水稻斑點葉性狀控制基因spl29在衰老和抗病上的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻斑點葉性狀控制基因SPL29在衰老和抗病上的用途。本發(fā)明通過對水稻斑點葉突變體（spl29）的研究克隆了控制其性狀的基因。突變基因spl29的編碼核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，其所對應(yīng)的野生型控制基因SPL29的編碼核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。水稻斑點葉突變體表現(xiàn)出斑點葉、加速的葉片衰老以及增強的植株抗病能力，表明SPL29基因在控制衰老和抗病性方面發(fā)揮著重要的作用。本發(fā)明的性狀控制基因為闡明衰老的機制和創(chuàng)造高抗病性作物方面提供了新的理論依據(jù)，特別是可利用基因工程方法調(diào)控植株的生命和抗病性，在衰老與抗病的理論和應(yīng)用研究上具有重要的潛在利用價值。
【專利說明】水稻斑點葉性狀控制基因SPL29在衰老和抗病上的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻斑點葉性狀控制基因SPL29(SPOTTED LEAF29)在衰老和抗病上的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]斑點葉突變體，也常被稱作類病斑突變體，其表現(xiàn)為錯誤地調(diào)節(jié)細胞死亡。通過克隆斑點葉突變體的基因，使得調(diào)節(jié)細胞死亡程序的基因被大量發(fā)現(xiàn)，這對解析衰老信號途徑、防御反應(yīng)途徑以及它們的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義(Lorrain S，VaiIIeauF，Balague C，Roby D.2003.Lesion mimic mutants:keys for deciphering cell deathand defense pathways in plants.Trends Plant Sci8，263-271.)。如要依靠不同的脅迫處理研究植株反應(yīng)，來達到這些研究目的，通常是不太可能的。
[0003]葉片衰老是一個復(fù)雜的生物學過程，通常發(fā)生在葉片發(fā)育的最后階段，通常受年齡發(fā)育以及大量內(nèi)源、外源因素的影響和調(diào)控(Balazadeh S，Kwasniewski Mj CaldanaC，Mehrnia Mj Zanor MIj Xue GP，Mueller-Roeber B.2011.0RSlj an H202-responsiveNAC transcription factor,controls senescence in Arabidopsis thaliana.MolPlant4，346-360;Lim PO，Nam HG.2005.The molecular and genetic control of leafsenescence and longevity in Arabidopsis.Curr Top Dev Biol67，49-83.)。雖然葉片衰老相關(guān)的問題被大量研究，但是目前人們對于葉片衰老的科學認識仍然不是十分清晰。因此對葉片衰老關(guān)鍵基因的克隆和研究顯得十分重要，這使得清晰地闡明葉片衰老在分子水平上的遺傳機制成為了可能。例如，從快速衰老突變體Hsl中克隆到了 RLSl基因，該基因在水稻葉衰老過程中參與自噬調(diào)節(jié)的葉綠體降解途徑(Jiao BBj Wang JJj ZhuXDj Zeng LJj Li Qj He ZH.2012.A novel protein RLSlwith NB-ARM domains is involvedin chloroplast degradation during leaf senescence in rice.Mol Plant5，205-217.)。另外，葉片衰老關(guān)鍵基因的克隆，對利用基因工程的手段調(diào)控作物葉片的衰老進程、改善作物的光合功能和挖掘作物的產(chǎn)量潛力，提供了潛在的可行性。
