一種偽狂犬表位多肽基因工程疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種偽狂犬（Pseudorabies virus， PrV)表位多肽基因工程疫苗的制備與應(yīng)用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將PRV主要糖蛋白 gB、gC、gD的B細(xì)胞中和表位和T細(xì)胞免疫表位與牛皰瘆病毒1型（Bovine Herpesvirus 1，BHV-1)被膜蛋白VP22串聯(lián)，并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過發(fā)酵，純化、乳化工藝制備， 得到偽狂犬表位多肽基因工程疫苗以及該疫苗在預(yù)防重大動(dòng)物疾病偽狂犬病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病是一種發(fā)生于家畜、野生哺乳動(dòng)物、伴侶動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，以發(fā) 熱、奇癢（豬除外）以及腦脊髓炎為主要癥狀的一種急性傳染病，是由偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PrV)引起的。偽狂犬病病毒的基因組DNA為線狀雙鏈，長(zhǎng)約150kb， 由獨(dú)特長(zhǎng)區(qū)段（UL)、獨(dú)特短區(qū)段（US)、短區(qū)段兩側(cè)的末端重復(fù)序列（TR)和內(nèi)部重復(fù)序列 (IR)組成。偽狂犬病毒的基因組DNA至少可編碼70個(gè)基因，其中許多基因是非必需的可通 過缺失毒力基因而致弱，而且其龐大的基因組，可以容納較大外源基因的插入。
[0003] 在UL區(qū)已被定位的基因共58種，包括已被測(cè)序的編碼糖蛋白gB (gll)、gC(gllI)、 gH、gK、gL、gM、gN、TK、堿性核酸酶（AN)、核糖核苷還原酶（RR)、DNA多聚酶（POL)、 DBP(136kDa DNA結(jié)合蛋白質(zhì)）、MCP(主要衣殼蛋白）、ICP18. 5蛋白和早期蛋白O(EPO)等基 因。US區(qū)已被全部測(cè)序，其中包括編碼蛋白激酶（PK)、糖蛋白gG(gX)、gp50(gD)、gp63(gI) 和gl(gE)的基因及編碼llkDa和28kDa的基因。IR區(qū)的早期基因（IE)和RSp40基因也 得到了鑒定和測(cè)序，且證明不同毒株間的IE基因存在差異。另外IR與UL連接區(qū)的潛伏基 因也已得到鑒定?，F(xiàn)已知的9種PrV包膜糖蛋白（gX、gp50、gp63、gl、gll、gill、gH、gM和 gL)中除gX外，其它均為成熟病毒子的結(jié)構(gòu)成分，只有g(shù)X是非結(jié)構(gòu)成分，常存在于感染細(xì)胞 中，病毒子上沒有發(fā)現(xiàn)。到目前為止，已證實(shí)81、8111、8口63、8乂和811對(duì)病毒體內(nèi)增殖是非 必需的，而gll、gp50、gH和gL為病毒復(fù)制所必需。
[0004]目前廣泛應(yīng)用的gE單基因缺失疫苗在使用過程中己逐漸爆露其局限性，具體表 現(xiàn)在：gE缺失疫苗免疫后，盡管能減少野毒感染后產(chǎn)生臨床癥狀以及感染后野毒的排出， 但是在具有高母源抗體的豬如育成豬或育肥豬，使用gE疫苗后不能有效地激發(fā)中和抗體， 因而在感染后排出病毒較多（Gielkens L J，1984 ;Molitor T W etal.，1992)，故母豬需要 重復(fù)接種，并建議商品豬在8、12、16周分別免疫一次。同時(shí)gE的缺失導(dǎo)致病毒在體內(nèi)增殖 很快，尤其是在巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，雖然gE基因缺失株毒力有所下降，但對(duì) 免疫系統(tǒng)的特別的親嗜性可能會(huì)產(chǎn)生免疫抑制。gG缺失疫苗與其它疫苗的比較方面，也有 不同的結(jié)論：無(wú)論母源抗體存在與否，gX和gE缺失疫苗在誘導(dǎo)中和抗體滴度和阻止感染后 排毒方面均無(wú)差異（Boeker M，etal.，1999 ;Pensaert M B，De Waele K，1990)，Vamier P etal(1991)。將gG與gE缺失苗分別溶于水中，gG(gX)免疫后誘導(dǎo)的抗體水平略高于gE 缺失苗。RzihaHJetal(1989)比較了 TK/gE和gE/TK兩種缺失突變株在體內(nèi)的增殖。結(jié)果 說明：gE/TK在感染后6周，用免疫抑制劑處理豬后，可從許多組織中檢出該缺失株的DNA， 而TK/gE只在神經(jīng)組織和扁桃體中增殖，而且以極低的數(shù)量增殖，用免疫抑制劑處理豬后， 不能檢測(cè)到感染性的病毒粒子，這一結(jié)果支持早期研宄結(jié)果（Kit etal.，1985)，即TK基因 陰性的疫苗可降低病毒形成潛伏感染的能力。
