本發(fā)明涉及一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學(xué)傳感器檢測銅離子的方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

Cu（Ⅱ）是人體生命健康所必需的過渡元素，與某些蛋白質(zhì)在一起，可產(chǎn)生大量對生命至關(guān)重要的酶。銅離子也是所有已知的生命形式的微量營養(yǎng)元素，它具有多種功能（Viguier， R. F. H.； Hulme，A. N. ，A sensitized europium complex generated by micromolar concentrations of copper(I): Toward the detection of copper(I) in biology. J. Am. Chem. Soc. 2006，128，11370–11371.），參與骨的形成、細(xì)胞呼吸和結(jié)締組織發(fā)展等。然而，過量的銅離子會對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，使細(xì)胞的自動調(diào)節(jié)功能受到損傷，造成嚴(yán)重的神經(jīng)變性疾病，如門克斯病，威爾遜病和阿爾茨海默氏病等（Bush，A. I.Metals and neuroscience. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000，4，184–191； Kaler，S. G.；Holmes，C. S.；Goldstein，Neonatal diagnosis and treatment of Menkes Disease.N. Engl. J. Med. 2008，358，605–614； Ala，A.；Walker， A. P.； Ashkan， K.，Wilson's disease. M. L. Lancet 2007，369，397–408）。美國環(huán)境保護署（EPA） 規(guī)定了在飲用水中銅的最大允許濃度為1.3 ppm（約20 μM）(Liu，J. W.；Lu，Y. J.， A DNAzyme catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu²⁺ ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity. Am. Chem. Soc. 2007，129，9838–9839.）。盡管如此，由于農(nóng)業(yè)和工業(yè)的廣泛使用，銅污染及其對人類潛在的毒性作用依然是一個挑戰(zhàn)。

目前，Yao Wu 等（Yao Wu；Rebecca Y. Lai，Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233）證明了Au（Ⅲ）能與腺嘌呤A形成A- Au（Ⅲ）-A結(jié)構(gòu)，首次制備了利用DNA進行識別檢測Au（Ⅲ）的簡便快速的電化學(xué)傳感器，同時指出腺嘌呤A還可與Cu（Ⅱ）等過渡金屬通過氮原子結(jié)合在一起。

當(dāng)前檢測銅離子的常規(guī)技術(shù)一般都是基于電感耦合等離子體（ICP）的方法，包括質(zhì)譜（MS）（Pavla Jungova，Jarmila Navratilova，Substrate-assisted laser desorption inductively-coupled plasma mass spectrometry for determination of copper in myeloid leukemia cells. J. Anal. At. Spectrom. 2010，25，662–668.；S. D. Richardson，Mass spectrometry in environmental sciences. Chem. Rev. 2001，101–211.），原子吸收光譜（Chan， M. S.；Huang，S. D.，Direct determination of cadmium and copper in seawater using a transversely heated graphite furnace atomic absorption spectrometer with Zeeman-effect background corrector. Talanta 2000，51，373–380. ； Lin，T. W.；Huang，S. D.，Direct and simultaneous determination of copper，chromium，aluminum，and manganese in urine with a multielement graphite furnace atomic absorptionspectrometer. Anal. Chem. 2001，73，4319–4325. ；Pourreza，N.；Hoveizavi.，R.，Simultaneous preconcentration of Cu，F(xiàn)e and Pb as methylthymol blue complexes on naphthalene adsorbent and flame atomic absorption determination. Anal. Chim. Acta 2005，549，124–128. ）和原子發(fā)射光譜法等(Becker， J. S.；Matusch，A.； Liu，Y.；Liang，P.；Guo，L.，Nanometer titanium dioxide immobilized on silica gel as sorbent for preconcentration of metal ions prior to their determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Talanta 2005，68，25–30.）。此外，也可采用熒光技術(shù)檢測銅離子（Nakorn Niamnont；Nattaporn Kimpitak；Gamolwan Tumcharern；Paitoon Rashatasakhon，Highly sensitive salicylic fluorophore for visual detection of picomole amounts of Cu²⁺.RSC Adv.2013，3 (3)，25215-25220.；Balamurugan Rathinam；Chih-Chieh Chien；Bo-Cheng Chen； Jui-Hsiang Liu，F(xiàn)luorogenic and chromogenic detection of Cu²⁺ and Fe³⁺ species in aqueous media by rhodamine–triazole conjugate. Tetrahedron.2013，69 (1)，235-241.）。這些技術(shù)通常需要繁瑣的過程，使得難以快速檢測銅離子。因此，利用可靠的技術(shù)來對銅離子進行快速檢測是非常有必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在于提供一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學(xué)傳感器檢測銅離子的方法，該方法以電化學(xué)工作站為平臺，能夠簡便、快速地檢測銅離子濃度。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學(xué)傳感器檢測銅離子的方法，按照以下步驟進行：

