一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法。
【背景技術】
[0002]轉基因技術在生命科學的前沿領域中處于重要的地位，美國蘭德公司在“2020年全球技術革命”研宄報告中，列舉了 16個重大革命性技術，轉基因技術排名第4位。2008年，我國啟動的轉基因生物新品種培育科技重大轉項為《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》16個國家科技重大專項之一。轉基因技術的研宄之所以受到如此的重視，主要是因為它在諸多領域具有廣闊的應用前景，如所制備的轉基因動物，可作為模式動物研宄機體的發(fā)病機理和治療方法；研宄基因結構與功能的關系及胚胎發(fā)育的調控機理；改良家畜、家禽的經(jīng)濟性狀及抗病能力；保護瀕危動物；作為醫(yī)用蛋白的生物反應器等。
[0003]在哺乳類轉基因動物的制備研宄中，目前已經(jīng)建立了多種成熟的轉基因技術，如原核顯微注射技術，單精子顯微注射技術，慢病毒介導的轉基因技術，精子介導的轉基因技術、體細胞克隆介導的轉基因技術、干細胞介導的轉基因技術等。但禽類由于其特殊的發(fā)育特性，無法直接參照哺乳動物的轉基因技術體系進行操作，所以無論是國內還是國外，禽類的轉基因研宄仍比較滯后。
[0004]目前，禽類的轉基因的制備方法主要有胚盤下腔注射慢病毒法以及原始生殖細胞(PGCs)介導法。而慢病毒以其特有的優(yōu)勢所建立起的胚盤下腔注射法制備轉基因家禽的技術體系成為目前制備轉基因家禽最主要的一種方法。因此，提高慢病毒對胚盤細胞的感染效率，對于實現(xiàn)高效的轉基因家禽制備體系至關重要。

【發(fā)明內容】

[0005]針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法的技術方案。
[0006]所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于包括以下步驟:
1)種蛋的消毒:選取新鮮種蛋消毒處理后在室溫下進行溫度平衡；
2)慢病毒稀釋:取慢病毒保存液，將病毒液使用DMEM稀釋至0.5-3 X 109TU/ml ；
3)胚盤下腔顯微注射:切割步驟I)得到的種蛋的蛋殼，將種胚倒入玻璃蒸發(fā)皿中，取顯微注射針進行標記，吸取步驟2)得到的病毒稀釋液，每枚胚胎注射1-5PL的病毒稀釋液，每枚種胚注射量一致；
4)胚胎的轉殼:將注射病毒后的種胚轉入一稍大蛋殼中，薄膜封口；
5)種胚的溫度控制處理:種胚完成轉殼，進行正式孵化前，分別放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C中進行靜置，每個溫度下靜置時間為1_2天；
6)種胚的孵化:將種胚放置于38°C，相對濕度60%的孵化箱中進行正常孵化，每隔2h，90度角轉蛋一次，孵化至第3天，第2次轉殼，每隔2 h，30度角轉蛋一次，孵化出雛。
[0007]所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟I)中選取新鮮種蛋使用0.1%的新潔爾滅浸泡消毒后，75%的酒精擦拭表面，室溫平衡2h。
[0008]所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟2)中將病毒液使用DMEM稀釋至1.0-2.5X 109TU/ml。
[0009]所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟3)中每枚胚胎注射2_4μ?的病毒稀釋液。
[0010]所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟4)中種胚完成轉殼，進行正式孵化前，分別放置13-15°C、21-23°C、30-32°C中進行靜置。
[0011]本發(fā)明在慢病毒胚盤下腔注射后，完成第一次轉殼，胚胎正式孵化前通過溫度控制，延長慢病毒與胚盤細胞的接觸時間，增加病毒的感染率，從而提高轉基因家禽的制備效率。
【附圖說明】
[0012]圖1為胚盤下腔注射慢病毒法制備轉基因家禽操作流程；
圖2為轉基因雞胚熒光顯微鏡進行觀測；
圖3為不同溫度下病毒感染效率比較。
[0013]圖2中:A組:綠色熒光蛋白在腦部區(qū)域的表達出組:綠色熒光蛋白在翅膀部位的表達；(:組:綠色熒光蛋白在頭部區(qū)域的表達山組:綠色熒光蛋白在腿部區(qū)域的表達出組:綠色熒光蛋白在脊柱中的表達^組:體視鏡下全胚綠色熒光蛋白的表達。
[0014]圖3中:38°C為正常孵化的對照組；12_16°C放置后轉染效率可提高約2倍；20-24°C放置后轉染效率可提高約4倍；28-33 °C放置后轉染效率可提高約6倍。
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例來進一步說明本發(fā)明。