[0005] 盡管針對(duì)PrV病毒產(chǎn)生的保護(hù)性免疫作了大量的研宄，但對(duì)于保護(hù)力產(chǎn)生的機(jī)理 和抗原的確切性質(zhì)仍有許多未知的因素，大多數(shù)研宄都強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞免疫的重要性。但Prv 病毒免疫應(yīng)答的機(jī)制較為復(fù)雜，被動(dòng)免疫只能阻斷病毒從最初增殖的上皮細(xì)胞中擴(kuò)散，但 不能阻止病毒在接種部位的復(fù)制和增殖。從表達(dá)高水平主要組織相容性復(fù)合體（MHC)I類 抗原的上皮細(xì)胞消除感染，必須借助細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，而在不表達(dá)MHC的神經(jīng)細(xì)胞中 消除感染則依賴于抗體?？贵w在保護(hù)力中發(fā)揮一定作用，但是抗體滴度與臨床保護(hù)力之 間的相關(guān)性是不完全的，因?yàn)橛行┛贵w陰性豬在攻毒時(shí)部分獲保護(hù)（Andries etal，1978; McCawand Xu，1993)〇
[0006] 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRV有11種糖蛋白，其中，gB、gC、gD均為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體 的蛋白，所產(chǎn)生的抗體無(wú)論是在體內(nèi)、體外，還是在有無(wú)補(bǔ)體存在的情況下都有中和PRV的 能力。因此，gB、gC、gD是研制PRV亞單位疫苗的首選糖蛋白。在PRVgB、gC糖蛋白中檢測(cè) 到 B 細(xì)胞表位（Ober，B. T.，etal，1998 ;K. H. Wiesmuller，etal，2000 ;Zaripov，M. M.，etal， 1998)也檢測(cè)到gC蛋白T細(xì)胞表位能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞毒性反應(yīng)（Ober，B. T.，etal， 2000;)。PRV gD誘導(dǎo)強(qiáng)烈的中和抗體和微弱的細(xì)胞毒性反應(yīng)。（van Rooij，E.M.，etal， 2000)充分了解保護(hù)相關(guān)的免疫參數(shù)是提高抗PRV病毒疫苗的前提。基于Thl型細(xì)胞調(diào)節(jié) 是抗 PRV 感染的重要保護(hù)效應(yīng)機(jī)制（Bianchi，A.T.，1998 ;Fischer，L.，2003 ;Van Rooij， E. M.，2004 ;)。因此，有報(bào)道免疫誘導(dǎo)Thl偏好免疫反應(yīng)能夠提供有效保護(hù)抵抗致命PRV 感染。（Yoon，H. A. etal，2007).在這三個(gè)主要糖蛋白中，表達(dá)gB蛋白的質(zhì)粒DNA肌肉注射 免疫動(dòng)物能夠誘導(dǎo)Thl偏好免疫反應(yīng)，隨后提供了最有效的抗致命性攻毒的保護(hù)。（Yoon， H. A. etal，2006).而且Thl偏好免疫反應(yīng)來源的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的結(jié)合有助于增強(qiáng)抗 致命性 PRV 感染的抵抗力。（Yoon，H.A.etal，2006;Yoon，H.A.etal，2007)。特異性病毒 中和血清抗體在控制PRV感染的控制中發(fā)揮了相當(dāng)大的作用（Kimman，T. G.，etal，1992 ; Marchioli，C.，R. etal，1988)。Marchioli等將PRV保護(hù)性抗原基因gD插入到人巨細(xì)胞病 毒啟動(dòng)子的下游，然后轉(zhuǎn)入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CH0)中，經(jīng)氨喋呤篩選出1株表達(dá)gD蛋白 的CHO gD-17細(xì)胞株，經(jīng)大量培養(yǎng)后用表達(dá)產(chǎn)物配以佐劑，免疫小鼠能產(chǎn)生較高滴度的抗 體，免疫3次后攻毒，小鼠能抵抗強(qiáng)毒攻擊。鼻內(nèi)接種免疫豬，能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體并保 護(hù)豬抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。Katayama等（1991)用肝素親和層析純化的gC和用免疫親和 層析純化的gB、gC、gD分別接種豬，均能使其抵抗PRV的攻擊。