本發(fā)明涉及一種antimuc1car-t細胞及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因修飾細胞及腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在腫瘤免疫治療方法中，淋巴細胞免疫技術(shù)包括細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞、細胞毒性t淋巴細胞和浸潤性t淋巴細胞等在國內(nèi)外已經(jīng)用于臨床治療惡性腫瘤，并取得一些臨床療效，但其為非特異性免疫作用，由于腫瘤細胞本身免疫逃逸和抗原隱蔽性，其對體內(nèi)腫瘤細胞清除還非常有限。嵌合抗原受體基因修飾淋巴細胞技術(shù)的出現(xiàn)為臨床治療癌癥提供了新的方向。嵌合抗原受體t細胞(chimericantigenreceptortcell,簡稱：car-tcell)療法是通過提取患者體內(nèi)t淋巴細胞，經(jīng)過體外10至14天的培養(yǎng)改造，通過載體整合進入到正常t細胞基因序列，形成嵌合抗原受體t細胞(car-t)。被重新編碼的t細胞就能獲得特異性識別和攻擊殺傷腫瘤細胞的能力，能精確殺傷腫瘤細胞，但又不會傷及正常細胞。由于是誘導(dǎo)、激活自體細胞，因此該療法沒有通常放、化療的毒副反應(yīng)，也沒有傳統(tǒng)治療中出現(xiàn)的耐藥性。

嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，簡稱：car)主要由兩部分構(gòu)成，一端位于細胞外，能夠特異性識別癌細胞表面的某一抗原；另一端位于細胞內(nèi)，含有信號激活元件(如t細胞受體的zeta鏈)，起傳遞信號激活t細胞的作用。這樣表達car的t淋巴細胞(car-t細胞)就能避免t細胞受體識別靶細胞的限制，從而起到靶向癌細胞的的殺傷作用。目前，car-t治療的臨床試驗正在迅速增長，其中大部分是對b細胞惡性腫瘤治療的評估。不同的臨床試驗所采用的cd19car-t細胞都報道了顯著的效果，復(fù)發(fā)性或難治性淋巴細胞白血病的治療能達到60-90％的反應(yīng)率，一部分患者達到持續(xù)的緩解，最長的達到2年,這種免疫治療已經(jīng)給一些患者帶來了前所未有的效果。除了血液系統(tǒng)腫瘤外，研究者們一直在努力將car-t治療擴展到實體瘤,但是，car-t治療實體瘤還處于早期階段，還有許多問題需要解決。

mucin1是膜結(jié)合型粘蛋白家族成員，簡稱muc1。在正常情況下，muc1呈低水平表達在乳腺，胰腺，胃腸道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮細胞的近管腔面，不能被機體免疫系統(tǒng)識別，其表達特點為極性表達，頂端分布，糖基化豐富。在大多數(shù)腺癌、血液系惡性腫瘤中muc1呈異常過表達，可通過調(diào)控多個信號通路調(diào)節(jié)細胞惡性轉(zhuǎn)化，是促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要癌基因。由于muc1在腫瘤細胞中的表達糖基化不全，并失去極性，遍布于整個細胞表面，容易被抗體識別，因此，muc1蛋白可作為car-t細胞抗腫瘤治療的一個理想靶點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種antimuc1car-t細胞及其制備方法和應(yīng)用，該細胞經(jīng)過t細胞修飾和改造得到，并且能夠特異性識別和殺傷腺癌、血液系惡性腫瘤，適用于相應(yīng)腫瘤疾病的預(yù)防和治療。

本發(fā)明提供一種antimuc1car-t細胞，所述antimuc1car-t細胞在t細胞內(nèi)表達scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述scfv用于結(jié)合所述muc1蛋白，并且所述scfv的氨基酸序列為第一序列，所述第一序列為：

evqlqqsggglvqpggsmklscvaskftfsnywmnwvrqspekglewvaeirlksnnyathyaesvkgrftisrddskssvylqmnnlraedtgiyyctfgnsfaywgqgttvtvssggggsggggsggggsdivvtqesalttspgetvtltcrsstgavttsnysnwvqekpdhlftgliggtnnrapgvparfsgskigdkaaltitgaqtedeaiyfcalwesnhwvfgggtkltvlgse

該antimuc1car-t細胞以muc1為靶點，具體地，所述antimuc1car-t細胞的嵌合抗原受體car包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為scfv，所述鉸鏈區(qū)為igd，所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)為cd28–ox40–cd3ζ。圖1為本發(fā)明的antimuc1car的設(shè)計示意圖，請參考圖1。

