一種快速鑒定雙歧桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及雙歧桿菌，尤其是一種快速鑒定雙歧桿菌的分 子生物學(xué)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙歧桿菌是一類厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，按照伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)的分類，雙歧桿 菌屬于放線菌目放線菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌為外觀變化很大的桿狀體，菌株的一般特 征是呈分叉的Y型或V型，以及棍棒狀或者匙狀類型。1899年，法國(guó)巴斯德研究院人員首先 從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離出了第一株雙歧桿菌，之后越來(lái)越多的科學(xué)家及研究者們開 始了對(duì)雙歧桿菌的研究工作。并且實(shí)踐表明，雙歧桿菌是存在于人和其它動(dòng)物腸道內(nèi)的一 類有益菌，人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，在嬰幼兒時(shí)期含量最為豐富，隨著年齡的增長(zhǎng)，比 例逐漸縮小。定殖于人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌，在抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)腸 道蠕動(dòng)、改善便秘、緩解由抗生素引起的腹瀉、提高宿主免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用。
[0003] 隨著對(duì)雙歧桿菌研究的深入，以及對(duì)雙歧桿菌類產(chǎn)品的開發(fā)，如何快速獲得具有 潛在益生特性的雙歧桿菌菌株成為亟待解決的問題。而對(duì)于雙歧桿菌的鑒定，是其中不可 或缺的重要部分。目前，對(duì)于雙歧桿菌的菌種鑒定，常用的方法主要有兩種：一是基于形態(tài) 學(xué)和生理生化特性（主要是糖代謝不同）進(jìn)行的傳統(tǒng)鑒定方法；二是基于分子生物學(xué)手段， 對(duì)菌株的基因進(jìn)行測(cè)定，其中最常用的是PCR擴(kuò)增雙歧桿菌的16S rDNA片段，將雙歧桿菌 鑒定到種的水平。然而，這兩種方法在一定程度上都存在某種不可避免的缺陷性。傳統(tǒng)的 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法，由于雙歧桿菌的形態(tài)多變性以及代謝底物的細(xì)微差別，很難 將雙歧桿菌鑒定到種的水平。并且存在工作量大，費(fèi)事費(fèi)力的缺點(diǎn)。而采用16S rDNA片段 進(jìn)行測(cè)序的方法，雖然可以準(zhǔn)確鑒定到種，但存在程序繁瑣的缺點(diǎn)。
[0004] 變性梯度凝膠電泳（DGGE)的工作原理是，根據(jù)DNA的解鏈特性，不同堿基組成的 雙螺旋DNA發(fā)生變性所需變性劑的濃度不同?；旌系碾p鏈DNA在進(jìn)行變性劑濃度呈線性變 化的電泳時(shí)，相同堿基組成的DNA在同一變性劑濃度的位置發(fā)生解鏈，不同堿基組成的DNA 在不同變性劑濃度的位置發(fā)生解鏈，由于迀移速率的不同而停留在凝膠中的不同位置，從 而將混合的DNA片段分離開來(lái)。此技術(shù)可以將僅有一對(duì)堿基差別的DNA片段分離開來(lái)。而 雙歧桿菌的16S rDNA的V3區(qū)為高度可變區(qū)，理論上可以通過DGGE手段將不同種的雙歧桿 菌鑒定出來(lái)。
[0005] 通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下一篇與本發(fā)明專利申請(qǐng)相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)：
[0006] -種鑒定雙歧桿菌的方法（CN102108400A)，涉及一種鑒定雙歧桿菌的方法，具體 涉及一種新的鑒定雙歧桿菌的分子生物學(xué)方法。該方法通過對(duì)雙歧桿菌16S rDNA上兩段 目標(biāo)基因片段及丙酮酸激酶編碼基因上一段目標(biāo)基因片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，可以將 雙歧桿菌菌株鑒定到種的水平。本發(fā)明將為雙歧桿菌鑒定提供一種更加準(zhǔn)確、更易于操作 的實(shí)用方法，有利于雙歧桿菌菌株的分類及研究工作。
[0007] 通過對(duì)比，本發(fā)明專利申請(qǐng)與上述專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種快速、準(zhǔn)確地鑒定雙歧桿 菌的方法，該方法可以將雙歧桿菌鑒定到種或亞種的水平，為雙歧桿菌的分離鑒定及進(jìn)一 步研究提供一種可靠手段。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0010] -種快速鑒定雙歧桿菌的方法，采用PCR-DGGE的方法，將未知菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的 條帶進(jìn)行比對(duì)，將未知雙歧桿菌鑒定到種或亞種的水平。
[0011] 而且，步驟如下：
[0012] ⑴提取已知基因序列的不同種雙歧桿菌的基因組；
[0013] ⑵采用合適引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增單菌的16S rDNA的V3區(qū)；
