本發(fā)明涉及一種細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，尤其涉及一種人臍帶血構(gòu)建免疫細(xì)胞庫(kù)的方法。

背景技術(shù)：

免疫細(xì)胞，泛指所有參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞，也特指能識(shí)別抗原，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。免疫細(xì)胞治療是采集人體免疫細(xì)胞，在多種免疫活性因子的作用下，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增免疫效應(yīng)細(xì)胞后，再回輸?shù)襟w內(nèi)，殺滅血液及組織中的病原體和癌細(xì)胞。目前，用于臨床治療的免疫細(xì)胞主要有樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）、DC刺激的CIK細(xì)胞（DC-CIK）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL）等。

免疫細(xì)胞治療已成為繼手術(shù)、化療、放療三大傳統(tǒng)療法后的第四種腫瘤治療技術(shù)，彌補(bǔ)了手術(shù)、放化療等常規(guī)療法無(wú)法完全殺滅體內(nèi)殘余癌細(xì)胞的缺點(diǎn)，還能防止腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，達(dá)到控制甚至治愈癌癥的目的，在臨床上的使用越來(lái)越廣泛。

目前，臨床上的免疫細(xì)胞治療均是將血液中分離的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增成足量的免疫細(xì)胞后回輸。而這種治療方式存在幾個(gè)不可避免的問(wèn)題：（1）由于釆血后的單個(gè)核細(xì)胞分離及誘導(dǎo)培養(yǎng)，病人若選擇免疫細(xì)胞治療至少需等待兩周時(shí)間，容易錯(cuò)過(guò)最佳治療期，且住院時(shí)間延長(zhǎng)；（2）癌癥患者尤其是晚期癌癥患者，體質(zhì)虛弱、免疫功能低下，一般不能耐受反復(fù)抽血（如容易誘發(fā)缺血性貧血等），因此所得的自體血量較少，而一次培養(yǎng)只能擴(kuò)增70-80倍左右，難以滿(mǎn)足免疫細(xì)胞治療所需細(xì)胞數(shù)量，臨床醫(yī)生需在細(xì)胞治療和反復(fù)抽血之間平衡；（3）病人自體血液的質(zhì)量不高，尤其是抗原遞呈細(xì)胞（DC細(xì)胞即是最高效的抗原遞呈細(xì)胞）數(shù)量較少，而免疫抑制細(xì)胞（Treg細(xì)胞）數(shù)量較多，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)免疫抑制細(xì)胞數(shù)量也在不斷增加，將在一定程度上繼續(xù)抑制效應(yīng)細(xì)胞；（4）臨床上的免疫細(xì)胞治療（DC-CIK）多選用全抗原負(fù)載的模式（如CN102861107B），治療的靶向性不強(qiáng)，存在移植物抗宿主反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

臍帶血是臍帶及胎盤(pán)內(nèi)近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，來(lái)源充足，采集方便，免疫源性較弱，能更大程度上耐受HLA（人類(lèi)的主要組織相容性復(fù)合體）配型不服；臍帶血內(nèi)的淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量高，具有較強(qiáng)的增殖潛力；由臍帶血分離誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫細(xì)胞治療，可突破免疫細(xì)胞只進(jìn)行自體治療的瓶頸，滿(mǎn)足不同人群對(duì)細(xì)胞治療的需求。

在免疫細(xì)胞庫(kù)建設(shè)過(guò)程中還需考慮細(xì)胞凍存的問(wèn)題，目前的細(xì)胞凍存液中DMSO（二甲基亞砜）的含量一般均在10%-15%，即便是在凍存免疫細(xì)胞的專(zhuān)利（CN102758259B）中，依然將DMSO控制在10%。但是單個(gè)核細(xì)胞，尤其是誘導(dǎo)后的淋巴細(xì)胞是脆弱的，由于DMSO的毒性作用及凍存過(guò)程中的機(jī)械操作，易造成免疫細(xì)胞膜上的某些蛋白構(gòu)型的改變，從而引起細(xì)胞亞型變化，導(dǎo)致穿孔素分泌量下降；另一方面，細(xì)胞在復(fù)蘇處理時(shí)還需注意對(duì)DMSO的清除處理，已有報(bào)道指出細(xì)胞治療的不良事件發(fā)生率與DMSO的回輸量有關(guān)。