進一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述igd的氨基酸序列為第二序列。

具體地，第二序列為：

tftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlprslwnagtsvtctlahpslppqrlmalrepaaqapvklstnllassdppeaa

進一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述cd28的氨基酸序列為第三序列。

具體地，第三序列為：

fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsallhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs

進一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，所述ox40的氨基酸序列為第四序列，所述cd3ζ的氨基酸序列為第五序列。

具體地，第四序列為：

rrdqrlppdshkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki

具體地，第五序列為：

rvkfsrsaeppayqqgqnqlynelnlgrseeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

進一步地，所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白中，

所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列為第六序列。

具體地，第六序列為：

evqlvqsgaevkkpgesltisckasgysfpnywitwvrqmsggglewmgridpgdsyttynpsfqghvtisidkstntaylhwnslkasdtamyycaryyvslvdiwgqgtlvtvssggggsggggsggggsqsvltqpasvsgspgqsitisctgtsskvggynyvswyqqhpgkapklmiydvnnrpsevsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyykssyttgsravfgggtkltvlgtftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggveegllerhsngsqsqhsrltlpralwnagtsvtctlnhpslppqrlmalrepaaqapvklslnllassdppeaafwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsaeppakqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

進一步地，所述antimuc1car-t細胞通過慢病毒感染t淋巴細胞獲得，所述慢病毒通過攜帶有所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的慢病毒表達載體感染293t細胞得到。

本發(fā)明還提供一種上述任一所述的antimuc1car-t細胞的制備方法，包括如下步驟：

1)構(gòu)建慢病毒表達載體，所述慢病毒表達載體具有所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白；

2)利用慢病毒包裝質(zhì)粒和所述慢病毒表達載體感染293t細胞，獲得慢病毒，所述慢病毒被所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝；

3)分離t淋巴細胞，并用所述慢病毒感染所述t淋巴細胞，獲得所述antimuc1car-t細胞，所述antimuc1car-t細胞的t細胞內(nèi)表達所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白。

在步驟1)中，通過基因工程手段，將scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表達載體上，從而完成對慢病毒表達載體的構(gòu)建。在步驟2)中，利用步驟1)所得的慢病毒表達載體對293t細胞感染，獲得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝的慢病毒。在步驟3)中，將步驟2)中的慢病毒表達于人外周血中分離收集的t淋巴細胞以獲得car-t細胞。

進一步地，在所述步驟1)之前，還包括合成和擴增所述scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因。具體合成和擴增方法可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段獲得。

進一步地，還包括對所述慢病毒進行純化，并用所述純化后的慢病毒感染所述t淋巴細胞。一般的，該純化手段可以使用本領(lǐng)域常規(guī)手段進行，例如過濾、超濾等。

本發(fā)明還提供了上述任一所述的antimuc1car-t細胞在制備治療腺癌藥物中的應(yīng)用，尤其能夠用于muc1分子高表達的腫瘤的治療。

本發(fā)明方案具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的antimuc1car-t細胞將muc1抗體用于car-t細胞的構(gòu)建，能夠?qū)uc1蛋白進行有效結(jié)合。

2、本發(fā)明提供的antimuc1car-t細胞制備方法能簡單、有效的制備具有特異性識別和殺傷腫瘤的antimuc1car-t細胞。

3、本發(fā)明的antimuc1car-t細胞具有高效的腫瘤殺傷活性，能夠用于制備治療腫瘤藥物中，尤其能夠以muc1分子為靶抗原，用于muc1分子高表達腫瘤的治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的antimuc1car的設(shè)計示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞以及未感染的t細胞對靶細胞mcf-7(乳腺癌)的殺傷效果示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞以及未感染的t細胞對靶細胞bxpc-3(胰腺癌)的殺傷效果示意圖；

圖4為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞、對照例以及空白例對治療乳腺癌(mcf-7)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

本發(fā)明antimuc1car-t細胞的制備

1、構(gòu)建慢病毒表達載體

通過常規(guī)的基因工程手段，合成scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列，將scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白基因序列克隆到慢病毒表達載體上，獲得scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ慢病毒表達載體pgreenpuro-car。其中，scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白的各序列如前所述。

2、慢病毒包裝

1)用質(zhì)量分數(shù)為10wt％胎牛血清(fetalbovineserum,簡稱：fbs)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)293t細胞；

