，3-β-D-葡聚糖免疫原的制備
[0053](I)海帶多糖和BSA偶聯(lián)制備免疫原
[0054]將1mL 20mg/mL海帶多糖溶液和0.5mL 5mol/LNa104溶液混合，室溫避光反應60min，用S印hadex-G25柱脫鹽。上述溶液中加入抗原海帶多糖質量1_10倍的BSA和NaBH3CN溶液，室溫振蕩反應。加入NaBH4溶液，室溫振蕩反應。用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析過夜。最后離心除去沉淀。
[0055](2)羧甲基化茯苓多糖或羥甲基化凝膠多糖和BSA偶聯(lián)制備免疫原
[0056]將羧甲基化茯苓多糖或羥甲基化凝膠多糖溶液和DMTMM溶液混合，振蕩反應，超純水透析過夜，加入抗原羧甲基化茯苓多糖或羥甲基化凝膠多糖質量1-10倍的BSA，室溫避光振蕩過夜，最后離心除去沉淀。
[0057](3)采用真菌菌體和孢子制備免疫原
[0058]將常見的致病真菌經(jīng)液體培養(yǎng)基發(fā)酵收集菌體，經(jīng)平皿固體培養(yǎng)洗脫收集孢子，用含甲醛的生理鹽水滅活，多次洗滌除去甲醛，菌體倒入液氮研磨破碎，收集上清液，孢子用血球板法計數(shù)后，超聲破碎，得到免疫原。
[0059]實施例2 I, 3-β -D-葡聚糖免疫原的鑒定
[0060]使用高效凝膠排阻色譜法，取實施例1中按照(I)和(2)的方法制備得到的BSA修飾后的1，3-β -D-葡聚糖適當稀釋，以5mg/mL的BSA溶液作為對照。色譜條件:色譜柱為TSK-GELG3000SWXL,進樣體積為20 μ L，柱溫為常溫，流動相為0.3mol/L氯化鈉-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6.8)溶液，流速為lmL/min，檢測波長為280nm。
[0061]其中BSA修飾后的海帶多糖的鑒定結果見附圖1。
[0062]實施例3抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗體的制備
[0063](I)免疫動物
[0064]將實施例1⑴中得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原(經(jīng)BSA修飾的海帶多糖)與弗氏完全佐劑等體積混合至合適體積。充分乳化后對新西蘭大耳兔進行皮下多點注射，每只兔免疫劑量控制在0.01-lmg。免疫前3天取耳血，分離血清做陰性對照。初次免疫后每2周免疫I次，方法與第I次相同。
[0065](2)多克隆抗體純化
[0066]I)效價測定:免疫過程中，免疫后每隔幾天采血測效價I次，免疫次數(shù)不少于3次。
[0067]2)分離抗血清:血清效價達到最高時，用頸動脈放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分離出后，高速離心，取上清，-20 0C保存。
[0068](3)用飽和硫酸錢鹽析法進行初步純化
[0069]I)取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，4°C沉淀過夜。
[0070]2) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用2mL磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加ImL飽和硫酸銨溶液，4°C靜置Ih。
[0071]3) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用ImL磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖液4°C透析過夜。
[0072](4)用親和層析的方法進一步純化
[0073]I)用10倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；
[0074]2)用10倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0075]3)將用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；
[0076]4)用10倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0077]5)用5倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測器檢測，收集蛋白峰即為抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗體；
[0078]6)用lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)調至pH值中性，用磷酸鹽緩沖液透析過夜。
[0079]其中，層析柱中用葡萄球菌A蛋白交聯(lián)的固相載體作為柱填料，洗脫緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 4.2)，偶聯(lián)緩沖液為0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。
[0080]實施例4抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗體的制備
[0081](I)免疫動物
[0082]將實施例1⑵中得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原(經(jīng)BSA修飾的羥甲基化茯苓多糖)與弗氏完全佐劑等體積混合至合適體積。充分乳化后對新西蘭大耳兔進行皮下多點注射，每只兔免疫劑量控制在0.0l-1mgo免疫前3天取耳血，分離血清做陰性對照。初次免疫后每2周免疫I次，方法與第I次相同。
[0083](2)多克隆抗體純化
[0084]I)效價測定:免疫過程中，免疫后每隔幾天采血測效價I次，免疫次數(shù)不少于3次。
[0085]2)分離抗血清:血清效價達到最高時，用頸動脈放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分離出后，高速離心，取上清，-20 0C保存。
[0086](3)用飽和硫酸銨鹽析法進行初步純化
[0087]I)取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，4°C沉淀過夜。