綜上所述，研究一種可以滿(mǎn)足臨床中細(xì)胞治療需要的免疫細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種人臍帶血構(gòu)建免疫細(xì)胞庫(kù)的方法，該方法可提高細(xì)胞質(zhì)量，增強(qiáng)細(xì)胞治療效果。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種人臍帶血免疫細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟。

步驟1、臍帶血的采集及運(yùn)輸。

步驟2、從臍帶血中分離單個(gè)核細(xì)胞。

步驟3、將步驟2得到的單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的CD34^＋細(xì)胞誘導(dǎo)成DC細(xì)胞：用AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞密度；然后接種至培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入DC誘導(dǎo)因子，置二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)至第2-3天時(shí)，加入rhGM-CSF、rhIL-4和rhIL-15，置二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

步驟4、從上清培養(yǎng)液中分離懸浮的淋巴細(xì)胞：步驟3培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)至第3-4天時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中，再往培養(yǎng)瓶中加入生理鹽水，晃動(dòng)洗滌，收集殘留懸浮的淋巴細(xì)胞。

步驟5、獲得成熟的DC細(xì)胞：向步驟4洗滌后的培養(yǎng)瓶中加入AIM-V培養(yǎng)基，加入rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhGM-CSF和rhIL-4，置二氧化碳培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞；當(dāng)培養(yǎng)至第6天時(shí)，半量換液，回收移出液中的懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充rhGM-CSF和rhIL-4，并加入單一特異性腫瘤抗原肽進(jìn)行負(fù)載，置二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)至第7天時(shí)，加入rhTNF-α，置二氧化碳培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)至第9天時(shí)，細(xì)胞變?yōu)槊虪顟腋〖?xì)胞，即為成熟的DC細(xì)胞，終止培養(yǎng)。

步驟6、獲得CIK細(xì)胞：將步驟4中的懸浮的淋巴細(xì)胞離心棄上清，用AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后，接種到培養(yǎng)袋中，加入IFN-γ混勻，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后，加入rhIL-2、rhIL-15、CD3；然后每2-3天，2倍量添加培養(yǎng)液AIM-V培養(yǎng)基, 并補(bǔ)加rhIL-2；當(dāng)培養(yǎng)至第7天時(shí)，將培養(yǎng)袋內(nèi)的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到WAVE Bioreactor system 10中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)8天，獲得CIK細(xì)胞。

步驟7、收集DC-CIK細(xì)胞：將步驟5得到的成熟的DC細(xì)胞離心，用AIM-V培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入WAVE Bioreactor system 10中，與步驟6培養(yǎng)至第8天得到的懸浮細(xì)胞（CIK細(xì)胞）共培養(yǎng)；然后再添加AIM-V培養(yǎng)基，并補(bǔ)加rhIL-2、rhIL-15；共同培養(yǎng)至第14-16天時(shí)，離心收集共培養(yǎng)的細(xì)胞，即為DC-CIK細(xì)胞。

步驟8、對(duì)收集的DC-CIK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

步驟9、檢測(cè)合格后，放入免疫細(xì)胞庫(kù)凍存，并建立細(xì)胞檔案：將檢測(cè)合格的DC-CIK細(xì)胞與預(yù)冷的細(xì)胞凍存液混合后封裝，附上標(biāo)簽，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。

步驟10、根據(jù)臨床診斷從免疫細(xì)胞庫(kù)內(nèi)選擇對(duì)應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞種類(lèi)，復(fù)蘇培養(yǎng)24h后，回輸。

