一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，包括：PAA?PBA的合成，PAA?PBA是由聚丙烯酸與3?氨基苯硼酸半硫酸鹽在交聯(lián)劑N?羥基丁二胺磺酸鈉和N?(3?二甲氨基丙基)?N'?乙基?碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下發(fā)生縮合反應(yīng)而生成；將石墨電極打磨后，在二次水中超聲30 s，吹干后即可作為使用的工作電極。本發(fā)明首次制備通過(guò)硼酸?二醇特異性識(shí)別作用構(gòu)筑的層層組裝(layer?by?layer,LbL)雙酶薄膜在pH可控的生物電催化中應(yīng)用；獲得了pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器，在熱解石墨(PG)電極上構(gòu)筑了{(lán)PAA?PBA/HRP/PAA?PBA/GOD}n LbL薄膜。
【專利說(shuō)明】
一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于酶反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器由于酶的高選擇性和酶催化反應(yīng)的高靈敏度而 引起了研究者們的廣泛關(guān)注。在這類生物傳感器中，將兩種或多種酶固定在同一電極表面 是特別令人感興趣的，這不僅是因?yàn)槠湓诜治鰬?yīng)用中的性能可以獲得改善，而且還可以幫 助人們更好地理解真實(shí)生命體系中酶反應(yīng)的機(jī)理。雙酶或者多酶耦合的電催化反應(yīng)可以模 擬細(xì)胞中多種酶之間發(fā)生的連續(xù)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并為生命體系中多酶催化反應(yīng)的機(jī)理研究 提供工作模型。用于測(cè)定葡萄糖的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(G0D)的雙酶電化 學(xué)生物傳感器最早是由Kulys等提出的，并在此后得到了快速的發(fā)展。現(xiàn)今，葡萄糖的測(cè)定 在許多實(shí)際工作中都有著非常重要的意義，例如臨床中糖尿病的診斷，食品工業(yè)中廢水的 處理等。因此HRP/G0D雙酶電極具有其內(nèi)在的吸引力和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在此體系中，GOD在氧的 存在下催化氧化葡萄糖，現(xiàn)場(chǎng)生成的H 2O2可以作為第二種酶HRP的底物，并在溶液中電活性 媒介體的作用下在電極表面被HRP催化還原為水。通過(guò)這樣的雙酶催化反應(yīng)，葡萄糖的檢測(cè) 原理便從原來(lái)單獨(dú)采用GOD時(shí)的電化學(xué)催化氧化過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)樵谳^溫和的電位條件下發(fā)生的 H2O2的電化學(xué)催化還原過(guò)程，由此可以避免某些共存的電活性物質(zhì)的干擾，使傳感器的選擇 性得到極大的提高。此外，這種方法還可以避免高濃度H 2O2對(duì)HRP的損傷。然而，基于雙酶體 系的PH開(kāi)關(guān)的生物電催化傳感器報(bào)道很少。
[0003] 通過(guò)硼酸-二醇特異性作用，由兩種糖基酶和含有PBA基團(tuán)的聚合物構(gòu)筑可調(diào)控的 雙酶?jìng)鞲衅鞅∧る姌O屬于技術(shù)空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，旨在 解決以硼酸-二醇特異性作用為成膜驅(qū)動(dòng)力，由含有PBA基團(tuán)的聚合物和糖基酶(HRP和G0D) 構(gòu)筑可調(diào)控的雙酶?jìng)鞲衅鞅∧る姌O屬于技術(shù)空白的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法，所述pH 調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法包括以下步驟： 步驟一，PAA-PBA的合成，PAA-PBA是由丙烯酸(PAA)與3-氨基苯硼酸半硫酸鹽(PBA)在 交聯(lián)劑N-羥基丁二胺磺酸鈉(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 存在的條件下發(fā)生縮合反應(yīng)而生成；各反應(yīng)組分的比例分別為：54% PAA，21.5% PBA， 2.3% NHS, 22% EDC0
[0006] 步驟二，將石墨電極在600目的金相砂紙打磨后，在二次水中超聲30 s，吹干后即 可作為使用的工作電極。
[0007] 進(jìn)一步，所述PAA-PBA的合成的化學(xué)方程式如下：
進(jìn)一步，所述PAA-PBA的合成的具體步驟如卜： 第一步，將0.57 g的PAA水溶液用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(20 mL，50 mM)稀釋， PAA水溶液含有2.77 mmol單體;并將pH調(diào)至8.5;將3-氨基苯硼酸半硫酸鹽(20 mL，61 mM) 同樣溶于pH 8.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸99.5%緩沖溶液(20 mL，50 mM)中；然后兩種溶液混 合； 第二步，逐滴加入含有N-羥基丁二胺磺酸鈉（4 mL，31 mM)的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩 沖溶液(50 mM，pH 8.5)，并攪拌 10 min; 第三步，將含有N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(4 mL，310 mM)的4-羥 乙基哌嗪乙磺酸溶液(50 mM，pH 8.5)加入混合溶液中，室溫下攪拌12 h; 第四步，將溶液透析一周以除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAA-PBA， 為白色粉末狀固體。
