一種植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法及檢測方法
【專利摘要】一種植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法及檢測方法，屬于病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用納米功能材料羧基修飾短臂碳納米管，通過Dip-Dry技術(shù)對實驗濾紙進行包裹，并在包裹過程中在包裹液中加入西瓜花葉病毒二號（WMV-2）的高特異性抗體，從而制備出能夠特異性檢測西瓜花葉病毒二號的紙質(zhì)檢測傳感器。檢測靈敏度為0.1nmol/L，與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有相當(dāng)?shù)臋z測靈敏度，整個過程不超過30min，檢測時間大大縮短，顯著的提高了檢測效率。在檢測過程中，只需要更換紙質(zhì)檢測傳感器包裹液中抗體種類，即可以得到對應(yīng)植物病毒的紙質(zhì)檢測傳感器。
【專利說明】一種植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法及檢測方法，屬于病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]西瓜花葉病毒(Water melon mosaic virus-2, WMV-2)為馬鈴暮Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)重要成員，主要通過多種姆蟲以非持久性方式進行傳播。Webb和Scott根據(jù)寄主范圍的差異血清學(xué)關(guān)系及交互保護作用的有無把WMV分為WMV-1和WMV-2兩株系，后來Purcifull根據(jù)病毒在寄主上的反應(yīng)及血清學(xué)關(guān)系認為WMV-1 是番木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)的西瓜株系(PRSV-W), WMV-2株系即是現(xiàn)在的WMV。
[0003]自然條件下，西瓜花葉病毒可侵染葫蘆科藜科豆科等27科170多種植物，主要引起花葉葉片畸形等癥狀，世界很多國家都已報道了西瓜花葉病毒對葫蘆科作物不同程度的危害，很多國家的葫蘆科作物都受到了 WMV不同程度的危害。
[0004]目前，植物病毒的檢測方法主要采用分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測。分子生物學(xué)檢測技術(shù)靈敏度高，但存在RNA抽提繁瑣且易降解的問題。血清學(xué)檢測由于其操作簡單且能同時處理大量樣品而被廣泛采用，但需要購買價格昂貴的血清學(xué)檢測試劑盒，并且檢測結(jié)果的準確性取決于抗體的質(zhì)量。
[0005]在這種情況下，建立一種快速靈敏特異性好的WMV檢測方法尤為重要。電化學(xué)工作站是電化學(xué)測量系統(tǒng)的簡稱，是電化學(xué)研究和教學(xué)常用的測量設(shè)備，可直接用于超微電極上的穩(wěn)態(tài)電流測量。納米材料是一種新型的具有特定功能的材料，碳納米管自1991年被日本科學(xué)家Ijima發(fā)現(xiàn)以來，由于其特有的結(jié)構(gòu)特點及導(dǎo)電性能，一直受到人們的高度重視，基于碳納米管的傳感器的研制也層出不窮。
[0006]本發(fā)明以碳納米管及實驗濾紙為材料，利用碳納米管對濾紙進行Dip-Dry包裹，在包裹液中加入植物病毒W(wǎng)MV-2的抗體，制備可以響應(yīng)植物病毒蛋白的高速靈敏傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是制備一種能夠快速、高靈敏地檢測植物病毒的經(jīng)濟推廣型傳感器。
[0008]本發(fā)明的目的之二是建立基于制備的植物病毒傳感器的快速、高靈敏檢測方法及技術(shù)指標(biāo)。
[0009]本發(fā)明的目的之三是在發(fā)明目的一、二的基礎(chǔ)上，建立的通用型植物病毒傳感器的制備及檢測技術(shù)。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法，其制備步驟為:
(I)碳納米管-苯乙烯磺酸鈉PSS溶液的制備:將PSS分散于水溶液中得到質(zhì)量濃度為12.5%的PSS水溶液，再將水溶性的羧基修飾的短臂碳納米管分散于PSS水溶液中，使碳納米管終濃度為30mg/mL，超聲儀中100W、40KHz功率超聲處理6h使得碳納米管在PSS水溶液中充分分散；
(2)抗體-碳納米管PSS溶液的制備:步驟(I)制備的碳納米管-PSS水溶液分散均勻后冷卻至室溫，加入植物病毒抗體溶液，得到抗體終濃度為15 μ g/mL的抗體-碳納米管PSS溶液；
(3)傳感器的制備:將固定長寬度的濾紙浸沒到步驟(2)制備的抗體-碳納米管PSS溶液中，浸泡IOmin后取出，冷凍干燥后再次浸沒到抗體-碳納米管PSS溶液中IOmin后取出，冷凍干燥；其反復(fù)循環(huán)操作13個循環(huán)，4°C密封保存，即制得植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
[0011]所述植物病毒抗體為西瓜花葉病毒二號WMV-2抗體、即制得西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器；更換西瓜花葉病毒二號WMV-2抗體為建蘭花葉病毒抗體或齒舌蘭環(huán)斑病毒抗體，即制得建蘭花葉病毒或齒舌蘭環(huán)斑病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
[0012]所述植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，步驟為:以植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極，以通用型植物病毒配置系列標(biāo)準濃度的溶液，建立檢測通用性植物病毒的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線；檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品液中的通用型毒素含量。
[0013]當(dāng)所述病毒為西瓜花葉病毒時，具體步驟如下:
(1)受西瓜花葉病毒侵染的植物葉片標(biāo)本，加入2倍體積0.2mol/L、pH7.4、含質(zhì)量濃度為1%巰基乙醇的磷酸鈉緩沖溶液，勻漿，過濾，濾液10000r/min離心5min，上清提取液備用；
