Cp4-epsps特異性納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種針對(duì)于CP4-EPSPS蛋白的納 米抗體及其編碼序列以及其在該領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 5_ 稀醇式丙酮莽草酸 _3_ 磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate_3-phosp hate synthase，EPSPS:EC 2. 5. 1. 19)是除草劑草甘膦的革E標(biāo)酶，而來(lái)自根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium sp.) CP4菌株的EPSPS對(duì)高濃度的草甘膦表現(xiàn)出極高的抗性，因此 cp4-印sps基因被廣泛應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研宄中，其編碼的CP4-EPSPS是莽草酸途 徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化磷酸稀醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)與莽草酸-3-磷 酸（shikimate-3_phosphate，SP3)生成5-稀醇式丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSP)。向農(nóng)作物 體內(nèi)轉(zhuǎn)入這種基因可使其獲得除草劑草甘膦的抗性，然而，轉(zhuǎn)基因食品的安全問(wèn)題越來(lái)越 受到消費(fèi)者的關(guān)注，因此，建立一套快速、特異的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系顯得尤為重要。1993年， 比利時(shí)科學(xué)家C. Hamers-Casterman等首次在《Nature》上報(bào)道：在駱蛇血液中的抗體，有 一半沒(méi)有輕鏈，而且，這些缺失輕鏈的"重鏈抗體"（heavy-chain antibodies, HCAbs)能像 正?？贵w一樣與抗原等靶標(biāo)緊密結(jié)合，并且不像單鏈抗體scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成 塊。這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)（variable domain of heavy chain of HCAb，VHH) 和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn) 定性與抗原結(jié)合活性。VHH是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位，所以VHH也稱納米 抗體（Nanobody，Nb)。納米抗體具有獨(dú)特的性質(zhì)如相對(duì)分子質(zhì)量小、水溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、 抗原識(shí)別能力強(qiáng)、易于生產(chǎn)等。因此在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，比其他抗體具有優(yōu)越性。 所以，應(yīng)用納米抗體技術(shù)研發(fā)CP4-EPSPS檢測(cè)試劑具有廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種針對(duì)CP4-EPSPS蛋 白的納米抗體，同時(shí)提供該納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0004] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種CP4-EPSPS特異性納米抗體，它的VHH鏈包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，所述框架 區(qū)FR包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:1所示的FR1，SEQIDN0:2所示的FR2，SEQIDNO: 3所示的FR3，SEQIDN0:4所示的FR4;所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR包括以下氨基酸序列：SEQID NO:5 所示的CDR1，SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0006] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0007] 一種DNA分子，它編碼CP4-EPSPS特異性納米抗體的VHH鏈，或CP4-EPSPS特異性 納米抗體。
[0008] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述DNA分子包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。
[0009] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體在CP4-EPSPS蛋白檢測(cè) 方面的應(yīng)用。
[0010] 有益效果：本發(fā)明提供的針對(duì)CP4-EPSPS蛋白的納米抗體，首先將CP4-EPSPS蛋白 偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示該蛋白的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選 免疫納米抗體基因庫(kù)，從而獲得了 CP4-EPSPS特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸 桿菌中，從而建立能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。通過(guò)本發(fā)明所公布的CP4-EPSPS 特異性納米抗體，研發(fā)針對(duì)CP4-EPSPS蛋白特異性的檢測(cè)試劑，可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品，以 解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為本發(fā)明CP4-EPSPS特異性納米抗體的DNA的電泳圖；其中泳道M表示蛋白 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的產(chǎn)物；
[0012] 圖2為本發(fā)明CP4-EPSPS特異性納米抗體的電泳圖；其中泳道M表示蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為CP4-EPSPS特異性納米抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明將CP4-EPSPS蛋白偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形 式的抗原篩選免疫納米抗體基因庫(kù)，優(yōu)選駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù)，而獲得了能在 大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。
[0014] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0015] 實(shí)施例1 :針對(duì)于CP4-EPSPS特異性納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建：
[0016] (1-1)首先將lmg CP4-EPSPS與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆單峰駝，每周 一次，共免疫7次，刺激B細(xì)胞表達(dá)抗原特異性的納米抗體；
[0017] (1-2) 7次免疫結(jié)束后，提取100mL駱駝外周血淋巴細(xì)胞并提取總RNA ;
[0018] (1-3)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸cDNA并利用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增VHH鏈；
[0019] (1-4)利用限制性內(nèi)切酶Pst I及Not I酶切20ug pComb3噬菌體展示載體及 10 y gVHH鏈，并連接兩個(gè)片段；