[0008] 進(jìn)一步，所述步驟二具體包括： 第一步，將處理好的帶有負(fù)電荷的PG電極首先浸入帶有正電荷的殼聚糖CS溶液（I mg mL-S pH 5.0)中20 min，在PG表面形成一層CS前驅(qū)膜； 第二步，然后將PG/CS電極交替浸入PAA-PBA (I mg mL-SpH 9.0)、辣根過(guò)氧化物HRP (I mg mL-SpH 7.4,等電點(diǎn)為8.9)、葡萄糖氧化酶GOD (I mg mL-SpH 7.4,等電點(diǎn)為4.2) 水溶液中各30 min。
[0009] 第三步，每次溶液轉(zhuǎn)換后均用水清洗并吹干，PAA-PBA能夠和兩種糖酶HRP和GOD通 過(guò)硼酸-二醇特異性識(shí)別作用相結(jié)合，在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD四個(gè) 單層的LbL薄膜； 第四步，主要通過(guò)PAA-PBA和糖基酶之間的硼酸-二醇特異性相互作用，重復(fù)第一步-第 三步直到形成所需的四層數(shù)(η )，表示為{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} n。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方 法制備的PH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器，所述pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器包括:聚 合物PAA-PBA和含有糖殘基的辣根過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶。采用石英晶體微天平的監(jiān) 測(cè)了薄膜電極{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA/GOD} 4 上組裝的PAA-PBA、HRP、G0D 的質(zhì)量分別為 1392 ng， 626 ng， 557 ng〇
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種生物電化學(xué)催化方法，所述方法包含所述pH調(diào)控 的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法制備的pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器。
[0012] 本發(fā)明提供的pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，合成了既含有I3BA 基團(tuán)又含有"自由的"羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)PAA-PBA;其中硼酸基團(tuán)可以分別與糖酶HRP和 GOD表面的甘露糖和葡萄糖糖殘基以"硼酸-二醇"特異性相互作用為成膜驅(qū)動(dòng)力，而不受限 于靜電作用驅(qū)動(dòng)力，在石墨電極表面構(gòu)筑層層組裝薄膜;同時(shí)，PAA-PBA分子中大量的"自由 的"羧基城 3約為6.0)可以根據(jù)環(huán)境pH值的不同而帶有不同的電荷，表現(xiàn)出pH敏感的刺激-響應(yīng)性質(zhì)。通過(guò)PAA-PBA和HRP、G0D雙酶表面的糖基酶二者之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作 用在電極表面成功構(gòu)筑了 {PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n層層組裝雙酶薄膜，實(shí)現(xiàn)了雙酶 在電極上的固定；該薄膜對(duì)媒介體電活性分子例如Fe(CN) 63、氯化六氨合釕（III)(Ru (NH3)6Cl3),亞甲基藍(lán)MB，表現(xiàn)出pH敏感開(kāi)關(guān)電化學(xué)行為;雙酶電極的這種對(duì)媒介體電活性 分子PH開(kāi)關(guān)性質(zhì)可以被進(jìn)一步應(yīng)用于pH調(diào)控的以電活性小分子為媒介體的GOD對(duì)葡萄糖的 電化學(xué)催化氧化。
[0013] 本發(fā)明首次制備通過(guò)硼酸-二醇特異性識(shí)別作用構(gòu)筑的LbL雙酶薄膜在pH可控的 葡萄糖生物電催化氧化中的應(yīng)用；獲得了新型的PH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器。本發(fā)明 通過(guò)合成的聚合物PAA-PBA和含有糖殘基的雙酶(辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶)之間的 硼酸-糖基酶特異性相互作用在PG電極上成功構(gòu)筑了 {PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n LbL薄 膜;該薄膜對(duì)媒介體電活性分子例如Fe(CN)63、氯化六氨合釕（III) (Ru(NH3)6C13)，亞甲基 藍(lán)MB表現(xiàn)出pH敏感的開(kāi)關(guān)性質(zhì);雙酶薄膜對(duì)探針?lè)肿拥膒H開(kāi)關(guān)性質(zhì)可以被用于控制和調(diào)節(jié) 葡萄糖的生物電化學(xué)催化;雙酶體系的PH可調(diào)控開(kāi)關(guān)行為的研究將為發(fā)展新型的pH可控的 電化學(xué)生物傳感器提供了新的模型。
