Leuconodine B在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物L(fēng)euconodineB的新用途，尤其涉及LeuconodineB在制備治 療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃熱病毒（yellowfevervirus，YFV)屬于黃熱毒科黃病毒屬的成員。黃熱病毒 能夠引起黃熱病，該病為急性傳染病。國(guó)際上已將黃熱病定為檢疫傳染病，中國(guó)也將其定為 甲類傳染病。1648年，每周的YUCATAN半島首次證實(shí)黃熱病的流行。17~19世紀(jì)，此病通 過(guò)交通運(yùn)輸被帶到歐洲及北美，在差不多兩個(gè)世紀(jì)內(nèi)，黃熱病成為美、非、歐三大洲一些地 方最嚴(yán)重的瘟疫之一，造成大量人群死亡。20世紀(jì)以來(lái)，本病在北美及歐洲未再發(fā)生，但在 中、南美、非洲的一些國(guó)家和地區(qū)仍不時(shí)流行。據(jù)WH0(1983)報(bào)告，1979~1982年期間，黃 熱病在非洲發(fā)生50例，南美洲發(fā)生695例，估計(jì)實(shí)際病例數(shù)為上述報(bào)告數(shù)的35~480倍。 埃及伊蚊是主要傳播媒介。迄今為止，中國(guó)尚無(wú)病例的報(bào)道，但是這并不能使我們放松對(duì)該 病毒的警惕，因?yàn)橹袊?guó)的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜，蚊蟲(chóng)種類繁多，具備傳播條件，同時(shí)隨著國(guó)際 交流的日益頻繁，YFV傳入中國(guó)境內(nèi)的可能性非常大。
[0003] 因此，我們應(yīng)該高度重視對(duì)黃熱病毒的研究，加強(qiáng)對(duì)其的科研力度，做好相關(guān)知識(shí) 和藥物的儲(chǔ)備。
[0004] 本發(fā)明涉及的化合物L(fēng)euconodineB是一個(gè)2013年發(fā)表（AtsushiUmehara，et al. ,TotalSynthesesofLeuconoxine,LeuconodineB,andMelodinineEbyOxidative CyclicAminalFormationandDiastereoselectiveRing-ClosingMetathesis. Org.Lett. 2014, 16, 2526-2529.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型（Atsushi Umehara，etal. ,TotalSynthesesofLeuconoxine,LeuconodineB,andMelodinine EbyOxidativeCyclicAminalFormationandDiastereoselectiveRing-Closing Metathesis.Org.Lett. 2014, 16, 2526-2529.)，對(duì)于本發(fā)明涉及的LeuconodineB在制備 治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的用途屬于首次公開(kāi)，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其 對(duì)于治療或預(yù)防黃熱病毒感染活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可 能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于治療或預(yù)防黃熱病毒感染顯然具有顯著的進(jìn)步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種LeuconodineB在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染 藥物中的應(yīng)用，LeuconodineB在10.OuM濃度下對(duì)YFV的抑制率為94. 6%。而Leuconodine B在濃度為100uM條件下，Vero細(xì)胞的存活率為92. 1%。LeuconodineB能夠有效地抑制 黃熱病毒的增殖，但是對(duì)細(xì)胞毒性很小，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的 藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 所述化合物L(fēng)euconodineB結(jié)構(gòu)如式（I)所示：
[0007]
[0008] 所述LeuconodineB在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，Leuconodine B對(duì)YFV有抑制作用。
[0009] -種治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物，由LeuconodineB為活性成分添加輔料制備 而成，制備方法為取5克化合物L(fēng)euconodineB，加入糊精195克，混勻，常規(guī)壓片制成1000 片。
[0010] -種治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物，由LeuconodineB為活性成分添加輔料制備 而成，制備方法為取5克化合物L(fēng)euconodineB，加入淀粉195克，混勻，裝膠囊制成1000 粒。
[0011] 對(duì)于本發(fā)明涉及的LeuconodineB在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的用途 屬于首次公開(kāi)，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對(duì)于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制活 性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí) 用于子宮內(nèi)膜癌的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
[0012] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)euconodineB的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)（Atsushi Umehara，et al.,Total Syntheses of Leuconoxine,Leuconodine B,and Melodinine E by Oxidative Cyclic Aminal Formation and Diastereoselective Ring-Closing Metathesis. Org. Lett.2014, 16, 2526-2529.)