[0004]斑點葉突變體在沒有病原菌入侵的情況下也呈現(xiàn)類似病斑的表型。通過檢測這類突變體的抗病性，通常會發(fā)現(xiàn)它們對于病原菌的抗性也大大增強(Jung YHj LeeJHj Agrawal GKj Rakwal Rj Kim JAj Shim JKj Lee SKj Jeon JSj Koh HJj Lee YHj IwahashiH, Jwa NS.2005.The rice(Oryza sativa)blast lesion mimic mutant, blm, may conferresistance to blast pathogens by triggering multiple defense-associatedsignaling pathways.Plant Physiol Biochem43, 397-406;Wu C，Bordeos A，MadambaMR，Baraoidan M，Ramos Mj Wang GL，Leach JE，Leung H.2008.Rice lesion mimic mutantswith enhanced resistance to diseases.Mol Genet Genomics279，605-619.)。在已鑒定基因的這類突變體中，SPLll的突變給與了水稻對稻瘟病病菌和白葉枯病病菌的廣譜抗性(Yin Zj Chen Jj Zeng Lj Goh Mj Leung H，Khush GSj Wang GL.2000.Characterizing ricelesion mimic mutants and identifying a mutant with broad-spectrum resistance torice blast and bacterial blight.Mol Plant Microbe Interactl3, 869-876.) ；SPL28的突變傳遞給植株對一些稻瘟病病菌和白葉枯病病菌的抗性(Qiao Y, Jiang ff, Lee J, ParkB, Choi MS, Piao R, Woo MO, Roh JH, Han L, Paek NC, Seo HS, Koh HJ.2010.SPL28encodes aclathrin-associated adaptor protein complexl, medium subunit microl(APlMl) andis responsible for spotted leaf and early senescence in rice(Oryza sativa).NewPhytol 185, 258-274.) ；GF14e的基因沉默水稻植株對一種水稻黃單胞桿菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.0ryza)毒性菌株呈現(xiàn)除了高水平的抗性(Manosalva PM, BruceM,Leach JE.2011.Ricel4-3-3protein(GF14e)negatively affects cell death anddisease resistance.Plant J68, 777-787.) ；NLS1的半顯性突變導致水稻中防御反應(yīng)的組成性激活(Tang J, Zhu X，Wang Y, Liu L, Xu B, Li F，F(xiàn)ang J, Chu C.2011.Sem1-dominantmutations in the CC-NB-LRR-type R gene, NLSI, lead to constitutive activation ofdefense responses in rice.Plant J66, 996-1007.)。斑點葉 / 類病斑突變體的基因克隆和研究對揭示防御反應(yīng)途徑具有重要的作用，也為利用基因工程的手段創(chuàng)造廣譜抗性植株提供了線索。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于一種水稻斑點葉性狀的突變體spl29基因。
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供上述spl29基因及其對應(yīng)的野生型控制基因SPL29的用途。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]斑點葉突變體spl29是在經(jīng)過愈傷組織培養(yǎng)而生成的中花11植株中發(fā)現(xiàn)了一個斑點葉突變體，該突變體從苗期開始，突變體的葉片在出現(xiàn)類病斑斑點后，會快速的衰老死亡。本發(fā)明采用圖位克隆的方法將spl29基因定位為L0C_0s08gl0600，spl29基因發(fā)生了一個G到T的點突變，導致氨基酸編碼從甘氨酸(Gly)變?yōu)榘腚装彼?Cys)。L0C_0s08gl0600基因的功能互補實驗恢復(fù)了 spl29的表型，表明L0C_0s08gl0600就是要找的SPL29基因，SPL29為UDPGP基因家族中的UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因(UAP1)。進一步研究SPL29基因的點突變與葉片早衰和植株抗性的關(guān)系發(fā)現(xiàn):水稻斑點葉突變體spl29在出現(xiàn)斑點葉表型后，葉片中葉綠素下降，葉綠體破裂和溶解，衰老轉(zhuǎn)錄因子和衰老相關(guān)基因表達上調(diào)；同時，水稻斑點葉突變體spl29對白葉枯病的抗病能力大大增強，抗病基因表達上調(diào)。即SPL29基因的點突變，導致了植物葉片的加速衰老和死亡，并提高了植株抗白葉枯病能力，誘導了體內(nèi)的抗病反應(yīng)，表明SPL29基因在控制衰老和抗病性方面發(fā)揮著重要的作用。