所述步驟1中臍帶血采集后需加入抗凝劑；所述的抗凝劑為肝素或枸櫞酸鈉。

所述步驟3中采用的DC誘導(dǎo)因子為rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhIL-3和rhIL-11，各誘導(dǎo)因子的用量均為5-100ng/ml。

所述步驟5中腫瘤抗原肽是針對(duì)各種腫瘤疾病的特異性抗原肽，優(yōu)選CEA癌胚抗原、AFP甲胎蛋白。

所述步驟5中獲得的成熟DC細(xì)胞是針對(duì)單一腫瘤抗原肽的效應(yīng)細(xì)胞。

所述步驟9中細(xì)胞凍存液的配方為5%DMSO，10%羥乙基淀粉，85%穩(wěn)定劑；其中穩(wěn)定劑由25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培養(yǎng)基組成；羥乙基淀粉可用右旋糖酐40代替。

所述步驟9細(xì)胞檔案需詳細(xì)記錄抗原肽負(fù)載類(lèi)型；細(xì)胞檔案需建立電子版檔案和紙質(zhì)版檔案。

所述步驟9免疫細(xì)胞庫(kù)是針對(duì)不同腫瘤抗原肽的多種效應(yīng)細(xì)胞的集合。

所述步驟9凍存的細(xì)胞密度控制在1-5×10⁸/ml。

所述步驟10細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)需加入rhIL-2、rhIL-6、rhIL-15進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明提供的人臍帶血免疫細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，采用人臍帶血作為免疫細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞來(lái)源，不僅活性高，擴(kuò)增速度快，而且臍帶血中含有豐富的造血干細(xì)胞，可塑性好，免疫原性低，大量實(shí)踐證明臍帶血來(lái)源的造血干細(xì)胞可幫助白血病患者完成造血和免疫功能的重建，采用人臍帶血作為免疫細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞來(lái)源，在保證血源充足的同時(shí)，既可避免采血給病人帶來(lái)的痛苦，又可提高細(xì)胞質(zhì)量（臍帶血內(nèi)的淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量高，增值潛力強(qiáng)，且不存在免疫抑制細(xì)胞），增強(qiáng)細(xì)胞治療效果。

本發(fā)明與現(xiàn)有的構(gòu)建方法相比，本發(fā)明構(gòu)建方法的構(gòu)建速度快，且通用性好。構(gòu)建的免疫細(xì)胞庫(kù)是各種腫瘤抗原肽效應(yīng)細(xì)胞的集合，患者可在需要進(jìn)行細(xì)胞治療時(shí)選擇合適的效應(yīng)細(xì)胞復(fù)蘇回輸，單一抗原肽產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞回輸能降低移植物抗宿主反應(yīng)，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞靶向性，減少等待細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，把握最佳治療期，提高臨床治療效果。該構(gòu)建方法將CD34^＋細(xì)胞誘導(dǎo)成DC細(xì)胞，進(jìn)而可增加負(fù)載抗原的DC數(shù)量，亦能在共培養(yǎng)過(guò)程中更好地刺激懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)；并且，利用單一腫瘤特異性抗原肽對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載，并根據(jù)腫瘤臨床檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行組合應(yīng)用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞治療的靶向性，降低移植物抗宿主病發(fā)生幾率，提高治療安全性?？鼓齽┎徊捎肊DTA,EDTA是鈣鎂等離子螯合劑，能夠抑制核酸酶的活性，影響細(xì)胞分裂。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液采用5%的DMSO，DMSO能顯著地改變細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性，抑制蛋白的合成；改變細(xì)胞的呼吸功能，使細(xì)胞耗氧量下降；它還是一種自由基清除劑，可減輕冷凍及復(fù)溫過(guò)程中產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞的損害，但DMSO有一定的毒性，并且研究表明5%濃度的DMSO比10%濃度的 DMSO更有利于減少CD34^＋細(xì)胞的凋亡和壞死，凍存后細(xì)胞的活力也高。

附圖說(shuō)明

圖1為培養(yǎng)至第6天時(shí)，初分化的DC細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為5×。

