RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于干擾動(dòng)物睪丸生精細(xì)胞中Zfx基因的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體。RNAi干擾載體具有所述RNAi干擾片段，所述RNAi干擾片段包含下列序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAA TTCAA GAGATTTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC或TGCAG AGAAG GCCATTGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTT TTTTC。本發(fā)明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體通過對(duì)豬睪丸細(xì)胞中Zfx基因進(jìn)行干擾，使得Zfx基因表達(dá)下降，間接影響X精子的受精能力，從而達(dá)到控制豬后代性別的目的。
【專利說明】RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于控制動(dòng)物性別的RNAi干擾片段、 RNAi干擾載體、及RNAi干擾載體的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物性別控制的目的在于在動(dòng)物出生前即通過人工方法控制其性別。實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的 性別控制，有重要意義，主要體現(xiàn)在：（1)能及時(shí)淘汰或終止不需要性別的動(dòng)物，提高畜牧 業(yè)生產(chǎn)效益（奶牛、奶山羊、蛋雞雌性后代價(jià)值高，雄性價(jià)值低；肉牛、肉豬、肉雞雄性生長(zhǎng) 速度快）；（2)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中，提高所需性別動(dòng)物的利用價(jià)值（雌性動(dòng)物利用價(jià)值高， 雄性動(dòng)物利用價(jià)值低）；(3)通過增加希望的性別動(dòng)物的比例，提高育種強(qiáng)度；(4)避免胚胎 移植異性胚胎導(dǎo)致的孿生不育等。
[0003] 對(duì)動(dòng)物性別控制的相關(guān)研究早在多年前就已經(jīng)開始。目前國(guó)內(nèi)外動(dòng)物進(jìn)行性別控 制的方法主要有三種：（1) X精子與Y精子的分離，即通過X、Y精子微弱的生物學(xué)差異，分離 出含兩種不同染色體的精子。主要采用物理分離法，如采用流式細(xì)胞分離儀分離精子的準(zhǔn) 確率可達(dá)到90%。（2)胚胎的性別鑒定，即通過鑒定胚胎的性別，從而影響出生的性別比 例。早期胚胎性別鑒定方法主要有細(xì)胞學(xué)方法、免疫性方法、分子生物學(xué)方法、雄性特異性 DNA探針法等。（3)控制動(dòng)物受精的外部環(huán)境，動(dòng)物受精時(shí)外部環(huán)境中的某些因素也是性別 決定機(jī)制的重要條件，主要包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、體液酸堿度、輸精時(shí)間、年齡胎次、激素水平等。 但這些方法都存在一些缺點(diǎn)，限制了實(shí)際的應(yīng)用。例如，Χ、Υ精子分離的速度太慢，精液價(jià) 格昂貴且不耐冷凍，致使后代畸形率較高。進(jìn)行胚胎性別鑒定時(shí)，從胚胎上切取部分細(xì)胞， 而后經(jīng)冷凍、解凍會(huì)對(duì)胚胎造成一定的損害，使胚胎移植的成功率下降，同時(shí)劣質(zhì)胚胎的性 別鑒定成功率更低，制約了提供預(yù)知性別動(dòng)物胚胎的商業(yè)化進(jìn)程。在控制動(dòng)物受精的外部 環(huán)境中，由于影響動(dòng)物性別決定機(jī)制的外部環(huán)境有很多因素，調(diào)控單一因素?zé)o法有效影響 性別，同時(shí)調(diào)控多種因素在實(shí)際中很難達(dá)到多種因素的最佳狀態(tài)，且調(diào)控這些因素的效果 還與動(dòng)物的體質(zhì)有關(guān)，因此控制性別的效果不甚明顯。
[0004] 如今，隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，從基因水平著手對(duì)性別控制進(jìn)行研究已經(jīng)成為 一種新的方向，同時(shí)隨著基因技術(shù)的日趨成熟，基因技術(shù)的成本將大幅下降，使其在生產(chǎn)應(yīng) 用中大規(guī)模推廣成為了一種可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及應(yīng)用。主 要目的是通過RNAi干擾載體對(duì)動(dòng)物X染色體上的Zfx基因進(jìn)行干擾，使得Zfx基因表達(dá)下 降，以此達(dá)到人為控制動(dòng)物性別的目的。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案：
[0007] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種RNAi干擾片段，用于干擾動(dòng)物X染色體上的 Zfx基因，所述RNAi干擾片段包含下列任一序列：TGAGGCAGAT GTATC TGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTTTTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAATGGCC TTCTC TGCTT TTTTC ；
[0008] 所述Zfx基因負(fù)責(zé)編碼一個(gè)大的酸性鏈鋅指蛋白上12-13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有特定 的核定位信號(hào)區(qū)域和DNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性地與靶基因結(jié)合，定向引導(dǎo)靶基因穿過核 膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，其編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與X精子的發(fā)育相關(guān)。
[0009] 進(jìn)一步地，所述RNAi干擾片段作為制備控制動(dòng)物性別的藥物、試劑盒的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明實(shí)施例還提供一種RNAi干擾載體，用于干擾動(dòng)物X染色體上的Zfx基因， 所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；
[0011] 所述 RNAi 干擾片段包含有以下序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC〇
[0012] 進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體包括pLentiLox3. 7載體，所述pLentiLox3. 7載體 與所述RNAi干擾片段連接。
[0013] 進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體在動(dòng)物受精前進(jìn)行性別控制中應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體以睪丸直接注射的方式注射至動(dòng)物體內(nèi)，用于干擾 動(dòng)物X染色體上的Zfx基因。
[0015] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種RNAi干擾載體的制備方法，所述制備方法包 括如下步驟：
[0016] 酶切所述 pLentiLox3. 7 載體；
[0017] 將所述RNAi干擾片段與酶切后的所述pLentiL〇X3. 7載體連接，得到連接產(chǎn)物；
[0018] 其中，所述RNAi干擾片段包含以下序列：TGAGG CAGAT GTATCTGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCM GAGM TTCM TGGCC TTCTCTGCTT TTTTC ；