[0014] 本發(fā)明的產(chǎn)物PAA-PBA不但具有可以與糖基酶通過(guò)硼酸-二醇特異性相互作用識(shí) 別的硼酸基團(tuán)，而且具有與PAA相似的聚合物結(jié)構(gòu)，其鏈上帶有剩余的-COOH基團(tuán)。根據(jù)PAA-PBA的元素分析結(jié)果，估算出PAA-PBA中接枝有PBA的PAA羧基的含量大約為41%，在經(jīng)過(guò)交聯(lián) 反應(yīng)后，PAA-PBA分子中仍然有相當(dāng)數(shù)量的-COOH是未與I 3BA反應(yīng)的或"自由"的。PAA-PBA組 分之所以對(duì)pH很敏感，這是因?yàn)槠浜邢喈?dāng)量的對(duì)環(huán)境pH敏感的自由的-COOH基團(tuán)。由于 PAA的pKa約為6.0,因此在pH > 6.0時(shí)，羧基會(huì)發(fā)生離子化，使PAA-PBA帶有負(fù)電荷;在pH〈 6.0時(shí)，由于羧基的質(zhì)子化而不帶電荷。打磨后的plane PG電極暴露出一些edge面，因此既 具有疏水性也具有一定親水性。由于edge面的碳被氧化后連接有0-，0!Γ等基團(tuán)，因此表面帶 一定負(fù)電荷。
[0015] 本發(fā)明主要通過(guò)PAA-PBA和糖基酶之間的硼酸-二醇特異性相互作用，重復(fù)第一 步-第三步直到形成所需的四層數(shù)(η)，表示為{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} η，這種薄膜的 組裝目前未有文獻(xiàn)報(bào)道，在業(yè)內(nèi)屬于技術(shù)空白。
[0016]
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的準(zhǔn)備方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0019] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0020] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的PH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法包括以 下步驟： S101:將0.57 g的PAA水溶液(含有2.77 mmol單體)用HEPES緩沖溶液(20 mL，50 mM) 稀釋，并將pH調(diào)至8.5;將APBA (20 mL，61 mM)同樣溶于pH 8.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES，99.5%)緩沖溶液（20 mL，50 mM)中； S102:然后將上述兩種溶液混合，逐滴加入含有NHS (4 mL，31 mM)的HEPES緩沖溶液 (50 mM，pH 8.5)，并攪拌 10 min，將含有EDC (4 mL，310 mM)的HEPES溶液（50 mM，pH 8.5) 加入上述混合溶液中，室溫下攪拌12 h; S103:將上述溶液透析一周以除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAA-PBA，為白色粉末狀固體； S104:將石墨電極(PG)在600目的金相砂紙打磨后，在二次水中超聲30 s，吹干后即可 作為實(shí)驗(yàn)中使用的工作電極，將處理好的PG電極首先浸入帶有正電荷的殼聚糖CS溶液（1 mg mL-S pH 5.0)中20 min，使之在PG表面形成一層CS前驅(qū)膜； S105:將PG/CS電極交替浸入PAA-PBA (I mg mL-SpH 9.0)、HRP(1 mg mL-^pH 7.4)、 Con A和GOD (I mg mL'pH 7.4)水溶液中各30 min，每次溶液轉(zhuǎn)換后均用水清洗并吹干， 在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD四個(gè)單層的LbL薄膜，重復(fù)上述過(guò)程直到形 成所需的四層數(shù)(η)，表示為{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} n。
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。
[0022] I. PAA-PBA的合成 PAA-PBA是由丙烯酸(PAA)與3-氨基苯硼酸半硫酸鹽(APBA)在交聯(lián)劑N-羥基丁二胺磺 酸鈉(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在的條件下發(fā)生縮合 反應(yīng)而生成的，其合成路線可用Scheme 5-1來(lái)表示。其過(guò)程為，將0.57 g的PAA水溶液(含有 2.77 mmol單體）用HEPES緩沖溶液（20 mL，50 mM)稀釋，并將pH調(diào)至8.5;將APBA (20 mL， 61 mM)同樣溶于pH 8.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，99.5%)緩沖溶液（20 mL，50 mM)中； 然后將上述兩種溶液混合。逐滴加入含有NHS (4 mL，31 mM)的HEPES緩沖溶液(50 mM，pH 8.5)，并攪拌10 min。將含有EDC (4 mL，310 mM)的HEPES溶液（50 mM，pH 8.5)加入上述混 合溶液中，室溫下攪拌12 h。然后將上述溶液透析一周以除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干 燥后得到產(chǎn)物PAA-PBA，為白色粉末狀固體； 合成路線如下：