圖2為培養(yǎng)至第9天時(shí)，成熟的DC細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為20×。

圖3為培養(yǎng)至第7天時(shí)，CIK細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為20×。

圖4為培養(yǎng)至第9天時(shí)，CIK細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為20×。

圖5為培養(yǎng)至第15天時(shí)，共培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為20×。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1。

本實(shí)施例提供一種人臍帶血免疫細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟。

步驟1、臍帶血的采集及運(yùn)輸。

需要采集：臍帶血采集時(shí)需對(duì)母體血和臍帶血進(jìn)行傳染病篩查，并記錄臍帶血內(nèi)CD34^＋細(xì)胞數(shù)，CD34^＋細(xì)胞的數(shù)目跟造血干細(xì)胞的數(shù)目直接相關(guān)，而本實(shí)施例的DC細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化而來(lái)，對(duì)CD34^＋細(xì)胞的數(shù)量要求是不低于1×10⁵，篩查合格后方可使用。臍帶血采集后需加入抗凝劑，抗凝劑為肝素。血樣需在4℃條件下保存，12h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

步驟2、分離單個(gè)核細(xì)胞。

（1）稀釋血樣本：將血液分裝至無(wú)菌離心管每管25ml，1200g條件下離心處理10min， 然后將上部血漿層用移液管吸出，下層為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板等有形成分；用生理鹽水稀釋剩余的有形成分，并充分混勻，定容至45ml，得到稀釋的血標(biāo)本。

（2）離心處理：取稀釋的血標(biāo)本，緩慢加入裝有人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，批?hào)1501012600）的無(wú)菌離心管中，500g條件下離心處理30min。

（3）細(xì)胞處理：離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，由下到上分別為：紅細(xì)胞層、粒細(xì)胞層、人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll層、單個(gè)核細(xì)胞層和血漿生理鹽水層；吸取血漿生理鹽水層棄之，直至距單個(gè)核細(xì)胞層5mm處；將粒細(xì)胞層之上的所有液體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，向離心管中補(bǔ)充與轉(zhuǎn)移液體等體積的生理鹽水，混勻后300g離心10min，去除上清，得到單個(gè)核細(xì)胞。

步驟3、將單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的CD34^＋細(xì)胞誘導(dǎo)成DC細(xì)胞，從而增加貼壁細(xì)胞總量。

用AIM-V培養(yǎng)基（Gibco無(wú)血清T細(xì)胞培養(yǎng)基）將單個(gè)核細(xì)胞調(diào)整到2-5×10⁶/ml，之后接種至T75培養(yǎng)瓶中，每瓶約接種20ml細(xì)胞懸液；向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入DC誘導(dǎo)因子1ml（成分為：50ng/ml的rhSCF（重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、30ng/ml的rhFLT-3L（重組人Fms樣酪氨酸激酶受體3-配體）、30ng/ml的TPO（促血小板生成素）、20ng/ml的rhIL-3（人重組白介素3）、20ng/ml的rhIL-11（人重組白介素11）；均為商業(yè)購(gòu)買(mǎi)），置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)至第2天時(shí)，加入1000U/ml的rhGM-CSF（重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子）200ul、500U/ml rhIL-4（重組人白介素4）200ul和500U/ml 的rhIL-15（重組人白介素15）200ul，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

步驟4、分離來(lái)自單核細(xì)胞層和Ficoll層的懸浮的淋巴細(xì)胞。

培養(yǎng)至第3天時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中，再緩慢往T75瓶中加入20ml生理鹽水，輕輕晃動(dòng)洗滌T75瓶，收集殘留非貼壁細(xì)胞，即懸浮的淋巴細(xì)胞。

步驟5、選擇腫瘤抗原肽對(duì)DC細(xì)胞進(jìn)行抗原負(fù)載，獲得成熟的DC細(xì)胞。

向洗滌后的T75培養(yǎng)瓶中加入30ml AIM-V培養(yǎng)基，加入1500ng的rhSCF、900ng的rhFLT-3L、900ng的TPO、30000U的rhGM-CSF和15000U rhIL-4，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。

