一種1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫原和抗體及其制備方法，特別是用于針對(duì)1，3-β -D-葡聚糖免疫原和抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆的抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]侵襲性真菌疾病(Invasive fungal disease，IFD)又稱深部真菌感染，指真菌侵入人體組織、血液，并在其中生長繁殖引致組織損害、器官功能障礙、炎癥反應(yīng)的病理改變及病理生理過程。
[0003]近年來，由于廣譜抗菌藥物、腎上腺皮質(zhì)激素、腫瘤化療、放療和器官移植后免疫抑制劑的長期廣泛應(yīng)用以及艾滋病的流行，侵襲性真菌疾病的發(fā)病率逐年升高，該疾病早期癥狀無特異性，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率極高。因此，對(duì)侵襲性真菌疾病治療成敗關(guān)鍵在于早期診斷、早期給予抗真菌治療。
[0004]目前侵襲性真菌疾病診斷的常規(guī)方法，陽性率低、很難確診，而非常規(guī)方法檢測成本高、實(shí)驗(yàn)條件苛刻很難在醫(yī)院普遍推廣。常用的鱟試劑檢測l，3-f3_D-葡聚糖，假陽性因素較多，其它抗原、抗體和酶類檢測產(chǎn)品一般只針對(duì)特定幾種真菌，不適合侵襲性真菌疾病大量臨床篩選工作。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)成熟，成本相對(duì)較低，診斷快速，便于臨床實(shí)驗(yàn)室使用。因此，針對(duì)真菌1，3-β-D-葡聚糖的ELISA檢測體系具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，而制備抗1，3-β -D-葡聚糖抗體是建立該ELISA體系的關(guān)鍵技術(shù)。
[0005]非專利文獻(xiàn)“(1，3)_β -D-葡聚糖ELISA檢測方法建立及初步臨床應(yīng)用”(現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003年，第5期)中公開了以半乳糖神經(jīng)酰胺為包被物，鼠抗(l，3)-f3-D-葡聚糖單克隆抗體、生物素化抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素為檢測系統(tǒng)建立ELISA法。
[0006]非專 利文 獻(xiàn) “Development of a two-site enzyme immunoassaybased on monoclonal antibodies to measure airborne expo sureto (I — 3) - β-d-glucan” (Journal of Immunological Methods，V.337，N0.1)以氧化昆布多糖免疫小鼠，得到1，3-β-D-葡聚糖單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上，建立了一種雙抗體夾心ELISA法。但上述方法中使用的是抗(1，3)-β-D-葡聚糖單克隆抗體，制備方法較為復(fù)雜。
[0007]盡管現(xiàn)有技術(shù)中公開有葡聚糖多克隆抗體的制備方法，通常采用葡聚糖與BSA交聯(lián)物為抗原，進(jìn)行動(dòng)物免疫后，獲得葡聚糖多克隆抗體。但是上述葡聚糖多克隆抗體或者不具備特異性或者抗體的純度和效價(jià)也不能滿足疾病檢測的需要，不適用于ELISA檢測體系O
[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗體及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗體及其制備方法，解決1，3-β -D-葡聚糖抗體制備工藝復(fù)雜，效價(jià)低，特異性差的缺陷。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗體在侵襲性真菌疾病檢測中的應(yīng)用，成本相對(duì)較低，診斷快速，降低了檢測的假陽性，適合于侵襲性真菌疾病大量臨床樣本的篩選。
[0011]因此，本發(fā)明第一方面提供了一種1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗體，所述抗體的制備方法包括:
[0012](I)制備1，3-β-D-葡聚糖免疫原；
[0013](2)用1，3-β -D-葡聚糖免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫；
[0014](3)從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血；
[0015](4)依次用飽和硫酸銨鹽析法和親和層析法對(duì)血清純化，得到多克隆抗體。
[0016]本發(fā)明所述的步驟(I)中，制備1，3-β-?-葡聚糖免疫原的方法包括:將I, 3- β -D-匍聚糖和偶聯(lián)蛋白偶聯(lián)制備得到1，3- β -D-匍聚糖免疫原；或者，將真菌抱子和/或菌體培養(yǎng)后破碎獲得破碎液制備得到1，3-β-D-葡聚糖免疫原。多抗制備的關(guān)鍵是免疫抗原的合成，免疫抗原需要純度好，而且能保持1，3-β-D-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)抗體的產(chǎn)生。
[0017]所述的步驟⑴為1，3-β -D-匍聚糖和偶聯(lián)蛋白偶聯(lián)制備得到1，3- β -D-匍聚糖免疫原時(shí)，1，3-β -D-葡聚糖可以為本領(lǐng)域熟知的1，3-β -D-葡聚糖，例如海帶多糖(Laminarin)、茯等多糖(Pachyman)、羧甲基化茯等多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝膠多糖(Curdlan)、羧甲基化凝膠多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香葫多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麥葡聚糖(Barley glucan)、燕麥葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等。優(yōu)選的，所述的1，3-β-D-葡聚糖選自海帶多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖、凝膠多糖、羧甲基化凝膠多糖。最優(yōu)選，所述的1，3-β-D-葡聚糖為凝膠化多糖或羧甲基化凝膠多糖。