[0019] 將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽(yáng)性克隆菌液；
[0020] 對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，并將測(cè)序結(jié)果與所述RNAi干擾片段序列完全一 致的菌液進(jìn)行擴(kuò)增；
[0021] 從所述擴(kuò)增的菌液中提取RNAi干擾載體。
[0022] 進(jìn)一步地，所述的將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽(yáng)性克隆菌液， 具體為：將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并采用氨芐（AMP+)抗性篩選和藍(lán)白斑篩選， 篩選出陽(yáng)性克隆菌液。
[0023] 進(jìn)一步地，所述的從所述擴(kuò)增的菌液中提取RNAi干擾載體，具體為：采用質(zhì)粒提 取試劑盒進(jìn)行提取或采用SDS堿裂解法進(jìn)行提取。
[0024] 借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)：
[0025] 本發(fā)明實(shí)施例提供的RNAi干擾片段以及RNAi干擾載體可以對(duì)動(dòng)物X染色體上的 Zfx基因進(jìn)行干擾，使得Zfx基因表達(dá)下降，間接影響X染色體的發(fā)育，以此達(dá)到人為控制動(dòng) 物性別的目的。另外，本發(fā)明實(shí)施例以睪丸直接注射的方式注射至動(dòng)物睪丸，不會(huì)對(duì)動(dòng)物的 健康和睪丸功能產(chǎn)生影響，而且操作方便、快捷，成本低廉。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1示出了 pLentiLox3. 7載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027] 圖2示出了兩種干擾載體的干擾組和對(duì)照組中仔豬睪丸生精細(xì)胞Zfx基因的mRNA 表達(dá)量的示意圖；
[0028] 圖3示出了干擾片段和pLentiL〇x3. 7載體連接形成干擾載體的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采用的技術(shù)手段及功效，結(jié)合較佳 實(shí)施例詳細(xì)說明如下。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 設(shè)計(jì)并合成用于干擾動(dòng)物睪丸生精細(xì)胞中的Zfx基因的RNAi干擾片段。下面本 實(shí)施例以豬睪丸生精細(xì)胞中的Zfx基因的RNAi干擾片段為例，對(duì)本發(fā)明提供的技術(shù)方案進(jìn) 行說明。具體如下：
[0032] 根據(jù)豬Zfx基因的mRNA序列（GenBank:KF803247)設(shè)計(jì)并篩選出兩個(gè)siRNA片 段，然后按照所述pLentiL 〇X3. 7載體及所帶啟動(dòng)子的要求，在兩個(gè)siRNA片段序列兩端添 加酶切位點(diǎn)、loop環(huán)及終止序列，最終形式為胸腺嘧啶（T)+正義鏈19nt靶序列+莖環(huán)結(jié) 構(gòu)（TTCAAGAGA) +靶序列反向互補(bǔ)序列+RNAPolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTTTTT)+XhoI 酶切位點(diǎn)（GAGCT)，合成兩對(duì)shRNAi的寡聚核苷酸序列。該兩對(duì)shRNAi干擾片段分別為 shRNAl和shRNA2,如表1所示。
[0033] 表 1
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種RNAi干擾片段，用于干擾動(dòng)物X染色體上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi 干擾片段包含下列任一序列：TGAGG CAGAT GTATCTGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGM TTCM TGGCC TTCTCTGCTT TTTTC; 所述Zfx基因負(fù)責(zé)編碼一個(gè)大的酸性鏈鋅指蛋白上12-13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有特定的核 定位信號(hào)區(qū)域和DNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性的與靶基因結(jié)合，定向引導(dǎo)靶基因穿過核膜，定 位于精子細(xì)胞核內(nèi)，其編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與X精子的發(fā)育相關(guān)。
2. 權(quán)利要求1所述的RNAi干擾片段作為制備控制動(dòng)物性別的藥物、試劑盒的應(yīng)用。
3. -種RNAi干擾載體，用于干擾動(dòng)物X染色體上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi 干擾載體具有RNAi干擾片段； 所述 RNAi 干擾片段包含以下序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體包括 pLentiLox3. 7載體，所述pLentiLox3. 7載體與所述RNAi干擾片段連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體在動(dòng)物受精 前進(jìn)行性別控制中應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體以睪丸直接 注射的方式注射至動(dòng)物體內(nèi)，用于干擾動(dòng)物X染色體上的Zfx基因。
7. -種RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 酶切所述pLentiLox3. 7載體； 將所述RNAi干擾片段與酶切后的所述pLentiL〇X3. 7載體連接，得到連接產(chǎn)物； 其中，所述 RNAi 干擾片段包含序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC ； 將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽(yáng)性克隆菌液； 對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，并將測(cè)序結(jié)果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的 菌液進(jìn)行擴(kuò)增； 從所述擴(kuò)增的菌液中提取RNAi干擾載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述的將所述連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽(yáng)性克隆菌液，具體為： 將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并采用氨芐（AMP+)抗性篩選和藍(lán)白斑篩選，篩 選出陽(yáng)性克隆菌液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述的從所述擴(kuò)增 的菌液中提取RNAi干擾載體，具體為：采用質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)所述RNAi干擾載體進(jìn)行提取 或采用SDS堿裂解法對(duì)所述RNAi干擾載體進(jìn)行提取。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104232643SQ201410421472
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】賈斌, 寧孟影, 程波 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)