[0088]2) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用2mL磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加ImL飽和硫酸銨溶液，4°C靜置Ih。
[0089]3) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用ImL磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖液4°C透析過夜。
[0090](4)用親和層析的方法進一步純化
[0091]I)用7.5倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；
[0092]2)用7.5倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0093]3)將用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；
[0094]4)用7.5倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0095]5)用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測器檢測，收集蛋白峰即為抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗體；
[0096]6)用lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)調至pH值中性，用磷酸鹽緩沖液透析過夜。
[0097]其中，層析柱中用1，3_β-D-葡聚糖抗原交聯(lián)的固相載體作為柱填料，洗脫緩沖液為檸檬酸緩沖液(pH 4.5)，偶聯(lián)緩沖液為0.lmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)。
[0098]實施例5抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗體的制備
[0099](I)免疫動物
[0100]將實施例1(2)中得到的1，3-β-D-葡聚糖免疫原(經(jīng)BSA修飾的羥甲基化凝膠多糖)與弗氏完全佐劑等體積混合至合適體積。充分乳化后對新西蘭大耳兔進行皮下多點注射，每只兔免疫劑量控制在0.0l-1mgo免疫前3天取耳血，分離血清做陰性對照。初次免疫后每2周免疫I次，方法與第I次相同。
[0101](2)多克隆抗體純化
[0102]I)效價測定:免疫過程中，免疫后每隔幾天采血測效價I次，免疫次數(shù)不少于3次。
[0103]2)分離抗血清:血清效價達到最高時，用頸動脈放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分離出后，高速離心，取上清，-20 0C保存。
[0104](3)用飽和硫酸錢鹽析法進行初步純化
[0105]I)取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，4°C沉淀過夜。
[0106]2) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用2mL磷酸鹽緩沖液溶解，緩慢滴加ImL飽和硫酸銨溶液，4°C靜置Ih。
[0107]3) 10000G低溫離心lOmin，棄上清，將沉淀用ImL磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖液4°C透析過夜。
[0108](4)用親和層析的方法進一步純化
[0109]I)用5倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱；
[0110]2)用5倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0111]3)將用飽和硫酸銨鹽析法初步純化過的樣品上樣；
[0112]4)用5倍柱床體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱；
[0113]5)用2倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測器檢測，收集蛋白峰即為抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗體；
[0114]6)用lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)調至pH值中性，用磷酸鹽緩沖液透析過夜。
[0115]其中，層析柱中用葡萄球菌A蛋白交聯(lián)的固相載體作為柱填料，洗脫緩沖液為檸檬酸緩沖液(pH 4.5)，偶聯(lián)緩沖液為0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。
[0116]實施例6抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗體的驗證
[0117](I) SDS-PAGE 電泳檢測
[0118]對實施例5制得的抗體Ab-3B進行SDS-PAGE電泳，得到的凝膠進行考馬斯亮藍染色。
[0119]實驗結果見附圖2，由圖中可看出，在25kD和50kD分子量區(qū)有清晰明顯的條帶，證明抗體純度高。
[0120](2)抗體效價測定
[0121]用間接ELISA法對實施例5制得的抗體Ab_3B抗體效價進行測定。所用酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，陰性對照為磷酸鹽緩沖液。檢測結果見附圖3，從結果可看出，該抗體效價大于1:1.28X 105，表明抗體效價高。
[0122]實施例7 ELISA競爭法體系的建立和驗證
[0123]以羧甲基化凝膠多糖作為包被抗原，抗體Ab_3B和HRP標記羊抗兔IgG抗體作為檢測抗體，建立了間接ELISA競爭法檢測體系。檢測方法如下:使用抗原包被的酶標板，分別依次加入50 μ L抗原標準品(或者處理后的血清)和50 μ L抗體Ab-3B，混勻后37°C孵育2h，PBST洗板3次，加入100 μ L HRP標記的羊抗兔IgG抗體，37°C孵育30min，PBST洗板3次，最后加TMB底物溶液顯色后終止，酶標儀讀取0D45Qnm。
[0124](I) ELISA競爭法體系的特異性驗證
[0125]含菌血清樣本的制備:分別稱量1mg滅活處理的菌體干粉(菌體包括煙曲霉菌、白色念珠菌、新型隱球菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌)，用健康人