(2)所制得的西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在電化學(xué)工作站控制下，記錄隨著時間流經(jīng)工作電極的電流，即1-t曲線；體系為PH7.9 Tris-HCl緩沖溶液，30°C下進行檢測；
(3)分別向緩沖溶液體系中加入WMV-2標(biāo)準品溶液直至體系中WMV-2病毒終濃度分另Ij 為 0.25nmol/L, 0.5nmol/L, lnmol/L, 2nmol/L, 4nmol/L, 8nmol/L, 12nmol/L, 16nmol/L,20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分別記錄每次檢測的 i_t 曲線；
(4)以每次記錄的1-t曲線的穩(wěn)定電流值為縱坐標(biāo)，以所記錄的電流值所對應(yīng)的WMV-2濃度為橫坐標(biāo)，建立電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線；
(5)在相同條件下，檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品上清提取液中的WMV-2含量。
[0014]通過對植物病毒傳感器制備過程中使用抗體的種類的改變，建立通用型的植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器及檢測方法。
[0015]一種通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法，更換植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器制備方法的步驟(2)中使用的抗體的種類，改用建蘭花葉病毒抗體或齒舌蘭環(huán)斑病毒抗體，用西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法相同的條件，制備針對對應(yīng)植物病毒檢測用的通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
[0016]所制備的通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，以所制備的通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極；以通用型植物病毒更換WMV-2系列溶液；用西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法相同的條件，建立檢測通用性植物病毒的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線；檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品液中的通用型毒素含量；
所述通用型植物病毒分別為建蘭花葉病毒或齒舌蘭環(huán)斑病毒。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種通用型植物病毒快速、方便、高靈敏紙質(zhì)傳感器的制備及使用方法，從而應(yīng)用于植物病毒的快速靈敏檢測。本發(fā)明檢測靈敏度為
0.lnmol/L，與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有相當(dāng)?shù)臋z測靈敏度，但整個過程不超過30min，檢測時間大大縮短，顯著的提高了檢測效率。在檢測過程中，只需要更換紙質(zhì)檢測傳感器包裹液中抗體種類，即可以得到對應(yīng)植物病毒的紙質(zhì)檢測傳感器。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1制得的西瓜花葉病毒W(wǎng)MV-2紙質(zhì)檢測傳感器的照片。0、3、8、13表示濾紙浸入到抗體-碳納米管PSS溶液中浸泡、冷凍干燥的循環(huán)操作次數(shù)。
[0019]圖2基于不同包裹次數(shù)的紙質(zhì)傳感器的穩(wěn)定電流值。包裹次數(shù)從上至下分別為13、10、8、3.圖3基于制備的WMV-2傳感器的檢測結(jié)果的電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線。
【具體實施方式】
[0020]以下通過實施例來對本發(fā)明予以進一步的說明，下列實施例僅用于舉例說明，本
【發(fā)明內(nèi)容】
并不局限于此。
[0021]實施例1制備西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器
(1)碳納米管-PSS溶液的制備:將PSS分散與水溶液中得到質(zhì)量濃度為12.5%的PSS水溶液，再將水溶性的羧基修飾短臂碳納米管分散于PSS水溶液中，使碳納米管終濃度為30mg/mL，超聲儀中100W、40KHz功率超聲處理6h使得碳納米管在PSS水溶液中充分分散；
(2)抗體-碳納米管PSS溶液的制備:步驟(I)制備的碳納米管PSS水溶液分散均勻后冷卻至室溫，加入一定濃度的WMV-2抗體溶液，得到抗體終濃度為15 μ g/mL的抗體-碳納米管PSS溶液；
(3)傳感器的制備:將固定長寬度6X0.6cm的濾紙浸沒到步驟(2)制備的抗體-碳納米管PSS溶液中，IOmin后取出，冷凍干燥，再次浸沒到抗體_碳納米管PSS溶液中IOmin后取出，冷凍干燥，反復(fù)循環(huán)操作13個循環(huán)，4°C低溫密封保存，即制得西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
[0022]實施例2植物病毒的快速高靈敏檢測方法
1、受西瓜花葉病毒侵染的植物葉片標(biāo)本，加入2倍體積0.2mol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH7.4，含1%巰基乙醇)，勻漿，過濾，濾液10000r/min離心5min，上清提取液備用；
2、以所制得的西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在電化學(xué)工作站控制下，記錄隨著時間流經(jīng)工作電極的電流，即1-t曲線.3、優(yōu)化體系緩沖溶液及溫度，使在體系為pH7.9 Tris-HCl緩沖溶液，30°C下進行檢測時響應(yīng)信號最強；
