專利名稱：一種抑制木質(zhì)素合成的植物rna干擾載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種抑制木質(zhì)素合成的植物干擾載體的構(gòu)建及其在培育低木質(zhì)素含量植物中的應用。
背景技術：
木質(zhì)素是植物體內(nèi)一類重要的大分子酚類聚合物，其數(shù)量巨大，在自然界中的含量僅次于纖維素，居有機多聚物的第二位，通常占植物體干重的10%左右，在樹木甚至可以達到30%。木質(zhì)素在陸生植物的生長發(fā)育中起著及其重要的作用。然而，牧草中木質(zhì)素過量的沉積卻影響牲畜對牧草 中營養(yǎng)成分的吸收；工業(yè)用植物中的木質(zhì)素也加大了利用植物纖維的成本。因此，在畜牧生產(chǎn)和植物纖維利用工業(yè)中一直希望獲得木質(zhì)素含量低的新植物品系，從而改善牧草的營養(yǎng)特性或是降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，該干擾載體含有部分紫花苜蓿(咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)基因序列。CCoAOMT是木質(zhì)素合成關鍵酶之一，編碼CCoAOMT的基因為CCoAOMT基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中應用，為培育低木質(zhì)素含量牧草等提供良好素材。本發(fā)明的另一個目的是提供一種將構(gòu)建的干擾載體轉(zhuǎn)入植物細胞的方法，利用該方法，將該干擾載體轉(zhuǎn)入植物細胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得生長正常的低木質(zhì)素含量植株。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施:一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，所述的植物RNA干擾載體是:將序列表SEQ ID N0.1所示的核酸序列作為正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的核酸序列作為反向核酸片段插入植物表達載體PFGC5941中。序列表所示的核酸序列為插入了酶切位點的紫花苜蓿片段。上述的抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)紫花苜蓿總RNA的提取
2)反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA；
3)帶有相應酶切位點的，分別作為正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR擴增；
4)PCR擴增的正向核酸片段和反向核酸片段經(jīng)過切膠回收，分別連接到T載體上；
5)雙酶切連接到T載體上的正向核酸片段和植物表達載體pFGC5941，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoAOMT I ；
6)雙酶切連接到T載體上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoA0MTl，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。將植物RNA干擾載體——pFGC5941-CCoAOMTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，獲得重組根癌農(nóng)桿菌。上述的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中的應用，其方法如下:
I)轉(zhuǎn)導過程采用葉盤法
取植物(如煙草或其它植物)健壯葉片，剪成0.5 cm 2左右的葉盤，在分化培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2d后，放入上述的含有植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi的重組根癌農(nóng)桿菌中浸泡lOmin，取出后接種到分化培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2d。轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基，進行卡那霉素抗性篩選及不定芽的誘導。將誘導的不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中生根。當根系發(fā)育完全，根長1.5 2.0cm時，移栽再生苗，獲得轉(zhuǎn)基因植株。2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
提取轉(zhuǎn)基因材料基因組DNA，以基因組DNA為模板，35S啟動子加序列表SEQ ID N0.1所示的正向基因片段為檢測目標，進行PCR反應；PCR產(chǎn)物測序、比對。通過該方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC—3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’。3)生長正常的低木質(zhì)素含量植株的獲得
轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的測定:通過經(jīng)典的Klason法測定樣本木質(zhì)素的含量。篩選木質(zhì)素含量較野生型降低10%以上的材料繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標的測定:篩選木質(zhì)素含量較野生型降低10%以上的轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)培養(yǎng)，以外觀、株高、單株重為指標，比較轉(zhuǎn)基因與野生型材料在生長勢方面的差異，以生長勢與野生型無顯著差異的轉(zhuǎn)基因植株為最終獲得的生長正常的低木質(zhì)素含量植株。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用來源于紫花苜蓿(咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)的部分基因序列，構(gòu)建了一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，采用農(nóng)桿菌介導法將該干擾載體轉(zhuǎn)入植物細胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得生長正常的低木質(zhì)素含量植物，為培育低木質(zhì)素含量的牧草、造紙材料等提供種質(zhì)資源。