（1）金電極（GE, d=2 mm）處理：依次用0.3 μm和0.05 μm的Al₂O₃拋光粉打磨金電極，用MilliQ純水、無水乙醇和MilliQ純水依次超聲清洗2 min后，在0.5 M H₂SO₄溶液中用循環(huán)伏安法，掃描范圍為0.2 - 1.6 V，以掃速0.1 V /s、0.5 V /s分別掃描20圈，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線；

（2）根據(jù)文獻Yao Wu；Rebecca Y. Lai；Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233. 中的方法用緩沖液配制1.2 μM的DNA（A₁₂）溶液；緩沖液含5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4；

（3）將5.0 μL步驟（2）中的DNA（A₁₂）滴加在步驟（1）處理好的金電極表面，在4℃反應(yīng)2 h；

（4）用超純水沖洗步驟（3）中的電極表面，N₂吹干，立即浸沒在100.0 μL的2.0 mM巰基己醇（MCH）溶液中于4℃下封閉電極表面2 h；

（5）將上述步驟（4）制備的MCH/A₁₂/GE電極用二次蒸餾水浸泡4 min，N₂吹干后倒置，用于下一步檢測；

（6）取20.0 μL MilliQ純水（空白）或20.0 μL Cu²⁺ 溶液（不同濃度）于電化學(xué)檢測緩沖液中，總體積為2.0 mL，將步驟（5）中的電極浸沒于其中20 min；緩沖液含10 mM PBS、2M NaClO₄，pH 6.7；

（7）以鉑絲為輔助電極，以銀/氯化銀為參比電極，（6）中的金電極為工作電極，采用交流伏安法進行檢測，記錄空白電流值I₀和不同濃度Cu²⁺溶液的電流值I₁；

（8）以已知銅離子濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的△I（△I = I₀- I₁）為縱坐標(biāo)，繪制曲線，得到銅離子濃度和△I的線性方程，然后根據(jù)待測樣品的△I，計算對應(yīng)的銅離子濃度。

所述銅離子濃度與△I的線性方程為△I/nA = 1.148+ 0.07358 C _Cu²⁺ / μM。

步驟（2）中所述的DNA（A₁₂）的序列為從左到右5’到3’： -HS-(CH ₂)₆-AAAAAAAAAAAA-(CH₂ )₆-MB-。

步驟（3）中的DNA（A₁₂）濃度為1.2 μM，加入量為5.0 μL。

上述方法可應(yīng)用于環(huán)境水樣中銅離子濃度的檢測。

本發(fā)明具有操作簡便，靈敏度高，選擇性好，成本低等優(yōu)點。在100 nM-25 μM的濃度范圍內(nèi)對銅離子的檢測呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，檢測限可達到13 nM。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明的一種DNA修飾在金電極表面的方法簡便、快速、反應(yīng)的時間和溫度容易控制，得到的傳感器較穩(wěn)定，選擇性較好。

（2）本發(fā)明的操作步驟簡便、靈敏、便捷、成本低，而且無污染、無毒害，應(yīng)用性強。

（3）本發(fā)明在識別銅離子的過程中，能快速讀取電化學(xué)信號的數(shù)值，有利于銅離子快速檢測。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明對銅離子檢測的響應(yīng)曲線。（A）在不同銅離子濃度時所對應(yīng)的信號I₁，從低到高分別為(a): 0 μM、 (b): 0.1 μM、 (c): 1.0 μM、(d): 2.0 μM、 (e): 5.0 μM、 (f): 10 μM、 (g): 25 μM；（B）為隨著銅離子濃度的增加（100 nM-25 μM），其△I的變化。