[0009]一種水稻斑點葉性狀的突變體spl29基因，其編碼核苷酸序列如Seq ID N0.1所
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[0010]所述的水稻斑點葉性狀的突變體SP129基因的核苷酸序列還包括在Seq ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的核苷酸序列。
[0011]spl29基因?qū)?yīng)的野生型控制基因SPL29的編碼核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。SPL29基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如Seq ID N0.3所示。SPL29基因所在的基因組核苷酸序列如Seq ID N0.4所示，Seq ID N0.4所示序列包含功能互補實驗所用的啟動子序列、基因區(qū)序列和終止子序列，共7888bp。
[0012]上述水稻斑點葉性狀的突變體spl29基因在控制水稻植株早衰和/或抗病方面的應(yīng)用。
[0013]與SP129基因?qū)?yīng)的野生型控制基因SPL29在調(diào)控水稻植株衰老和/或抗病方面的應(yīng)用。
[0014]水稻和其它物種中的與SPL29同源的基因在調(diào)控衰老和/或抗病方面的應(yīng)用；所述的與SPL29同源的基因為編碼與Seq ID N0.3所示的氨基酸序列同源性高于30%且行使的功能與SPL29的功能相似的同源基因。
[0015]本發(fā)明的水稻斑點葉突變體spl29的控制基因SPL29，在控制衰老和抗病性方面發(fā)揮著重要的作用。揭示了衰老與抗病性的新途徑，為闡明衰老的機制和創(chuàng)造高抗病性作物方面提供了新的可靠的理論依據(jù)，也為利用基因工程調(diào)控衰老與抗病性提供了新的靶標。SPL29基因在用于基因工程或遺傳工程方法，來調(diào)控生物個體的衰老和抗病能力時，擁有重要的潛在利用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為野生型WT和突變體spl29的表型。(A)植株苗期約28天時的表型；(B)植株分蘗期約50天時的表型；(C)植株成熟期約115天時的表型；(D)苗期葉片表型，對應(yīng)圖A植株依先后順序(從下而上)長出的第二葉；(E)分蘗期葉片表型，對應(yīng)圖B植株主莖從上向下的第一、二、三、四葉；(F)成熟期約90天時的劍葉表型，方框部分進行放大展示。
[0017]圖2為SPL29基因的圖位克隆和功能互補。(A)初步定位，采用44顆F2突變株，將SPL29定位在第8號染色體的分子標記M1037和M1230之間，并與M1077緊密連鎖；(B)精細定位，利用870顆F2突變株，將SPL29定位在新開發(fā)的分子標記S8和S26之間97kb的候選區(qū)域內(nèi)，并與S15和S19緊密連鎖；(C)在水稻基因組注釋項目(Rice Genome AnnotationProject)上查詢，候選區(qū)域內(nèi)有10個開放閱讀框(ORFs) ; (D) SPL29的候選基因的基因結(jié)構(gòu):該基因含有15個外顯子，G到T的點突變(箭頭指示)發(fā)生在第8個外顯子上，導致氨基酸編碼從甘氨酸變?yōu)榘腚装彼幔?E)功能互補的載體構(gòu)建:互補載體PSPL29C上構(gòu)建入一個 7888bp 的包含 L0C_0s08gl0600 