圖1是雙酶切驗證干擾載體正向核酸片段；
Ml =Marker (2000bp) ；M2 =Marker (15000bp) ;1 6 ;重組載體酶切產(chǎn)物。圖2是雙酶切驗證干擾載體反向核酸片段；
Ml =Marker (15000bp) ；M2 =Marker (2000bp) ;1 3 ;重組載體酶切產(chǎn)物。圖3是轉(zhuǎn)化植株(煙草)的PCR檢測(2000bp Marker)；
M =Marker (2000bp) ;1 5 ;有目標片段，為陽性植株；6:無目標片段，為野生型植株；7:重組質(zhì)粒:8:水。
具體實施方式
實施例1:紫花苜蓿CTo撕基因片段的克隆1.紫花苜?？俁NA的提取
(1)取幼嫩的紫花苜猜組織IOOmg,加入液氮研磨；向研缽中加入ImLRNAiso Plus,室溫靜置至樣品完全融化，繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀；
(2)將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中；12000r/min，4°C，離心5min;取上清移入新的離心管中；
(3)向上清液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5體積量)，震蕩15s，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5min ；
(4)12000 r/min，4°C，離心15min ;吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；
(5)向上清中加入等體積的異丙醇，充分混勻后，室溫靜置IOmin；
(6)12000 r/min,4°C,離心 IOmin ;棄上清，緩慢加入 75% 的乙醇 ImL ； 12000 r/min,4°C，離心5min后棄乙醇；
(7)室溫干燥沉淀2 5min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存，得RNA模板。2.經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA
(I)紫花苜蓿cDNA第一鏈的合成。將獲得的RNA模板(3 μ I)、Primer Mix (2 μ I)、dNTP Mix (4 μ I)和 RNase-Free Water (4 μ I)配置反應體系，70°C孵育 lOmin，迅速冰浴2min。短暫離心。繼續(xù)向以上反應液中加入5XRT Buff (4μ 1),0.1M DTT (2μ I), 42°C孵育 2min;加入 Ιμ HiF1-MMLV (200U/μ I )，42°C孵育 50min。70°C 孵育 15min。反應結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。(2)紫花苜蓿cDNA合成。上述反應產(chǎn)物作為模板，進行PCR反應，獲得紫花苜蓿cDNA序列。3.帶有相應酶切位點的紫花苜?；虿糠制蔚臄U增 以紫花苜蓿cDNA為模板，擴增CCoAOMT基因片段。擴增正向核酸片段，上游引物5’ -GGCGCGCCACGGAGAAGGAAAGCAAA-3,
下游引物 5’ -AITTAAATGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。擴增反向核酸片段，上游引物5’ -TCCCCCGGGACGGAGAAGGAAAGCAAA-3’，
下游引物 5’ -GCTCTAGAGCGGAGGGGCGCGTCGGG-3’。PCR擴增，經(jīng)測序得到如序列表SEQ ID N0.1所示的正向核酸片段和如序列表SEQID N0.2所示的反向核酸片段。實施例2:抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的制備
將實施例1獲得的帶有相應酶切位點的正向核酸片段和反向核酸片段分別連接到PMD19-T載體上；用Asc I和Swa I雙酶切連接到pMD19_T載體上的正向核酸片段和植物表達載體PFGC5941，回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoA0MTl ;用Xba I和5)胳I雙酶切含有反向核酸片段的pMD19-T載體和中間載體pFGC5941_CCoA0MTl，回收目的片段，T4連接酶連接，構(gòu)建成抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體PFGC5941-CCoAOMTi ο雙酶切載體pFGC5941_CCoA0MTi進行鑒定，結(jié)果如圖1和圖2所示，獲得2個片段，大小與設計一致。以干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi為模板，35S啟動子加正向基因片段為檢測目標，進行PCR反應；PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序正確。
實施例3:植物RNA干擾載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。1.農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中；220 r/min，28°C，振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.5 ;吸取1.5ml菌液于離心管中，冰浴IOmin ；5000 r/min,離心30s,棄去上清液,沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl懸浮，冰浴20min ；5000 r/min,離心30s,棄去上清液；每管用100 μ I 20mM CaCl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化。2.質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