當(dāng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至第6天時(shí)，見(jiàn)圖1，半量換液，200g離心處理10min，回收移出液中的懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充20000U rhGM-CSF和10000UrhIL-4，并加入選定的特異性腫瘤抗原肽（肺癌的CEA,CK19抗原）進(jìn)行負(fù)載，置37℃、5% CO₂二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。

當(dāng)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，加入1000U/ml 的rhTNF-α（人重組腫瘤壞死因子-α）300ul，置37℃、5% CO₂二氧化碳培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)。

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至第9天左右時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，部分細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞長(zhǎng)出許多突出的樹(shù)突，細(xì)胞變?yōu)槊虪顟腋〖?xì)胞，見(jiàn)圖2，即得到成熟的DC細(xì)胞，終止培養(yǎng)。

將添加誘導(dǎo)因子的臍血組記為A組，未添加誘導(dǎo)因子的臍血組記為B組，按照CD80，CD86，HLA-DR，CD1a⁺細(xì)胞標(biāo)志物比例計(jì)數(shù)，比較各組DC細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1：各組DC細(xì)胞數(shù)量表。

從表1中可知：添加了細(xì)胞誘導(dǎo)因子的A組所得的DC細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未添加的B組所得的DC數(shù)量，說(shuō)明所添加的誘導(dǎo)因子成功誘導(dǎo)擴(kuò)增了由臍血CD34⁺細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的DC細(xì)胞。

步驟6、對(duì)懸浮的淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲得CIK細(xì)胞。

將步驟4中的懸浮淋巴細(xì)胞200g離心10min，棄上清，用AIM-V培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至0.5-2.0×10⁶/ml，接種到培養(yǎng)袋中，加入1000U/ml的IFN-γ300ul（γ干擾素）混勻，置37℃、5.0% CO₂的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)24h后，向二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)得到的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，加入2000U/ml的rhIL-2（白介素2）300ul、500U/ml的rhIL-15（白介素15）300ul、50ng/ml的CD3（單克隆抗體）300ul。

根據(jù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，每2天2倍添加培養(yǎng)液AIM-V培養(yǎng)基, 并補(bǔ)加培養(yǎng)液終體積1%的4000U/mlrhIL-2。

當(dāng)培養(yǎng)至第7天時(shí)，將培養(yǎng)袋內(nèi)的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到WAVE Bioreactor system 10中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)8天，獲得CIK細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞呈橢圓形，可見(jiàn)小的細(xì)胞克隆團(tuán)，見(jiàn)圖3。

步驟7、將DC細(xì)胞加入CIK細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模共培養(yǎng)。

將步驟5收集的成熟DC細(xì)胞1200r離心處理10min，用AIM-V培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入步驟6中的WAVE Bioreactor system 10中，與懸浮細(xì)胞共同培養(yǎng)。逐漸添加AIM-V培養(yǎng)基，并補(bǔ)加培養(yǎng)液終體積1%的4000U/mlrhIL-2和500U/ml rhIL-15。

共同培養(yǎng)至第9天時(shí)，見(jiàn)圖4，可見(jiàn)較大的細(xì)胞克隆團(tuán)。共同培養(yǎng)至第15天時(shí)，培養(yǎng)容器內(nèi)的細(xì)胞可擴(kuò)增至6×10¹⁰個(gè)（50mL的臍帶血），1200r離心10min收集共培養(yǎng)的細(xì)胞，即為所需的免疫細(xì)胞（DC-CIK細(xì)胞）。細(xì)胞共培養(yǎng)后，DC細(xì)胞把T細(xì)胞和CIK細(xì)胞聚集到周?chē)瓿煽乖倪f呈，見(jiàn)圖5，圖中可看到明顯的兩團(tuán)細(xì)胞的聚集，中間為DC細(xì)胞。