2薄膜的組裝 將石墨電極(PG)打磨后，在二次水中超聲30 s，吹干后即可作為實(shí)驗(yàn)中使用的工作電 極。將處理好的PG電極首先浸入帶有正電荷的CS溶液(I mg mL1，pH 5.0)中20 min，使之 在PG表面形成一層CS前驅(qū)膜。然后將PG/CS電極交替浸入PAA-PBA (I mg mL'pH 9.0)、HRP (I mg mL-SpH 7.4)、Con A和GOD (I mg mL-SpH 7.4)水溶液中各30 min，每次溶液轉(zhuǎn)換 后均用水清洗并吹干，這樣就在PG/CS表面形成了 PAA-TOA/HRP/PAA-PBA-GOD四個(gè)單層的 LbL薄膜。重復(fù)上述過(guò)程直到形成所需的四層數(shù)(η)，表示為{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n。 在組裝過(guò)程中，吹干步驟通常是必要的，這樣可以使LbL薄膜更加穩(wěn)定。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述pH調(diào)控的雙酶 電化學(xué)生物傳感器的制備方法包括W下步驟： 步驟一，PAA-PBA的合成，PAA-PBA是由聚丙締酸與3-氨基苯棚酸半硫酸鹽在交聯(lián)劑N- 徑基下二胺橫酸鋼和N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下發(fā)生縮 合反應(yīng)而生成；按照質(zhì)量比各反應(yīng)組分的比例分別為：54%聚丙締酸，21.5% 3-氨基苯棚 酸半硫酸鹽，2.3% N-徑基下二胺橫酸鋼，22% N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亞胺 鹽酸鹽； 步驟二，將石墨電極在600目的金相砂紙上打磨后，在二次水中超聲30 S，吹干后即作 為使用的工作電極。2. 如權(quán)利要求1所述的抑調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述 PAA-PBA的合成的化學(xué)方程式如下：3. 如權(quán)利要求1所述的抑調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述 PAA-PBA的合成的具體步驟如下： 第一步，將0.57 g的PAA水溶液用4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖溶液稀釋，PAA水溶液含有 2.77 mmol單體;并將抑調(diào)至8.5;將3-氨基苯棚酸半硫酸鹽同樣溶于pH 8.5的4-徑乙基贓 嗦乙橫酸99.5%緩沖溶液中；然后兩種溶液混合； 第二步，逐滴加入含有N-徑基下二胺橫酸鋼的4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖溶液，并攬拌 10 min; 第Ξ步，將含有N-(3-二甲氨基丙基）-N'-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽的4-徑乙基贓嗦乙橫 酸溶液加入混合溶液中，室溫下攬拌12 h; 第四步，將溶液透析一周W除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到產(chǎn)物PAA-PBA， 為白色粉末狀固體。4. 如權(quán)利要求1所述的抑調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述 步驟二具體包括： 第一步，將處理好的PG電極首先浸入帶有正電荷的殼聚糖溶液（中20 min,在PG表面形 成一層CS前驅(qū)膜； 第二步，然后將PG/CS電極交替浸入PAA-PBA、辣根過(guò)氧化物酶、Con A和葡萄糖氧化酶 水溶液中各30 min; 第Ξ步，每次溶液轉(zhuǎn)換后均用水清洗并吹干，在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA- PBA-GOD四個(gè)單層的化L薄膜； 第四步，重復(fù)第一步-第Ξ步直到形成所需的層數(shù)η，表示為{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA- GOD}。。5. -種如權(quán)利要求1所述P的周控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法制備的抑調(diào)控的 雙酶電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述pH調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器包括：聚合物 PAA-PBA和含有糖殘基的辣根過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶，W及PAA-PBA與含有糖殘基的糖 基酶之間構(gòu)筑薄膜的驅(qū)動(dòng)力棚酸-二醇特異性相互相互作用。6. -種生物電化學(xué)催化方法，其特征在于，所述方法包含權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述抑 調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器的制備方法制備的抑調(diào)控的雙酶電化學(xué)生物傳感器。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK105842317SQ201610314562
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】姚惠琴, 史可人, 韋潔, 許紅平, 彭娟, 王明科
【申請(qǐng)人】寧夏醫(yī)科大學(xué)