50 μ I農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中加入質(zhì)粒pFGC5941-CCoAOMTi IOul，冰浴30 min ;放入液氮中l(wèi)min，然后立即放入37°C水浴鍋中水浴5min ;取出離心管，加入0.5mlLB，28°C、220 r/min振蕩培養(yǎng)4h ;取出菌液于含卡那霉素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28°C條件下倒置培養(yǎng)。2天左右菌落可見，得到重組根癌農(nóng)桿菌。3.重組根癌農(nóng)桿菌鑒定
小量提取質(zhì)粒DNA，PCR鑒定，重組根癌農(nóng)桿菌中含有質(zhì)粒pFGC5941-CCoAOMT i。實施例4:植物RNA干 擾載體轉(zhuǎn)化煙草植物
1.轉(zhuǎn)導(采用葉盤法)
取煙草健壯葉片，剪成0.5 cm 2左右的葉盤，葉腹面向下置于分化培養(yǎng)基上，溫度260C 土 1°C，光照16h/d，培養(yǎng)2d。將葉片放入已經(jīng)培養(yǎng)至OD6tltl (0.5-0.6)的重組根癌農(nóng)桿菌菌液中浸泡lOmin，用無菌濾紙吸去多余菌液，葉腹面向下接種到分化培養(yǎng)基中，溫度260C 土1°C，暗培養(yǎng)2d。轉(zhuǎn)入含卡那霉素的篩選分化培養(yǎng)基，進行抗性篩選及不定芽的誘導，培養(yǎng)溫度26°C ±1°C，光照16h/d。培養(yǎng)7d左右，葉片上發(fā)生愈傷組織；繼續(xù)培養(yǎng)IOd左右，愈傷組織上分化出不定芽。當不定芽長至1.5cm高時，將其從基部切下，與葉盤分開，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度26°C ±1°C，光照16h/d。培養(yǎng)IOd左右，不定根發(fā)生，當根系發(fā)育完全，根長1.5 2.0cm時，將再生植株移栽至裝有營養(yǎng)土的盆中培養(yǎng)，常規(guī)管理。經(jīng)上述操作獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。2.轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測
按植物基因組DNA提取試劑盒操作，提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，以基因組DNA為模板，35S啟動子加正向基因片段為克隆目標，進行PCR反應；PCR產(chǎn)物測序、比對。通過該方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC— 3，
下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’
通過PCR篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。如圖3所示，經(jīng)檢測，再生植株中含有目標片段。收集目標片段，送交上海生工測序，測序結(jié)果與原設計相符，判斷為陽性植株。實施例5:生長正常的低木質(zhì)素含量植株的獲得。1.轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量的測定
取在營養(yǎng)土中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片烘干至恒重，取IOOmg作為樣本，通過經(jīng)典的Klason法測定樣本木質(zhì)素的含量。經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因煙草植株中木質(zhì)素含量較野生型平均降低10%以上。Klason法:樣品液氮研磨后,精確稱取烘至恒重后的樣品100 mg,加入12.5ml 72% H2SO4, 30°C消化lh，將消化后的混合液用無菌水稀釋到4 %，120°C第2次消化lh，將熱溶液通過烘干至恒重的砂心漏斗(W1)過濾，并用熱水沖洗3次，殘渣和漏斗一起放入烘箱中，60°C烘至恒重(W2),并按下式計算木質(zhì)素含量值。每個樣品木質(zhì)素含量重復測定3次，取平均值。木質(zhì)素含量(mg/IOOmg)=W2 - W1。2.轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標的測定
以外觀、株高、單株重為指標，比較轉(zhuǎn)基因與野生型材料在生長勢方面的差異，以生長勢與野生型無顯著差異 的轉(zhuǎn)基因材料為最終獲得的生長正常的低木質(zhì)素含量植株。<110>遼寧大學
〈120〉一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應用 〈160〉 2
〈210〉 I〈211〉 684〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿CCoAOMT核酸片段(作為正向核酸片段)
〈400〉 I
GCTATTAGTAGGGCATTCGCGCATCCTGCGAAGAATCTTGGGTATACTTCTCCATATTATTTCTTTATAAAC
AATGATTCCCCCCGGACTCTCTTTCTGTCCGGAGTCTTAAAGAATGAATTCTATTGAGTTGTGGTTGTTGACCAACA
AATTATGCATGGGAGAAAGATTCACAAAGGAAAACTAACCTTGATCCAGAAAGAAAGGGGCCCCTTCATCGCATCGG
GTTGGGTTGGCCCATCAGAATTTGTGCATTGCATCCTACCTAATTCGTTAGCGCTTTTTCTTTTAAGAATGCATCTG
GTTCTATCTTTCTTTCGCCAGTTAGTCCACCTTTTAGTGATTCTAGTAATTCTGGTTTGATAGTGCTTAGAATGTCT