桿狀病毒表達(dá)的PRV糖蛋 白gC能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體。Tulman等將提取的PrV囊膜蛋白gC制成免疫源復(fù)合物 即亞單位疫苗。用亞單位疫苗免疫小鼠和豬均能夠誘導(dǎo)抗體應(yīng)答和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。用 此亞單位疫苗免疫小鼠和豬，均能夠誘導(dǎo)抗體應(yīng)答和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。用此亞單位疫苗 免疫兩次，能夠保護(hù)小鼠免受致死量的PRV強(qiáng)毒的攻擊。已證實(shí)了幾種皰瘆病毒蛋白是T 細(xì)胞或抗體的靶抗原，例如，單純皰瘆病毒I型（HSV-1)特異性馬細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識(shí)別極 早期糖蛋白（Ballksetal.，1991)。因此，感染細(xì)胞在感染性病毒產(chǎn)生之前就被裂解。晚期 Hsv-1糖蛋白gB、gC和gD是人、馬、豬細(xì)胞毒性T細(xì)胞的靶抗原，也己被認(rèn)為是中和抗體的 革巴抗原（Ben_Poratetal，1986)，抗體吸附試驗(yàn)表明豬已產(chǎn)生針對(duì)gE、極早期蛋白、核衣殼 蛋白的抗體。Zuckermann F A(1999)證明了 gC抗體是康復(fù)豬血清中發(fā)揮中和作用的主要 抗體成分；gC糖蛋白也是細(xì)胞毒性CD8+和CD4+T細(xì)胞的靶細(xì)豬和免疫豬產(chǎn)生的細(xì)胞免疫 和體液免疫的革G抗原。輔助性T細(xì)胞識(shí)別的gC糖蛋白兩個(gè)抗原決定簇已被證實(shí)。因此gC 是自然感染性，不依賴補(bǔ)體的作用。gD糖蛋白也是T細(xì)胞的靶抗原。gG都不能刺激產(chǎn)生中 和抗體（Thom Senetall987)，因?yàn)間G不是病毒囊膜的組成部分。用純化的gC或gD免疫豬 和小鼠，比gG免疫更能產(chǎn)生較好的保護(hù)力，抵抗高毒力PRV毒株攻擊。gB、gC和gD的單克 隆抗體能被動(dòng)保護(hù)鼠和豬對(duì)于PRV的致死性感染，而gE單抗僅能保護(hù)鼠。gE含有幾個(gè)抗體 結(jié)合位點(diǎn)，需要補(bǔ)體才能中和病毒，gE也含能被輔助性T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位，但在鼠中未 能證明細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL)對(duì)gE識(shí)別，用gE的真核或原核表達(dá)產(chǎn)物免疫鼠也能保護(hù) 小鼠。偽狂犬病毒gC糖蛋白是鼠和豬CTLS的靶抗原，gC的功能是多種的：在PRV的附著 中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且是主要的免疫原。該蛋白質(zhì)在小白鼠和豬體內(nèi)誘導(dǎo)了在補(bǔ)體存在時(shí) 具有中和作用的抗體，而且是T細(xì)胞應(yīng)答的靶細(xì)胞；
[0007] 表位多肽疫苗可針對(duì)性選擇的不同毒株的相同抗原保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，含有廣譜 的表位信息，排除全病毒蛋白中存在的抑制性表位、病理、耐受性及導(dǎo)致不同毒株間差異的 表位等不利因素，提供不同毒株之間的交叉免疫保護(hù)，進(jìn)而有效應(yīng)對(duì)宿主自身基因突變所 造成的免疫逃避問題。表位疫苗還具備了傳統(tǒng)疫苗技術(shù)所不具備的優(yōu)勢(shì)，其擺脫了體外培 養(yǎng)的限制，生產(chǎn)中不需要活病毒參與，不包含病原生物的完整組分，徹底擺脫了潛在威脅， 無(wú)毒力返祖現(xiàn)象，更安全；人工合成或工程表達(dá)，質(zhì)量更穩(wěn)定；能夠克服MHC的遺傳限制而 得到高效遞呈，不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)或免疫抑制；分子結(jié)構(gòu)小而簡(jiǎn)單，很少會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的 過敏反應(yīng)及醫(yī)源性感染問題；具有可操作性，在分子水平上進(jìn)行不同病原多表位的聯(lián)合修 飾或改造。
[0008] 牛皰瘆病毒1型（Bovine Herpesvims 1，BHV-1)被膜蛋白VP22是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān) 蛋白，具有獨(dú)特