圖2 為本發(fā)明對銅離子檢測的選擇性。從左到右為在不同干擾物質(zhì)中所示的△I信號，從左到右分別為Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺ 、 Pb²⁺、Cu²⁺和8種離子的混合溶液，銅離子的濃度為1.0 μM，所有干擾物質(zhì)的濃度均為10 μM。

具體實施方式

實施例 1

1、DNA（A₁₂）的配制，具體步驟如下：

A、用緩沖溶液5 mM PBS、0.05 M NaCl (pH 7.4) 溶解DNA（A₁₂），濃度為10 μM。分為六管，將其置于冰箱中冷凍；

所述的DNA（A₁₂）的序列為從左到右5’到3’： -HS-(CH ₂)₆-AAAAAAAAAAAA-(CH₂ )₆-MB-；

B、取100 μL 10 μM的A₁₂，加入5.0 μL 10 mM的TCEP（磷酸（2-氯乙基）酯）溶液，于4℃下過夜備用；

C、在使用前用探針固定緩沖液（5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4）稀釋至所需的濃度（1.2 μM），取5.0 μL濃度為1.2 μM的DNA（A₁₂）進行金電極表面的自組裝。

2、修飾有DNA的電化學(xué)傳感器的制備與銅離子的檢測，具體步驟如下：

（1）將電極浸泡在100 μL的2.0 mM巰基己醇（MCH）溶液中封閉電極表面2 h，以去除電極表面上的DNA非特異性吸附；

（2）將上述制備的MCH/A₁₂/GE電極用二次蒸餾水浸泡4 min，N₂吹干后倒置，用于下一步檢測；

（3）取20.0 μL MilliQ純水（空白）或Cu²⁺ 溶液（不同濃度）于電化學(xué)檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO₄，pH 6.7 )中，總體積為2.0 mL，將電極浸沒于其中20 min；

（4）采用交流伏安法(A.C.Voltammetry)進行檢測，記錄空白電流值I₀和不同濃度Cu²⁺溶液的電流值I₁。隨著銅離子濃度的增加，對應(yīng)的△I(△I= I₀- I₁)也增加，以已知銅離子濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的△I為縱坐標(biāo)，繪制曲線，得到銅離子濃度和△I的線性方程，△I /nA = 1.148+ 0.07358 C _Cu²⁺/ μM。

實施例 2

湖水中銅離子的檢測，具體步驟如下：

將湖水用0.22 μm的濾膜過濾，由于水樣基質(zhì)較復(fù)雜，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法來測定湖水中Cu²⁺ 的濃度。在測定時， 取6份500 μL體積的樣品，分別置于6個2 mL的離心管中，分別加入濃度為1.0 μM的Cu²⁺ 溶液0、100、200、300、400、500 μL，加水稀釋至1.0 mL。將修飾有DNA （A₁₂）的金電極浸沒于總體積為2.0 mL，分別含有 20.0 μL MilliQ純水（空白）或上述配制水樣的電化學(xué)檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO_4，pH 6.7）中20 min，采用交流伏安法進行檢測，檢測電位為0到 -0.7 V記錄數(shù)據(jù)。分別測定并計算空白與實驗組的電流差值△I₁、△I₂、△I ₃、△I₄、△I₅、△I₆，作電化學(xué)信號變化△I對加入的Cu²⁺濃度曲線，得到回歸方程為△I/μA= 1.0275 Ccu²⁺ / μM + 0.01543，當(dāng)△I =0時，可計算出湖水中Cu²⁺濃度為0.03 μM。以同樣的方法測得加標(biāo)回收率為105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%，結(jié)果說明本發(fā)明所述方法可用于實際水樣中銅離子的檢測。

實施例 3

對銅離子的選擇性考察，具體步驟如下：

將修飾有DNA （A₁₂）的金電極浸沒于總體積為2.0 mL，分別含有 20.0 μL Mn²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺ 溶液的電化學(xué)檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO₄、pH 6.7）中20 min，銅離子濃度為1.0 μM，所有干擾離子的濃度均為10 μM，采用交流伏安法進行檢測，檢測電位為0到 - 0.7 V，記錄數(shù)據(jù)。其結(jié)果如圖2，說明本發(fā)明所述方法對銅離子的選擇性良好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> 基于聚腺嘌呤-亞甲基藍電化學(xué)傳感器檢測銅離子的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaaaaaa aa 12