的啟動子(Pro，2214bp)、基因(SPL29，4674bp)和終止子(Ter，1000bp)的基因組片段；空載體pEmvC作為對照，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將pSPL29C和PEmvC轉(zhuǎn)入spl29的愈傷中，分化成苗；(F)互補載體pSPL29C的轉(zhuǎn)基因植株；(G)空載體PEmvC的轉(zhuǎn)基因植株；(H)載體pSPL29C和pEmvC的轉(zhuǎn)基因植株葉片；(I)載體pSPL29C和PEmvC的轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測:Barl78:擴增的轉(zhuǎn)基因篩選標記基因(Bar)，長度178bp，野生型ZHll的DNA作為陰性對照，含Bar基因的空載體質(zhì)粒作為陽性對照；(J)突變體spl29中的點突變位點在PSPL29C和pEmvC的轉(zhuǎn)基因植株中的堿基序列檢測:該堿基位點在恢復(fù)表型的PSPL29C轉(zhuǎn)基因植株中同時含有G和T，在未恢復(fù)表型的空載體pEmvC轉(zhuǎn)基因植株中仍為T。
[0018] 圖3為UAP基因的系統(tǒng)進化樹以及編碼蛋白的同源性分析。(A)系統(tǒng)樹基于UAP和UGP基因編碼的全長氨基酸序列構(gòu)建。UAP =UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶；UGP:UDP-葡萄糖焦憐酸化酶。GanBank 號如下:ZmUAPl,玉米(Zea mays, AFW56989.1)；SbUAPl,高梁(Sorghum bicolor, XP_002444024.l)；0sUAPl (SPL29),水稻(Oryza sativa,NP_001061242.1) ；0sUAP2,水稻(Oryza sativa, NP_001053857.1) ；ZmUAP2,玉米(Zeamays, NP_001266496.1) ；SbUAP2,高粱(Sorghum bicolor, XP_002448519.1) ；AtUAPI,擬南芥(Arabidopsis thaliana, NP_564372.3) ;AtUAP2,擬南芥(Arabidopsis thaliana,NP_181047.1) ；GmUAPl,大豆(Glycine max, XP_003524811.1) ；GmUAP2,大豆(Glycinemax, XP_003531103.1)；PtUAPl,毛果楊(Populus trichocarpa，ΧΡ_002303345.2);PtUAP2,毛果楊(Populus trichocarpa, XP_006369046.1) ；HsUAPA,人(Homo sapiens,NP_003106.3, isoform A) ;HsUAPB,人(Homo sapiens, Q16222.3, isoform B);LmUAPl,飛蟲皇(Locustamigratoria, JX484802.1) ;LmUAP2,飛幢(Locusta migratoria, JX484803.1)；DmUAPA,黑腹果妮(Drosophila melanogaster, NP_609032.1, isoform A) ；DmUAPB,黑腹果妮(Drosophila melanogaster, NP_723183.1, isoform B) ；ScUAP,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, NP_010180.1) ；CeUAPI,秀 _ 隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans, NP_497777.1) ;CeUAP2,秀_ 隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans, NP_500511.2)；OsUGPl,水稻(Oryza sativa, NP_001063879.1)；0sUGP2,水稻(Oryza sativa,ΝΡ_001045689.1)；AtUGP2,擬南芥(Arabidopsis thaliana, NP_197233.1) ；AtUGPI,擬南芥(Arabidopsis thaliana, NP_186975.1) ；EcGlmU,大腸桿菌(Escherichia coli,P0ACC7.1)。(B)各蛋白與SPL29的氨基酸序列一致性的比對結(jié)果，對應(yīng)展示在蛋白名稱后面；“no”表示無序列一致性。
[0019]圖4為野生型WT和突變體spl29中葉綠素Ca+b含量變化。(A)苗期葉片中的葉綠素Ca+b含量測定；(B)分蘗期葉片中的葉綠素Ca+b含量測定。
[0020]圖5為野生型WT和突變體spl29中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。(A-C)野生型細胞中的葉綠體；(D-F)突變體細胞中破裂的葉綠體，圖中箭頭所指為葉綠體膜的破裂；(G-1)突變體細胞中溶解的葉綠體，圖中箭頭所指為溶解狀態(tài)的葉綠體。
