，Di Paolo G，et al.Purification, char acterization，and in vitro phosphorylation of the neuron - specificmembrane -associated protein SCGlO.Protein Exp Purif，1997,9(3) :363 ~371)，而 MPK 信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又廣泛參與了神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的病理過(guò)程。另外，最新研究報(bào)道指出， STMN2基因還參與腫瘤的發(fā)生等病理過(guò)程（Guo Q，Su N，Zhang J，et al. PAMkinase-mediated SCGIOphosphorylation involved in gastric cancer metastasis. Oncogene, 2014, 33 (25) : 3277 - 87) 〇
[0009] 通過(guò)以上資料我們可以得出STMN2基因參與動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等的發(fā)生 和免疫調(diào)控。尋找基因中的變異位點(diǎn)，通過(guò)與性狀間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)基因與性狀間的關(guān)系 是研究基因功能的一個(gè)重要手段，也是進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)。為此開(kāi)展了綿羊STMN2 基因完整cDNA序列的克隆和SNP篩查、檢測(cè)及與免疫性狀關(guān)聯(lián)分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克隆綿羊STMN2基因的完整CDNA序列，尋找STMN2基因的突變 位點(diǎn)以及基因的多態(tài)性的檢測(cè)方法，提供適用于綿羊免疫性狀的分子標(biāo)記及在關(guān)聯(lián)分析中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] 從綿羊STMN2基因片段中克隆得到一種作為綿羊標(biāo)記輔助選擇的與免疫性狀相 關(guān)的分子標(biāo)記，它的完整cDNA序列如序列表SEQ ID NO :1和圖1所示，它的部分DNA序列 如序列表SEQ ID NO: 2和圖2所示。在SEQ ID NO :2所示序列的第215位堿基處有一個(gè)G/ A堿基突變，該突變位于第4外顯子內(nèi)，該突變導(dǎo)致Tfi I - RFLP多態(tài)性。
[0013] 申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了一對(duì)克隆綿羊STMN2基因完整cDNA的引物序列，該引物擴(kuò)增的部分 cDNA序列如SEQ ID NO :1所述。同時(shí)申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了一對(duì)包含第4外顯子的用于擴(kuò)增綿羊 STMN2基因組序列的引物，該引物擴(kuò)增的序列如SEQ ID NO : 2所述。
[0014] 申請(qǐng)人提供了一種篩選上述分子標(biāo)記的方法，所述的方法包括以下步驟：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、脾臟、腎臟等組織總RNA為模板，進(jìn)行RT - PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純 化和克隆測(cè)序，進(jìn)行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO :1所述cDNA序列；從綿羊血液基因 組中提取DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、克隆和測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列。
[0016] 應(yīng)用常規(guī)的PCR -RFLP的方法對(duì)序列表SEQ ID NO :2的第215位堿基突變進(jìn)行了 檢測(cè)，并初步進(jìn)行其基因型與綿羊免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為綿羊的分子標(biāo)記輔 助選擇提供了 一個(gè)新的分子標(biāo)記。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的綿羊免疫性狀相關(guān)基因 STMN2的完整cDNA 序列。序列長(zhǎng)度為769bp。
[0018] 序列表SEQ ID NO :2是本發(fā)明克隆的綿羊免疫性狀相關(guān)基因