4、分別向緩沖溶液體系中加入WMV-2蛋白溶液直至體系中WMV-2蛋白終濃度分別為Onmol/L,0.25nmol/L,0.5nmol/L,lnmol/L,2nmol/L,4nmol/L,8nmol/L,12nmol/L,16nmol/L, 20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分別記錄每次檢測的 i_t 曲線；
5、以每次記錄的1-t曲線的穩(wěn)定電流值為縱坐標(biāo)，以所記錄的電流值所對應(yīng)的WMV-2濃度為橫坐標(biāo)，建立檢測WMV-2的電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線；
6、相同條件下檢測樣品上清提取液，確定檢測樣品上清提取液中的WMV-2蛋白的含量。
[0023]實施例3
更換實施例1的步驟2中使用的抗體的種類(建蘭花葉病毒抗體或齒舌蘭環(huán)斑病毒抗體)，制備針對不同植物病毒檢測用的紙質(zhì)檢測傳感器，建立通用型傳感器的制備技術(shù)。
[0024]優(yōu)化通用型傳感器的檢測條件，建立通用型傳感器的檢測方法及技術(shù)標(biāo)準。
[0025]以所制備的通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，以所制備的通用型植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極；以通用型植物病毒更換WMV-2系列溶液；用西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法相同的條件，建立檢測通用性植物病毒的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線；檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品上清提取液中的植物病毒含量。
【權(quán)利要求】
1.一種植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法，其特征在于步驟為: (1)碳納米管-苯乙烯磺酸鈉PSS溶液的制備:將PSS分散于水溶液中得到質(zhì)量濃度為12.5%的PSS水溶液，再將水溶性的羧基修飾的短臂碳納米管分散于PSS水溶液中，使碳納米管終濃度為30mg/mL，超聲儀中100W、40KHz功率超聲處理6h使得碳納米管在PSS水溶液中充分分散； (2)抗體-碳納米管PSS溶液的制備:步驟(I)制備的碳納米管-PSS水溶液分散均勻后冷卻至室溫，加入植物病毒抗體溶液，得到抗體終濃度為15 μ g/mL的抗體-碳納米管PSS溶液； (3)傳感器的制備:將固定長寬度的濾紙浸沒到步驟(2)制備的抗體-碳納米管PSS溶液中，浸泡IOmin后取出，冷凍干燥后再次浸沒到抗體-碳納米管PSS溶液中IOmin后取出，冷凍干燥；其反復(fù)循環(huán)操作13個循環(huán)，4°C密封保存，即制得植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的制備方法，其特征在于:所述植物病毒抗體為西瓜花葉病毒二號WMV-2抗體，即制得西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器；更換西瓜花葉病毒二號WMV-2抗體為建蘭花葉病毒抗體或齒舌蘭環(huán)斑病毒抗體，即制得建蘭花葉病毒或齒舌蘭環(huán)斑病毒紙質(zhì)檢測傳感器。
3.權(quán)利要求1所述方法制備的植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，其特征在于步驟為:以植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極，以通用型植物病毒配置系列標(biāo)準濃度的溶液，建立檢測通用性植物病毒的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線；檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-植物病毒濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品液中的通用型毒素含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，其特征在于所述病毒為西瓜花葉病毒時，具體步驟如下: (1)受西瓜花葉病毒侵染的植物葉片標(biāo)本，加入2倍體積0.2mol/L、pH7.4、含質(zhì)量濃度為1%巰基乙醇的磷酸鈉緩沖溶液，勻漿，過濾，濾液10000r/min離心5min，上清提取液備用； (2)所制得的西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測傳感器為工作電極，Pt電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在電化學(xué)工作站控制下，記錄隨著時間流經(jīng)工作電極的電流，即1-t曲線；體系為PH7.9 Tris-HCl緩沖溶液，30°C下進行檢測； (3)分別向緩沖溶液體系中加入WMV-2標(biāo)準品溶液直至體系中WMV-2病毒終濃度分另Ij 為 0.25nmol/L, 0.5nmol/L, lnmol/L, 2nmol/L, 4nmol/L, 8nmol/L, 12nmol/L, 16nmol/L,20nmol/L, 40nmol/L, 80nmol/L, 160nmol/L,分別記錄每次檢測的 i_t 曲線； (4)以每次記錄的1-t曲線的穩(wěn)定電流值為縱坐標(biāo)，以所記錄的電流值所對應(yīng)的WMV-2濃度為橫坐標(biāo)，建立電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線； (5)在相同條件下，檢測樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-WMV-2濃度標(biāo)準曲線對照，確定檢測樣品上清提取液中的WMV-2含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述植物病毒紙質(zhì)檢測傳感器的檢測方法，其特征在于:所述植物病毒分別為西瓜花葉病毒、建蘭花葉病毒或齒舌蘭環(huán)斑病毒。
【文檔編號】G01N27/26GK103995031SQ201410255539
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】馬偉, 胥傳來, 孔德昭, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)