[0016]實施例1:一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法(如圖1所示)
1)選取新鮮種蛋，使用0.1%的新潔爾滅浸泡消毒，75%的酒精擦拭表面，室溫平衡2h ;
2)取含有綠色熒光蛋白的慢病毒(CSI1-EF-MCS-1RES2-Venus)保存液，病毒效價不低于 109，將病毒液使用 DMEM 稀釋至 0.5-3X 109TU/ml，優(yōu)選為 1.0-2.5X 109TU/ml ；
3)將準備好的蛋殼進行切割，將種胚倒入一玻璃蒸發(fā)皿中，取一顯微注射針進行標記，使用微量注射系統(tǒng)吸取病毒液，每枚種胚注射1_5 KL的病毒稀釋液，優(yōu)選為注射2_4μ?，每枚種胚注射量一致；
4)將注射病毒后的種胚轉入一稍大蛋殼中，薄膜封口；
5)種胚完成轉殼，進行正式孵化前，分別放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C進行靜置，每個溫度下靜置時間為1-2天，優(yōu)選為分別放置于13-15°C、21-23°C、30-32°C進行靜置，每個溫度下靜置時間為I天，延長病毒與胚盤細胞的接觸時間； 6)將種胚放置于38°C，相對濕度60%的孵化箱中進行正常孵化，每隔2 h，90度角轉蛋一次，孵化至第3天，第2次轉殼，每隔2 h，30度角轉蛋一次，孵化至第5天，熒光顯微鏡下觀測綠色熒光的表達，并使用流式細胞儀測定轉入綠色熒光蛋白細胞的比例，如圖2所示，A組:綠色熒光蛋白在腦部區(qū)域的表達；B組:綠色熒光蛋白在翅膀部位的表達；C組:綠色熒光蛋白在頭部區(qū)域的表達；D組:綠色熒光蛋白在腿部區(qū)域的表達；E組:綠色熒光蛋白在脊柱中的表達^組:體視鏡下全胚綠色熒光蛋白的表達。如圖3所示，通過比較，38°C為正常孵化的對照組；12_16°C放置后轉染效率可提高約2倍；20-24°C放置后轉染效率可提高約4倍；28-33 °C放置后轉染效率可提高約6倍。
【主權項】
1.一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)種蛋的消毒:選取新鮮種蛋消毒處理后在室溫下進行溫度平衡； 2)慢病毒稀釋:取慢病毒保存液，將病毒液使用DMEM稀釋至0.5-3 X 109TU/ml ； 3)胚盤下腔顯微注射:切割步驟I)得到的種蛋的蛋殼，將種胚倒入玻璃蒸發(fā)皿中，取顯微注射針進行標記，吸取步驟2)得到的病毒稀釋液，每枚胚胎注射1-5PL的病毒稀釋液，每枚種胚注射量一致； 4)胚胎的轉殼:將注射病毒后的種胚轉入一稍大蛋殼中，薄膜封口； 5)種胚的溫度控制處理:種胚完成轉殼，進行正式孵化前，分別放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C中進行靜置，每個溫度下靜置時間為1_2天； 6)種胚的孵化:將種胚放置于38°C，相對濕度60%的孵化箱中進行正常孵化，每隔2h，90度角轉蛋一次，孵化至第3天，第2次轉殼，每隔2 h，30度角轉蛋一次，孵化出雛。
2.如權利要求1所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟I)中選取新鮮種蛋使用0.1%的新潔爾滅浸泡消毒后，75%的酒精擦拭表面，室溫平衡2h。
3.如權利要求1所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟2)中將病毒液使用DMEM稀釋至1.5-2.5X 109TU/ml。
4.如權利要求1所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟3)中每枚胚胎注射2-4μ?的病毒稀釋液。
5.如權利要求1所述的一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步驟4)中種胚完成轉殼，進行正式孵化前，分別放置13-15°C、21-23°C、30-32 °C中進行靜置。
【專利摘要】一種提高慢病毒胚盤下腔注射制備轉基因家禽效率的方法，屬于生物技術領域。其包括以下步驟：1）種蛋的消毒；2）慢病毒稀釋；3）胚盤下腔顯微注射；4）胚胎的轉殼；5）種胚的溫度控制處理；6）種胚的孵化。本發(fā)明在慢病毒胚盤下腔注射后，完成第一次轉殼，胚胎正式孵化前通過溫度控制，延長慢病毒與胚盤細胞的接觸時間，增加病毒的感染率，從而提高轉基因家禽的制備效率。
【IPC分類】A01K67-027, C12N15-89
【公開號】CN104789599
【申請?zhí)枴緾N201510171588
【發(fā)明人】于福先, 潘建治, 朱志偉, 陳曉宇, 黃菁, 石銘
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月13日