[0020] (1-5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TG1中，構(gòu)建CP4-EPSPS納米抗體文庫(kù)并測(cè)定 庫(kù)容，庫(kù)容大小為3.6X10 9。
[0021] 如圖1所示，PCR產(chǎn)物電泳條帶大小約為500bp。
[0022] 實(shí)施例2 :針對(duì)CP4-EPSPS的納米抗體篩選過(guò)程：
[0023] (2-1)將溶解在pH 8. 2的lOOmM似110)3溶液中的20 y g CP4-EPSPS蛋白偶聯(lián)在 NUNC酶標(biāo)板上，4 °C放置過(guò)夜；
[0024] (2-2)第二天加入lOOyL 0? 1%酪蛋白，室溫封閉2h ;
[0025] (2_3)2h后，加入lOOyL噬菌體，即5X10ntfu免疫駱駝納米抗體噬菌體展示基 因庫(kù)，室溫作用lh ;
[0026] (2-4)用0? 05% PBS+Tween-20 (PBST)洗5遍，以洗掉不結(jié)合的噬菌體；
[0027] (2_5)用 lOOmM 三乙醇胺（triethylamine，TEA)將與 CP4-EPSPS 特異性結(jié)合的噬 菌體解離下，并感染處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1，37°C培養(yǎng)lh，產(chǎn)生并純化噬菌體用于 下一輪的篩選，相同篩選過(guò)程重復(fù)3輪，逐步得到富集。
[0028] 實(shí)施例3 :用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法（ELISA)篩選特異性單個(gè)陽(yáng)性克隆：
[0029] (3-1)從上述3輪篩選后含有噬菌體的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，挑選96個(gè)單菌落并接種于 含有100 U g/mL的氨芐青霉素的誘導(dǎo)蛋白液體培養(yǎng)基即TB培養(yǎng)基（1L的TB培養(yǎng)基中含有 2. 3g磷酸二氫鉀，12. 52g磷酸氫二鉀，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油）中，生長(zhǎng)至對(duì) 數(shù)期后，加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)作為誘導(dǎo)劑，28°C培養(yǎng)過(guò)夜；
[0030] (3-2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定（ELISA)板中，在室溫下放置lh ;
[0031] (3-3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入抗鼠抗HA抗體（mouse anti-HA tag antibody，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），在室溫下作用lh ;
[0032] (3-4)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體 (anti-mouse alkaline phosphatase conjugate，艾美捷科技有限公司），在室溫下作用 lh ；
[0033] (3-5)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在 405nm波長(zhǎng)，讀取吸收值；
[0034] (3-6)當(dāng)樣品孔0D值大于對(duì)照孔0D值2倍以上時(shí)，判為陽(yáng)性克隆孔；
[0035] (3-7)將陽(yáng)性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100 y g/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中以便 提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。
[0036] 根據(jù)序列比對(duì)軟件Vector NTI分析各個(gè)克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2,⑶R3 序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，其抗體的VHH鏈的氨 基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0037] 實(shí)施例4 :CP4_EPSPS特異性納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達(dá)、純化：
[0038] (3-1)將上述測(cè)序分析所獲得不同克隆株的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6中，并將 其涂布在LA+glucose (即含有氨芐青霉素和葡萄糖）的培養(yǎng)平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；
[0039] (3-2)挑選單個(gè)菌落接種在5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床培養(yǎng)過(guò) 夜；
[0040] (3-3)接種lmL的過(guò)夜菌種至330mL TB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到0D值達(dá) 到0? 6~1. 0時(shí)，加入IPTG，28°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；
[0041] (3-4)離心，收菌；
[0042] (3-5)利用滲透法，獲得抗體粗提液；
[0043] (3-6)經(jīng)鎳柱離子親和層析可得到純度較高的CP4-EPSPS特異性納米抗體。如圖 2所示，CP4-EPSPS Nb的分子量為14. 7kDa，等電點(diǎn)pi為8. 40,在大腸桿菌WK6中表達(dá)的產(chǎn) 量約為7. 8mg/L。
[0044] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CP4-EPSPS特異性納米抗體，其特征在于，它的VHH鏈包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定 區(qū)，所述框架區(qū)FR包括以下氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2所示的FR2， SEQ ID N0:3所示的FR3, SEQ ID N0:4所示的FR4;所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR包括以下氨基酸 序列：SEQ ID NO :5 所示的 CDR1，SEQ ID NO :6 所示的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體，其特征在于，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH鏈。
3. -種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1或2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗 體的VHH鏈，或權(quán)利要求2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所 不〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CP4-EPSPS特異性納米抗體在CP4-EPSPS蛋白檢測(cè)方面 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種CP4-EPSPS特異性納米抗體及其應(yīng)用，并公開(kāi)了其氨基酸序列以及編碼該納米抗體的基因序列。通過(guò)本發(fā)明所公布的CP4-EPSPS特異性納米抗體，研發(fā)針對(duì)CP4-EPSPS蛋白特異性的檢測(cè)試劑，可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品，以解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法成本高、操作復(fù)雜、特異性差的問(wèn)題。
【IPC分類】C12N15-13, C07K16-40, G01N33-573
【公開(kāi)號(hào)】CN104628860
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510048148
【發(fā)明人】萬(wàn)亞坤, 錢付平, 李敏
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月29日