所述的偶聯(lián)蛋白可以為牛血清白蛋白(Bull serum albumin，BSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpethemocyanin, KLH)、破傷風(fēng)毒素(Tetanus toxin，TT)、雞卵清白蛋白(Ovalbumin，0VA)，優(yōu)選為牛血清白蛋白。1，3- β -D-葡聚糖和蛋白的偶聯(lián)方法可以選用碘酸鹽氧化法、DMTMM試劑法、碳二亞胺法、戊二醛法、活化脂法、混合酸酐法等。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述的偶聯(lián)步驟包括:將海帶多糖溶液和Na14溶液混合，室溫避光反應(yīng)0.5-3小時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)I小時(shí)，用色譜柱脫鹽，將得到的溶液中加入牛血清白蛋白和NaBH3CN溶液，室溫振蕩反應(yīng)，加入NaBH4溶液，室溫振蕩反應(yīng)，用磷酸鹽緩沖液透析，離心除去沉淀。在本發(fā)明的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述的偶聯(lián)步驟包括:將羧甲基化茯苓多糖和/或羧甲基化凝膠多糖溶液和DMTMM(4-(4，6- 二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽)溶液混合，振蕩反應(yīng)，超純水透析過夜，加入BSA，室溫避光振蕩過夜，離心除去沉淀。
[0019]所述的步驟⑴為真菌孢子和/或菌體培養(yǎng)后破碎獲得破碎液制備得到1，3-β-D-葡聚糖免疫原時(shí)，所述的真菌為本領(lǐng)域適用的致病真菌，包括曲霉菌(Aspergillus)、念珠菌(Candida albaican)、隱球菌(Crytococcus)、毛霉菌(Mucor)、馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei)、謙刀菌(Fusarium)、卡氏肺抱子菌(Penumocystiscarinii bacteria)。所述的真菌菌體可以采用經(jīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵收集菌體；所述的真菌孢子可以經(jīng)平皿固體培養(yǎng)洗脫收集孢子。所述的破碎步驟可以采用研磨破碎和/或超聲破碎。在本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述步驟(I)可以包括:將致病真菌經(jīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵收集菌體，用含體積百分比1-10%甲醛的生理鹽水滅活，多次洗滌除去甲醛，菌體倒入液氮研磨破碎，收集上清液；或者，將致病真菌經(jīng)平皿固體培養(yǎng)洗脫收集孢子，用含體積百分比1-10%甲醛的生理鹽水滅活，多次洗滌除去甲醛，孢子用超聲破碎，收集上清液。
[0020]優(yōu)選的，所述的步驟⑴中，l，3-f3-D-葡聚糖和偶聯(lián)蛋白偶聯(lián)制備得到1，3- β -D-葡聚糖免疫原后，任選的包括對(duì)蛋白修飾后1，3- β -D-葡聚糖的鑒定步驟，所述的鑒定方法方法包括高效凝膠排阻色譜法、紫外/紅外吸收光譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。
[0021]本發(fā)明所述的步驟(2)中，所述的動(dòng)物可以為本領(lǐng)域使用的制備多克隆抗體的動(dòng)物，選自:小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬、驢中的一種或兩種以上，優(yōu)選為小鼠、大鼠、兔。所述免疫的方法選自皮下注射法、脾內(nèi)注射法、靜脈注射法、腹腔注射法等。步驟(2)免疫步驟中的免疫劑量可視具體動(dòng)物種類而定，優(yōu)選的免疫劑量為10-1000 μ g/只/次。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的是實(shí)施方式中，所述的步驟⑵包括:將步驟⑴得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只動(dòng)物10-1000 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次數(shù)多3次。優(yōu)選的，所述的初次免疫后每2周免疫I次，免疫次數(shù)為3-5次，更優(yōu)選的免疫次數(shù)為3次。
[0022]本發(fā)明所述的步驟(3)中，優(yōu)選的，從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血前，還包括測定免疫后動(dòng)物的血清效價(jià)的步驟，更優(yōu)選的，所述的測定免疫后動(dòng)物的血清效價(jià)步驟在免疫后每隔1-7天進(jìn)行一次。所述的步驟(3)中從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血為處死后采血，也可以不處死。更優(yōu)選的，所述的從免疫后的動(dòng)物體內(nèi)取血步驟包括:用頸動(dòng)脈放血的方法采血，待血液凝固，血清分離出后，離心，取上清。
[0023]本發(fā)明所述的步驟(4)中，所述的純化方法為先用飽和硫酸銨鹽析沉淀法進(jìn)行初步純化，再用親和層析法進(jìn)一步純化?，F(xiàn)有的抗體純化方法存在多種，例如硫酸銨沉淀法、辛酸沉淀法、DEAE離子交換層析法、輕基磷灰石層析法、凝膠層析法、親和層析法。不同性質(zhì)的抗體適用的純化方法不同，需要篩選出工藝簡單、能夠得到高效價(jià)抗體。
[0024]本發(fā)明所述的飽和硫酸銨鹽析沉淀法包括:取步驟(3)得到的血清，加等體積的生理鹽水，再加入飽和硫酸銨溶液，0-10°C沉淀過夜，優(yōu)選為4°C沉淀過夜；10000G離心5-20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，0-10°C靜置0.5-2h，優(yōu)選4°C靜置Ih ; 10000G離心5_20min，優(yōu)選離心lOmin，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖液0-10°C透析過夜，優(yōu)選4°C透析過夜。
[0025]本發(fā)明所述的親和層析法包括:用5-10倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；用5-10倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；將用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過