[0021]圖6為野生型WT和突變體spl29中衰老轉(zhuǎn)錄因子和衰老相關(guān)基因的相對表達情況。(A-B)衰老轉(zhuǎn)錄因子在苗期和分蘗期的相對表達情況；(C-D)衰老相關(guān)基因在苗期和分蘗期的相對表達情況。三個水稻基因(UBC、Profi I in-2和Actinl)用作內(nèi)參分析，各基因在野生型中的表達量調(diào)為1，數(shù)據(jù)指示三個生物學重復(fù)的平均值(mean) 土標準差(SD)，星號指示野生型和spl29之間在統(tǒng)計學意義上的顯著差異(#P〈0.005，*#P〈0.0005 ;斯圖登檢驗(student，s test))。
[0022]圖7為野生型WT和突變體spl29的抗病能力檢測。(A)接種白葉枯病菌PX099后12天的病菌侵染葉，雙向箭頭指示病斑侵染部分；(B)白葉枯病菌PX099侵染12天的平均葉病斑長度，數(shù)據(jù)來自5-7顆獨立植株的平均值(mean) 土標準差(SD)，星號指示野生型和spl29之間在統(tǒng)計學意義上的顯著差異(***P〈0.0005,斯圖登檢驗(student，s test))；(C-D)防御反應(yīng)相關(guān)基因在苗期和分蘗期的相對表達情況，三個水稻基因(UBC、Profilin-2和Actinl)用作內(nèi)參分析，各基因在野生型中的表達量調(diào)為I，數(shù)據(jù)指示三個生物學重復(fù)的平均值(mean) 土標準差(SD)，星號指示野生型和spl29之間在統(tǒng)計學意義上的顯著差異(***Ρ〈0.0005,斯圖登檢驗(student’ s test))。
【具體實施方式】
[0023] 為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，下面提供了水稻斑點葉突變體(spl29)的實施實例。這些實施實例僅僅是說明性的、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中所用的原料均有市售。[0024]實施例1
[0025]1、水稻材料:
[0026]水稻(Oryza sativa)斑點葉突變體spl29 (spotted leaf29),保存于湖北省農(nóng)作物種質(zhì)資源中期庫(保存號HB2014001，湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所);其野生型(WT)品種為粳稻品種“中花11”。
[0027]水稻斑點葉突變體spl29是中花11在組織培養(yǎng)過程中突變產(chǎn)生的。突變表型為斑點葉和加速的葉衰老死亡。從苗期到植株發(fā)育后期的每一片葉都呈現(xiàn)這種突變表型。經(jīng)多代繁殖，spl29突變表型穩(wěn)定遺傳。表型結(jié)果如圖1所示。
[0028]2、群體構(gòu)建和遺傳分析
[0029]以突變體spl29為父本，分別以廣占63s和岳恢9113為母本，進行雜交，3個組合F1表型均為正常綠葉表型，F(xiàn)1自交，得到F2群體。在3個&群體中，非斑點表型葉與斑點表型葉植株數(shù)目均符合3:1的分離比，表明突變性狀受細胞核隱性單基因控制。結(jié)果如下表所示:
[0030]表1.突變體sp129的遺傳分析
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種水稻斑點葉性狀的突變體匆基因，其特征在于:該水稻斑點葉性狀的突變體SP129基因的編碼核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，其所對應(yīng)的野生型控制基因SPL29的編碼核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的水稻斑點葉性狀的突變體匆基因在控制水稻植株早衰和/或抗病方面的應(yīng)用。
3.與權(quán)利要求1所述的水稻斑點葉性狀的突變體#7匆基因?qū)?yīng)的野生型控制基因SPL29在調(diào)控水稻植株衰老和/或抗病方面的應(yīng)用。
4.水稻和其它物種中的與57?匆 同源的基因在調(diào)控衰老與抗病方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的與57?匆同源的基因為編碼與SeqID N0.3所示的氨基酸序列同源性高于30%且行使的功能與57?匆的功能相似的同源基因。
【文檔編號】A01H5/00GK103937812SQ201410140545
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】王兆海, 李陽生, 王雅, 胡道恒, 洪瀟 申請人:武漢大學