CTTTCATATTGAGCAATTTTGTCTAATGGCATTCGATCACAGAATCCATTGACAGCTGCATAAATTACTAGAATTTG
TTTTTCAATTGGAAGTGGTGCATATTGTGGTTGTTTTAGTACTTCTGTAAGCCTTGCACCTCTATTGAGTAATGCCT
GAGTCGCAGCATCAAG GTCTGAGCCAAATTGAGCAAAGGCGGCCACTTCGCGATATTGTGCCAATTCAAGTTTTAAA
CTACCGCAGACTTGTTTCATAGCTTTCAACTGAGCGGCAGACCCGACGCGCCTCTCGCATTTTTTATATATAA
〈210〉 2〈211〉 686〈212〉 DNA
〈213〉紫花苜蓿核酸片段(作為反向核酸片段)
〈400〉 2
CCTTGCCGGCTAGCTGAGCTATGAACAGTCTGCGGTAGTTTAAAACTTGAATTGGCACAATATCGCGAAGTGGCCGCCTTTGCTCAATTTGGCTCAGACCTTGATGCTGCGACTCAGGCATTACTCAATAGAGGTGCAAGGCTTACAGAAGTACTAAAACAACCACAATATGCACCACTTCCAATTGAAAAACAAATTCTAGTAATTTATGCAGCTGTCAATGGATTCTGTGATCGAATGCCATTAGACAAAATTGCTCAATATGAAAGAGACATTCTAAGCACTATCAA ACCAGAATTACTAGAATCACTAAAAGGTGGACTAACTGGCGAAAGAAAGATAGAACCAGATGCATTCTTAAAAGAAAAAGCGCTAACGAATTAGGTAGGATGCAATGCACAAATTCTGATGGGCCAACCCAACCCGATGCGATGAAGGGGCCCCTTTCTTTCTGGATCAAGGTTAGTTTTCCTTTGTGAATCTTTCTCCCATGCATAATTTGTTGGTCAACAACCACAACTCAATAGAATTCATTCTTTAAGACTCCGGACAGAAAGAGAGTCCGGGGGGAATCATTGTTTATAAAGAAATAATATGGAGAAGTATACCCAAGATTTTCTTCGCAGGATGCGCGAATTTGCCCTACTAATTATCCTTTGCTTTCCTTCTCCGCCCCGGGGGGAAGG
權利要求
1.一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體，其特征在于所述的植物RNA干擾載體是:將序列表SEQ ID N0.1所示的紫花苜蓿部分核酸序列作為正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的紫花苜蓿沈bD#部分核酸序列作為反向核酸片段，插入植物表達載體PFGC5941 中。
2.權利要求1所述的抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: O紫花苜蓿總RNA的提??； 2)反轉(zhuǎn)錄獲得紫花苜蓿cDNA； 3)帶有相應酶切位點的，分別作為正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR擴增； 4)PCR擴增的正向核酸片段和反向核酸片段經(jīng)過切膠回收，分別連接到T載體上； 5)雙酶切連接到T載體上的正向核酸片段和植物表達載體PFGC5941，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得中間載體pFGC5941-CCoAOMTI ； 6)雙酶切連接到T載體上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoAOMTI，電泳回收目的片段，T4連接酶連接，獲得植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。
3.一種重組根癌農(nóng)桿菌，其特征在于將植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得重組根癌農(nóng)桿菌。
4.權利要求1所述的植物RNA干擾載體在培育低木質(zhì)素含量植物中的應用，其特征在于方法如下: 1)采用葉盤法用含有植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物葉片； 2)葉片經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株； 3)將再生植株移栽至裝有營養(yǎng)土的盆中獲得轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制木質(zhì)素合成的植物RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應用。所述的植物RNA干擾載體是將序列表SEQIDNO.1所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作為正向核酸片段)和序列表SEQIDNO.2所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列(作為反向核酸片段)插入植物表達載體pFGC5941中，構(gòu)建成植物RNA干擾載體pFGC5941-CCoAOMTi。用獲得的干擾載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，獲得了含干擾載體的農(nóng)桿菌工程菌。利用含干擾載體的農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化植物，培育低木質(zhì)素含量植物，利用該方法，獲得了生長正常、木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因植物，為培育低木質(zhì)素牧草、造紙植物等提供種質(zhì)資源。
文檔編號A01H4/00GK103146745SQ20131007941
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權日2013年3月13日
發(fā)明者韓陽, 王紅艷, 段亞楠, 盧福榮, 茹藝, 李曹娜 申請人:遼寧大學