[0014] ⑶采用變性梯度凝膠電泳方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；
[0015] ⑷將未知的雙歧桿菌條帶與標(biāo)準(zhǔn)條帶進(jìn)行比對(duì)，確定未知雙歧桿菌的種類。
[0016] 而且，所述步驟⑴中已知基因序列的雙歧桿菌為短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動(dòng)物 雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種。
[0017] 而且，所述步驟⑴中提取雙歧桿菌基因組的方法是酚-氯仿抽提法。
[0018] 而且，所述步驟⑵中引物對(duì)為338f-GC和518r。
[0019] 而且，所述引物338f-GC的堿基序列為5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGGAGG CAG CAG-3' ；引物 518r 的堿基序列為 5' -ATTACC GCG GCT GCT GG-3'。
[0020] 而且，所述步驟⑵中PCR的擴(kuò)增條件為：95°C，5min ;94°(：，458,65°(：，458，每個(gè)循 環(huán)降 0· 5°C，72°C，30s，20 個(gè)循環(huán)；94°C，50s，55°C 55s，72°C 30s，15 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。
[0021] 而且，所述步驟⑶中變性梯度凝膠電泳方法所用的膠為30%~70%的聚丙烯酰 胺。
[0022] 而且，所述步驟⑶中變性梯度凝膠電泳方法的電泳條件是：120V，30min ;80V， 12h ;緩沖液為I XTAE ;溫度為60°C。
[0023] 而且，具體步驟如下：
[0024](一）培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
[0025] 培養(yǎng)基：MRS+5%。半胱氨酸，121°C滅菌15min ;培養(yǎng)條件：37°C，于厭氧工作站培養(yǎng) 24h，得菌懸液；
[0026] (二）基因組提取
[0027] ⑴取培養(yǎng)過夜的菌懸液ImL于I. 5mL離心管，1000 Orpm離心2min，棄上清得菌體；
[0028] ⑵用ImL無(wú)菌水吹打洗菌體后，1000 Orpm離心2min，棄上清得菌體；
[0029] ⑶向菌體中加入200uL SDS裂解液，80°C水浴30min，得菌體裂解液；
[0030] ⑷加入酚-氯仿溶液200uL于菌體裂解液中，其中酚-氯仿溶液的組成成分及體 積比為：Tris飽和酸：氯仿：異戊醇=25 :24 :1，顛倒混勾后，12000rpm離心5-10min，取上 清 200uL ;
[0031] (5)加入400uL冰乙醇或冰異丙醇于200uL上清中，-20°C靜置lh，12000rpm離心 5-10min，棄上清；
[0032] (6)加入500uL體積百分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇重懸沉淀，12000rpm離心l_3min，棄上 清；
[0033] (7) 60°C烘箱烘干，或者自然晾干，得沉淀；
[0034] (8) 50uL CldH2O 重溶沉淀，以備 PCR ;
[0035] (三）1防rDNAV3區(qū)引物
[0036] 上游引物 338f-GC，堿基序列：SEQl (5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGGAGG CAG CAG-3' ）；
[0037] 下游引物 518r，堿基序列：SEQ2(5' -ATTACC GCG GCT GCT GG-3'）；
[0038] (四）PCR 反應(yīng)體系 50 μ L :
[0039] IOXTaq buffer, 5 μ L ；dNTP, 5 μ L ；338f-GC 20 μ Μ, 0. 5 μ L ；518r 20 μ Μ, 0· 5 μ L ;Taq 酶，0· 5 μ L ;DNA 模板，0· 5 μ L ;ddH20, 38 μ L ;
[0040] (五）PCR反應(yīng)程序
[0041] 95°C，5min ;94°C，45s，65°C，45s 每個(gè)循環(huán)降 0· 5°C，72°C，30s，20 個(gè)循環(huán)；94°C， 50s，55°C 55s，72°C 30s 15 個(gè)循環(huán)；72°C，保持 IOmin ;
[0042] (六）瓊脂糖電泳
[0043] (1)配制質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1 %的瓊脂糖凝膠：每大膠40mL，稱取0. 4g瓊脂糖置于錐形瓶 中，加入40mL的0. 5XTBE，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，待溶液冷至不燙手， 加入4 yL 10000X的核酸染料，混勻后倒入模具中，凝固30min以上；
[0044] ⑵將基因組DNA樣品/PCR產(chǎn)物樣品與10XLoading buffer混合后，加入樣品槽 中；
[0045] ⑶接通電源，120V，跑30min ;
[0046] ⑷電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀拍照；
[0047](七）變性梯度凝膠電泳的操作
[0048] ⑴溶液配制
[0049] ① 50XTAE 電泳緩沖液：tris 242g，Na2EDTA · 2Η2037· 2g，加 800mL 去離子水，充 分混勻，加57. Im