[0014] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
[0015] 實(shí)施例1:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)euconodine B片劑的制備：
[0016] 取20克化合物L(fēng)euconodine B加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片 機(jī)制成1000片。
[0017] 實(shí)施例2:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)euconodineB膠囊劑的制備：
[0018] 取20克化合物L(fēng)euconodineB加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻， 裝膠囊制成1〇〇〇粒。
[0019] 下面通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明其藥物活性。
[0020] 實(shí)驗(yàn)例1 :
[0021] A. LeuconodineB對(duì)Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
[0022] Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）是YFV的易感細(xì)胞。
[0023] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0024] 1 :接種Vero細(xì)胞：用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液， 以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種體積100ul;
[0025] 2:培養(yǎng)Vero細(xì)胞：在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；
[0026] 3:加入LeuconodineB:吸棄每個(gè)孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔中加入100ul用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度（0uM，0. 4uM，1. 2uM，3. 7uM，lluM， 33uM，100uM，300uM)的LeuconodineB，對(duì)照孔加不加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基 100ul;
[0027] 4:呈色：培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加MTT溶液10ul，在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下 繼續(xù)孵育4小時(shí)，然后加入Formazan溶解液，在37°C，5% (v/v)C02培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4 小時(shí)，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解；
[0028] 5:測(cè)量：在57〇nm測(cè)定吸收值（表1)。
[0029] 表1不同濃度的LeuconodineB對(duì)Vero細(xì)胞的毒性
[0032] B.LeuconodineB對(duì)YFV的抑制實(shí)驗(yàn)：
[0033] 以Vero細(xì)胞為培養(yǎng)病毒YFV的細(xì)胞，Μ0Ι為0. 1，實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0034] 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)至單層（細(xì)胞覆蓋孔底 的面積約為80%~90% )，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成 后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10% (v/v)胎牛血 清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度（0uM，0. 04uM，0. 12uM，0. 37uM，1.luM，3. 3uM，10.OuM)的 LeuconodineB，于37°C、5% (v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時(shí)，收集各個(gè)孔中的上清，做病 毒噬斑實(shí)驗(yàn)。
[0035] 病毒噬斑實(shí)驗(yàn)：在24孔板中接入Vero細(xì)胞，24小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)至單層（細(xì)胞覆蓋 孔底的面積約為80%~90%)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3% (v/v)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200ul，37°C吸附2小時(shí)。吸附完成后將各個(gè)孔的上清板 吸棄，用10% (v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45°C預(yù)熱的半固 定培養(yǎng)基[A成分：3% (v/v)FBS，2XMEM培養(yǎng)基，青霉素（美國(guó)AMRESCO)和鏈霉素（美國(guó) AMRESCO)終濃度分別為 100U/ml，0.lmg/ml;B成分：1% (w/v)的瓊脂糖（法國(guó)Biowest)。 A成分：B成分=1:1 (v/v)]，于37°C、5% (v/v)C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72小時(shí)。待噬斑 形成后用結(jié)晶紫（美國(guó)AMRESC0)染色（2% (w/v)結(jié)晶紫溶于10% (v/v)甲醛），2小時(shí)后 用流水沖去結(jié)晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對(duì)每孔產(chǎn)生的細(xì)胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù) 計(jì)算病毒的滴度（PFU/ml，PFU:plaqueformationunit斑形成單位）。PFU=病毒稀釋 度XP/V，（P:空蝕斑數(shù)目；V:接種量）。在2次不同的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表2)。
[0036]表2不同濃度的Leuconodine B對(duì)YFV滴度降低及抑制作用
[0039] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0040] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)YFV的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Leuconodine B對(duì)YFV具有很好的抑制作用， 從本質(zhì)上證明了Leuconodine B在治療YFV感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. LeuconodineB在治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，所述化合物L(fēng)euconodine B結(jié)構(gòu)如式（I)所示：式（I)。2. 如權(quán)利要求1所述LeuconodineB在治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特 征在于LeuconodineB對(duì)YFV有抑制作用。3. -種治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物，其特征在于由權(quán)利要求1所述LeuconodineB 為活性成分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物L(fēng)euconodineB，加入糊精195克， 混勻，常規(guī)壓片制成1000片。4. 一種治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物，其特征在于由權(quán)利要求1所述LeuconodineB 為活性成分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物L(fēng)euconodineB，加入淀粉195克， 混勻，裝膠囊制成1000粒。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Leuconodine？B在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用。Leuconodine？B能夠有效地抑制黃熱病毒的增殖，但是對(duì)細(xì)胞毒性很小，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及的Leuconodine？B在制備治療黃熱病毒感染藥物中的用途屬于首次公開(kāi)，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對(duì)于黃熱病毒抑制活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于黃熱病毒感染的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
【IPC分類】A61K31/438, A61P31/14
【公開(kāi)號(hào)】CN105311027
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510908120
【發(fā)明人】田麗華
【申請(qǐng)人】淄博齊鼎立專利信息咨詢有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日