2)將293t細胞以3x10⁵/cm²的密度傳至直徑15cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20h，保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合度為80-90％；

用不含血清的1640培養(yǎng)基換液，備用；

3)取兩個ep管，分別在兩個ep管中加入1ml1640，將慢病毒載體pgreenpuro-car與pmdlgprre、prsv-rev和pmd2.g質(zhì)粒按照摩爾比1：1：1：1于其中一個ep管中混勻；在另一個ep管中加入150ullipo2000，混勻放置5min；將混有l(wèi)ipo2000的1640加入含有質(zhì)粒的ep管中，混勻得混合液，室溫放置20min，然后將混合液逐滴加入上述2)中制備的細胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用含10％fbs的1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞上清液，獲得被scfv–igd–cd28–ox40–cd3ζ融合蛋白包裝的慢病毒。

3、慢病毒純化

將2中獲得的被包裝的慢病毒用0.22μm過濾膜過濾，濾液收集在50ml超濾管中，以3000g/min的速度離心45min；將剩余的上層病毒濃縮液轉(zhuǎn)移至ep管，放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、cd8+t細胞的分離

1)全血倒入50ml離心管，室溫離心20分鐘，控制離心力ref為700g(普通離心)；

2)取上述離心下部細胞成分，加杜氏磷酸鹽緩沖液dpbs至50ml；

3)分別取25ml上述液體加到20ml人淋巴細胞分離液,將離心管室溫離心15分鐘，控制離心力ref為800g；

5)取白膜層細胞，加入dpbs，補足至50ml；

6)離心10分鐘，控制離心力ref為600g，棄上清液，得外周血單個細胞(peripheralbloodmononuclearcell，簡稱：pbmc)；

7)采用cd8+t細胞磁珠分選試劑盒分選cd8+t細胞。

5、慢病毒載體感染t淋巴細胞

用質(zhì)量分數(shù)為10wt％fbs的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)cd8+t細胞，第一天加入抗cd3單克隆抗體活化；第三天加入150moi的3中純化后的慢病毒(antimuc1car)，16h后將培養(yǎng)基更換為含有50iu/ml重組人il-2的rpmi1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-20天，得到antimuc1car-t細胞。

實施例2

對實施例1制備的antimuc1car-t細胞體外抗腫瘤效果進行評價，包括以下步驟：

以穩(wěn)定表達muc1的乳腺癌細胞系mcf-7和胰腺癌細胞系bxpc-3作為靶細胞，分別用慢病毒載體pgreenpuro-car感染的t細胞(即，實施例1制得antimuc1car-t細胞)和未感染的t細胞制得效應(yīng)細胞，將靶細胞按照密度1x10⁵個/ml接種96孔板，每孔100μl，按照5:1，10:1，20:1效靶比將效應(yīng)細胞加入靶細胞，置于5％co2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，采用wst-1檢測細胞活力，計算殺傷效率。

圖2為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞以及未感染的t細胞對靶細胞mcf-7(乳腺癌)的殺傷效果示意圖；圖3為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞以及未感染的t細胞對靶細胞bxpc-3(胰腺癌)的殺傷效果示意圖。

圖2和圖3結(jié)果表明，表達muc1car的t淋巴細胞對muc1陽性腫瘤細胞具有很強的殺傷作用。

實施例3

對實施例1制備的antimuc1car-t細胞體內(nèi)抗腫瘤效果進行評價，包括以下步驟：

取6周齡雌裸鼠15只，右腋下皮下注射5x10⁶mcf-7(乳腺癌)細胞，待腫瘤長到60mm³大小，腫瘤模型隨機分成3組：對照組、antimuc1car-t細胞組、t細胞組；對照組尾靜脈注射生理鹽水200ul/次，每周2次；antimuc1car-t細胞組尾靜脈注射antimuc1car-t細胞1×10⁷個/次，每周2次；t細胞組尾靜脈注射t細胞1×10⁷個/次，每周2次；統(tǒng)計100天內(nèi)小鼠生存狀態(tài)，做生存率曲線。圖4為本發(fā)明實施例的antimuc1car-t細胞、對照例以及空白例對治療乳腺癌(mcf-7)移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期示意圖。

圖4結(jié)果表明，antimuc1car-t細胞相對于未感染的t細胞以及空白例可延遲muc1高表達的乳腺癌移植瘤小鼠模型的生存期。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。