步驟8、對(duì)成熟的DC-CIK細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

同時(shí)選取一名肺癌病人，提取其血液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括流式檢測(cè)、無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)和內(nèi)毒素檢測(cè)等。進(jìn)行細(xì)胞免疫表型的比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2：細(xì)胞免疫表型的比較（%）。

由表2可知：臍帶血來(lái)源的免疫細(xì)胞表面抗原表達(dá)率優(yōu)于病人自體血的免疫細(xì)胞表型；臍帶血來(lái)源的免疫細(xì)胞在凍存前后免疫表型基本無(wú)變化。

步驟9、檢測(cè)合格后放入免疫細(xì)胞庫(kù)凍存，并建立細(xì)胞檔案；所述免疫細(xì)胞庫(kù)是針對(duì)不同腫瘤抗原肽的多種效應(yīng)細(xì)胞的集合；該種細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建即可避免抽血給病人帶來(lái)的痛苦，又可減少患者因細(xì)胞培養(yǎng)增加的住院時(shí)間。

將收集的免疫細(xì)胞按照0.1-10×10⁸/ml的密度與預(yù)冷的細(xì)胞凍存液混合，裝于細(xì)胞凍存管或凍存袋內(nèi)，附上標(biāo)簽，標(biāo)簽上描述清楚所負(fù)載的腫瘤抗原肽種類(lèi)，經(jīng)程序降溫儀以 -1-3℃/min的速度降溫后，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。

細(xì)胞檔案詳細(xì)記錄抗原肽負(fù)載類(lèi)型，細(xì)胞檔案需建立電子版檔案和紙質(zhì)版檔案留存查檔。

所述細(xì)胞凍存液配方為5%的DMSO，10%的羥乙基淀粉，85%穩(wěn)定劑，配制完成后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。穩(wěn)定劑為25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培養(yǎng)基。

用于針對(duì)DC-CIK的細(xì)胞凍存液，通過(guò)降低DMSO用量，減輕對(duì)免疫細(xì)胞的侵襲損害，提高細(xì)胞復(fù)蘇后的質(zhì)量。凍存液中不同DMSO濃度，在相同凍存時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞活率的比較結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3：不同DMSO濃度凍存后的細(xì)胞活率比較。

由表3可知：隨著凍存液中DMSO濃度的增加，在相同凍存時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞活率呈明顯的下降趨勢(shì)，因此，在免疫細(xì)胞庫(kù)的建設(shè)中，所用凍存液DMSO的濃度越低越有利于保護(hù)細(xì)胞活率，5%為最佳。

步驟10、根據(jù)肺癌患者的臨床診斷從免疫細(xì)胞庫(kù)內(nèi)選擇效應(yīng)細(xì)胞，復(fù)蘇培養(yǎng)24h后回輸。

臨床診斷肺癌，其常規(guī)腫瘤標(biāo)志物主要包括CEA、CK19，即可從細(xì)胞庫(kù)內(nèi)提取負(fù)載CEA和CK19的效應(yīng)細(xì)胞（DC-CIK細(xì)胞）。

用AIM-V培養(yǎng)基重懸復(fù)蘇后的DC-CIK細(xì)胞，并按照4.0-6.0×10⁶/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，按照500U/ml的濃度加入rhIL-2、rhIL-6（白介素6）、rhIL-15，培養(yǎng)24h后，200g離心10min，洗滌，收集免疫細(xì)胞進(jìn)行回輸。所述復(fù)蘇培養(yǎng)過(guò)程中，增加了rhIL-6、rhIL-15的使用，促進(jìn)凍存后細(xì)胞亞型的恢復(fù)。穿孔素表達(dá)水平比較結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4：穿孔素表達(dá)水平比較（%）。

由表4可知：免疫細(xì)胞凍存后其分泌穿孔素的量明顯下降，但使用本發(fā)明實(shí)施例1提供的因子組合培養(yǎng)24h后，即可恢復(fù)至凍存前水平。